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细胞培养中常见的问题
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你可能喜欢细胞刮刮不好，胰酶消化怎么样 - 实验交流 - 生物秀
标题: 细胞刮刮不好，胰酶消化怎么样
摘要: [细胞刮刮不好，胰酶消化怎么样] 我刮细胞时由于细胞很少，刮下的细胞往往成团，离心离下来，好几次什么都看不到，费了很多事。而胰酶比较彻底，但是western时蛋白是否受到影响。谁有这方面的参考资料？空口无凭的。 关键词:[酶消化 样细胞]……
我刮细胞时由于细胞很少，刮下的细胞往往成团，离心离下来，好几次什么都看不到，费了很多事。而胰酶比较彻底，但是western时蛋白是否受到影响。谁有这方面的参考资料？空口无凭的。
胰蛋白酶是从动物胰脏分离的一种水解酶，其功能主要使细胞间的蛋白质水解、细胞分散。而通常我们消化常用的EDTA是一种化学螯合剂，主要作用在于能螯合钙、镁离子，使细胞分离，对细胞毒性小。至于western时，所用的消化液是否影响所检测的蛋白，这个通常来讲对膜蛋白可能影响较大，但具体到某种蛋白，需要有确切的文献依据。我们做western收获细胞通常是这样：处理后的细胞用冷PBS漂洗两遍，尽量吸干多余的PBS，直接向细胞表面加上裂解液（我们通常用含蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的RIPA裂解液），冰上放置20 min，其间晃动几次，使裂解均匀。然后将已裂解的细胞吹下，4度离心除去细胞碎片即可。后续该测浓度测浓度，或直接加loading buffer煮样品就行了。多多交流！
问题是细胞比较少，我也尝试了这个方法，每60mm皿（细胞没有满，30%-50%吧）加20ul裂解液，刮时根本盖不住细胞，但是随着刮子的移动，可以刮下来。最好移动到1.5ml ep管，离心后却能获得50ul左右的上清，PBS已经很净了，不知你们如何？就是担心蛋白浓度太低了，以前的样品都浪费了，好像降解也比较严重，以前很容易出结果，现在也不出了。我加了reche的cocktail和PMSF。所以样品室温放置时间不能太长。
我们一般每60mm皿加200 ul裂解液，吹下细胞并离心后会损失一些，但剩下的也够做几次，而且也测过总蛋白浓度，通常能达到 ug/ml。不明白细胞为什么只让长至30%-50%，是不是有什么特殊需要。也做过没加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的，按此操作，感觉蛋白降解并不明显。可能各目的蛋白差异吧。多多交流！
楼上是什么裂解液自己配置的还是买的啊？裂解后细胞沉淀多吗？我自己配的裂解液裂解后很多沉淀，买的没有沉淀，你的怎么样啊，我的看似好多呢。
我们用的是普利来的RIPA裂解液，配方为：50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS。裂解后应该算是有些沉淀吧，其实是细胞碎片，需要在4度，12000g离心除去。多多交流！
还有一个问题是，胰酶消化细胞可能导致细胞中信号通路(Signaling Pathway)发生改变，导致蛋白状态的改变，譬如磷酸化，最好还是细胞刮吧
只用EDTA，我的做法是用EDTA（具体浓度参考胰酶配方），1.5~2ml/10cm dish，作用几分钟后就可以吹下来转移到EP管中，如果细胞少，剩下一些还可以用细胞刮收集一下。
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电话：021-配制胰酶的d－hank‘s到底是哪个配方(胰酶,配制,葡萄糖,酚红) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 配制胰酶的d－hank‘s到底是哪个配方(胰酶,配制,葡萄糖,酚红)
摘要: [配制胰酶的d－hank‘s到底是哪个配方(胰酶,配制,葡萄糖,酚红)] 在不同的地方看到几种不同的配方于是糊涂了，不知道到底该用哪个好？研究了半天，其中有几样大家是一样的。例如:Nacl
0 4g LNa2HPO4
0 05g LKH2PO4
0 06g L可是这几样就各不相同了，有的里面有，有的里面没有，倒是这些是该加还 关键词:[胰酶 配制 葡萄糖 酚红 碳酸氢钠 各不相同]……
在不同的地方看到几种不同的配方于是糊涂了，不知道到底该用哪个好？研究了半天，其中有几样大家是一样的。例如:Nacl
