为什么酵母od600电转化菌浓是od1.2

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-10-25 07:26 标签： 毕赤酵母转化
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几种酵母转化方法
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5个酵母电转化方案
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毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
菌体的准备：
挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜；
取100-500ul （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜 (约20h)，至OD600 达到1.3~1.5；
将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬
按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
按步骤3 离心，用160ul的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；
备注：可将其分装为80 ul 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。
? KM71比GS115生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的
? 对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入 Cu2+ 离子，提高表达量和蛋
菌种保存：
o挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80C
（一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下：
1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀
2)-20℃ 20分钟沉淀
3)13200rpm，20min，离心后弃上清
4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清
5)37 度至无乙醇气味（或是用的出风口吹出的暖风吹）。
6)20ul ddH2O重溶）
电击转化：
将5~20 u g 的线性化DNA 溶解在5~10 u l TE溶液中，与80 u l 的上述步骤6 所得的菌体混匀，转至0.2cm 冰预冷的电转化杯中；
将电转化杯冰浴5min；
10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；
11. 电击完毕后，马上加入1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml 的EP管中；（置于30度摇床低速培养1h，再涂板）
12. 将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600 u l 涂布一块平板；
13. 将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现 （3-4天）。
推荐：电压1.5kV ；电容25uF ；电阻200 Ω。电击时间为4 ～10msec。
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为什么要用OD600来测细菌/真菌浓度？
为什么要用OD600来测细菌/真菌浓度？而不在其他的吸光值下测量呢？有没有什么依据呢？
在哪个波段的话,那是根据不同的菌的在不同的波长是有最大吸收峰值 的吧~
最常用的是用大肠杆菌作为参考的。
10E10的OD600是1，我记得好像是这个样子的。
那这个这种菌的吸收的最大吸收波长是不是在一定的波长范围内都测其吸光值,然后找出其最大的吸收值的地方呢?
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酵母做电转时点转杯大小有关系吗
最近在做酵母电转化，实验室只有0.4mm点转杯，想问一下需要用多少感受态和线性化后的质粒呢？
我是想问 每个大小的杯子都有自己的容量吧&&电转的话是都要装满吗&&如果感受态和质粒不够的话&&需要用什么补齐吗&&山梨醇可以吗
一般我们不会装满，装200微升就够了。。。。没必要装满，至于质粒，一般体积控制在5微升和酵母混合。。。感受态细胞多少其实不太重要，多点也没关系。酵母很好转
如果我用0.4mm的电转杯的话，直接加100ul感受态和10ul质粒的话就可以直接转了吗？会不会太少啊？我要是用2kv-2.5kv的电压会有电火花的呢&&有影响吗？
不装满的话会有电火花的，对酵母和电转杯有影响吗？
电火花出现在杯口还是杯内？你的电转参数是如何设置的？你的DNA和感受太是如何制备的？
装100太少了，有电火花是因为你洗得不纯。。。适当增加感受态，话说干嘛用0.4的？买几个0.2的好了，反正可以重复用
不能装满，因为你电了下后要加入1毫升培养基的
我说的装满是两个银色电极之间 大约800ul&&不是装到杯口& &电火花是因为什么没洗干净啊？屋里只有0.4mm的 好像还有个0.1mm的 不知道能不能用呢还& && &老师嘛肯定是用现有的 不可能给买别的东西 唉
参数是2KV，200Ω，25uf，5s
dna是酶切三小时后用乙醇沉淀的
酵母感受态就是最普通的制备方法 OD600=1.0&&收集后水洗两次&&山梨醇洗一次 1ml山梨醇重悬 80ul每管分装的
你放电时间有5秒钟？而不是5ms？
如果放电时间确实是5s，那你出现电火花的原因不是由于酵母细胞和DNA预处理不干净使得离子浓度过大导致的短路放电。而是你加样过少导致的电极杯两端平行板根本没有连通导致的电阻过大，平行板两端长时间维持2000v左右的高电压直到电弧产生电荷转移。最简单的处理办法就是多加样，让电路连通，放电时间自然会回到正常范围内。
1. 4mm杯子容量比较大，至少在2ml以上，电场强度相对较低。LZ多加样的思路是对的，也不需要太多，400ul足以让电路连通，2Kv够用了，电击后1M山梨醇添加量1ml——2ml都可以。
2.&&1mm的杯子同样电压下提供的场强非常强，所以如果换用1mm的杯子，按照LZ你原来的80ul完全可以连通电路，电压在800v——1500v之间，其与参数维持不变。
好的 受教了 谢谢你的帮助& &
现在还有一个问题，就是酵母诱导表达的时候用BMGY长到OD600=2-6，收集菌体再用一定BMMY重悬使其OD600=1.从这时开始计算每24H添加一次甲醇是吧？刚换完培养基是不能加甲醇是是吗？
换培养基的时候就加上甲醇。
那我有个未诱导的对照应该用什么补齐呢？
还想就是用补齐甲醇的BMMY培养基来调PH值呢&&还是调好PH值后再按1%加甲醇呢？
我的意思是 如果我想用100%甲醇去诱导每次就加几毫升，而原来的用10X甘油的时候是加十倍的量& &对整体的体积和浓度会有影响吧&&还是把甲醇也配成10%每次加1%这样应该对培养基的浓度不会有影响了吧
BMMY里面的pH6.0的磷酸钾就是提供缓冲作用的，不需要额外调pH的。
甲醇母液浓度较低会让培养基体积升高，但是只要提前算好增加的体积以及与其相匹配的甲醇添加量，添加甲醇的终浓度一致就可以，对培养基影响并不是很大。
这次刚做的酵母诱导我是每个BMGY是单瓶配完，灭菌后再加上YNB，生物素和磷酸钾缓冲液和10X甘油的。换培养基时我灭的空瓶子和一整瓶的BMMY（未加后续的东西），灭完菌后加的YNB，生物素，磷酸钾缓冲液，每个样用差不多30ml调OD600=1左右，之后按30ml总体积加的100%的甲醇，第一天300ul，第二天290ul，第三天280ul，第四天270ul。每天取1ml，收集上清直接跑sds-page..
我是想问这样做能行吗？用100%的甲醇与之前的10x甘油相比对整体的体积会不会有影响？
换培养基的时候怎样比较简单点？
请问下你们做得酵母电转，转化效率高么，大概达到多少了？谢谢！
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