0.4g/LNa2HPO4
0.05g/LKH2PO4
0.06g/L可是这几样就各不相同了，有的里面有，有的里面没有，倒是这些是该加还是不加呢？NaHCO3
0.35g/L葡萄糖
1g/L1％酚红
2ml/L我是用来配胰酶的，不知道碳酸氢钠、葡萄糖和酚红这些哪些要加哪些是不要加的？谢谢！
回复我们用的不加葡萄糖 和酚红，用的很好。也省了好多事，没有葡萄糖的可以直接高压。但我们在原代培养神经细胞时，是要加1g/L的葡萄糖的，去掉葡萄糖还没有试过。我们从来没有加过酚红，那只是起指示作用，如果能调好pH值就不用加了。NaHCO3还是要加的。回复推荐司徒镇强 D-hank"s的配方：（Page41）Nacl 8 g/LKcl 0.40 g/LNa2HPO4 0.06 g/LKH2PO4 0.06
g/LNaHCO3 0.35 酚红 0.02
g/L酚红可加可不加。只是作为酸度指示剂，溶液中性为桃红色，变酸时呈黄色，碱性为紫红色。常用胰的浓度为0.25%，PH值为7.2左右，配制时应用不含Ca2+、Mg2+、血清的液体，因为Ca2+、Mg2+、血清会降低胰的活力，影响消化效果。D-hank‘s是不含Ca2+、Mg2+的平衡液。至于加不加葡萄糖、酚红不是关键问题，NaHco3是要加的，有缓冲PH的作用。回复我看过我们这边几个实验室的protocal,统一出一个配方,对上面大家的意见略有补充:D-Hank"s液 :
Na2HPO4.12H2O
(如果你买的是Na2HPO4.H2O
则为0.06g)
0.02 g加双蒸水至1000 ml
PH至7.2~7.4高压灭菌,4度保存NaHCO3要加,葡萄糖加,酚红不是很重要,是指示剂,如果你的D_Hank"s只是为了配胰酶,作用于细胞就那么几分钟,我认为PH一些细微变化对作用影响不大,可以不加.我们的胰酶就没酚红.如果要配制Hank"s 液就再加 MgSO4.7H2O
0.14g回复我的D-hank"s的配方与红红的苹果一样但是胰酶的PH我调的是8，这样消化效果好！回复非常感谢大家！/bow我开始拿不准到底哪些要加，就把NaHCO3和葡萄糖都加了，没加酚红，而且我是把胰酶和都配进去了，然后抽滤。消化了一下BHK细胞，效果还可以，但是不知道这样配效果稳不稳定。大家配消化液的时候是只用0.25％的胰酶，或加一点也是分开配了加，还是象我这样全配在一起？
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电话：021-论细胞培养中胰蛋白酶的作用_生物试剂吧_百度贴吧
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论细胞培养中胰蛋白酶的作用
胰蛋白酶为蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏中所提取的一种丝氨酸达标水解酶。它不仅起到消化酶的作用，还能限制分解糜蛋白酶原、磷脂酶等其它酶的前体，起活化作用。在细胞培养中，胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的反应是不一样的，分散细胞的活性还要与其的浓度、温度和时间有关。在pH值8.0、温度为37℃的条件下是胰酶分散细胞的作用能力最强。胰蛋白酶的使用方法：1.吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。2.加入少量胰蛋白酶消化液，盖过细胞即可，室温放置1-2分钟。不同的细胞消化时间有所不同，对于贴壁牢固的细胞可适当延长消化时间。3.显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。此时吸除消化液。加入含血清的细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。4.如果发现消化不足，可加入胰蛋白酶消化液重新消化。5.如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。使用胰蛋白的注意事项：1.使用胰蛋白酶时应把握好浓度、温度和时间，以免因消化过度对细胞造成损伤。2.配置胰蛋白酶溶液时选用不含Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，以免降低胰酶的活性。3.之中消化时可选用含有血清培养液或以酶抑制剂来终止胰酶对细胞的最用。4. 不宜4℃长期保存，切忌反复冻融，小量使用时建议分装冻存；索莱宝生产的胰蛋白酶消化液(Trypsin Solution)含0.25%胰酶和含0.1%的胰酶，不含EDTA和酚红，溶于无钙镁平衡盐溶液中，经过滤除菌，可以直接用于培养细胞和组织的消化。本产品具有方便快速、稳定安全、细胞状态好等特点。通常室温消化2分钟左右就可以消化下大多数贴壁细胞， 在细胞培养中充分发挥胰蛋白酶的作用。
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保存至快速回贴关于胰酶消化步骤(胰酶) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 关于胰酶消化步骤(胰酶)
摘要: [关于胰酶消化步骤(胰酶)] 请问 这样用胰酶消化细胞比较规范 关键词:[胰酶]……
请问 这样用胰酶消化细胞比较规范
回复这样是那样？1般我们是，倒干净培养液，加5毫升缓冲液轻涮1下，倒去缓冲液，加胰酶（不含EDTA的可直接加培养液，含EDTA的稍早倒去胰酶，静止2，3分钟加培养液）。回复倒掉培养液，加入胰酶，铺满瓶底就好了，不要太多。静止3分钟左右，要快点的话也可以放入培养箱中孵一会，细胞漂起来后，去胰酶。加入含血清的完全培养基吹打回复胰酶消化细胞比较规范的步骤：1、吸去培养基2、用缓冲液（不含钙镁离子）洗一遍3、加入适当量的胰酶在37度消化3~5min4、将胰酶和细胞的混合液移到15ml1000rpm离心5min，去上清液5、用新鲜的培养基轻微吹匀细胞，传到新的dish中回复补充一点，消化时间不能太长，看到有细胞从瓶壁脱落就可以停止消化了。一般一分半钟就可以了，消化完加入适量培养基，用滴管把细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，吹打同时也有助于细胞的分散。然后转移到中，600rpm，3min足够把细胞收集起来回复1 将培养液倒干净2 我的习惯是加一些PBS轻轻冲洗细胞，后加入胰酶，不需要太多，只要铺满瓶底就可以3 在台子里对着光看到有裂纹就可以加入PBS中和胰酶4 用滴管吹打，将瓶壁细胞吹下来，贴壁紧的就多吹打几下5 将细胞悬液加入离心管内，800转/分，5min6 倒掉上清液，滴加约2ml培养液，吹打均7 将细胞悬液根据实验要求加入细胞瓶中，盖好盖子，标记号，放进孵育箱回复离心不好吧，国外都是直接弃培养液，拍打然后加培养基回复直接弃培养液吗？细胞和培养液是怎么分离的啊？回复1、弃上清液，用PBS洗两遍，弃去PBS。2、25ml小瓶的话加1ml消化液，75ml加3~4ml就够了，晃一晃使消化液均匀的覆盖瓶底3、放入37度培养箱，如果是很好消化的就不用放培养箱里，我之前的单核细胞贴壁很牢，我放培养箱里4min左右就ok了4、取出后拍拍瓶底，用吸管再吹打几下，吸出离心就好了回复1、倒去培养基2、胰酶漂洗，倒尽3、加入适当量的胰酶进行消化4、消化完毕将胰酶和细胞的混合液移到15ml离心管1000rpm离心5min，去上清液5、用新鲜的培养基轻微吹匀细胞，传到新的培养瓶中回复倒掉培养液，加入胰酶，铺满瓶底就好了，不要太多。静止3分钟左右，要快点的话也可以放入培养箱中孵一会，细胞漂起来后，去胰酶。加入含的完全培养基吹打这位同学的就不要照着做了。不能消化至漂起来，只要显微镜下看到细胞变圆就可以了，如果都漂起来的话，可能就消化过度而且在弃掉胰酶时细胞全都会随胰酶丢失。一般方法（适用于绝大部分贴壁细胞），以T25cm2为例：1、弃掉原培养基2、加入PBS（如果是原代细胞最好加Hanks液）洗涤3遍3、加入1ml胰酶消化，至细胞变圆4、加入含培养基（3－5ml均可以）终止胰酶消化5、吹打成细胞悬液6、将悬液接种至传代的容器中或者弃掉（比例可自行调整）补充说明：消化时间，受室温和细胞贴壁性影响很大。你需要根据你的细胞进行摸索，最先开始消化的时候一定要在显微镜下连续观察，避免消化过度，有的细胞可能1分钟就可以了，有的则需要10分钟。自己看情况掌握吧。以后养的时间长了就明白其中道理了。祝试验顺利！回复如果要离心不是就是做细胞传代了吗？？如果紧紧是为了让细胞脱壁我们都是先出去培养液 然后用2mlpbs冲洗两遍 再加等量的pbs和胰酶 然后放入5%co2 37℃的培养箱培养一会 大约1分钟 但是不是绝对的得去显微镜下观察细胞的脱壁情况才能定消化的时间 但是不能很久 因为胰酶对细胞的损伤很大的
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