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[求助]划痕实验和transwell检测细胞迁移结果不一致
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最近在做细胞迁移的检测，分别用划痕实验和transwell法进行检测，但所得结果截然相反，请教各位老师，我该信哪一个结果？
我的操作步骤大概如下：
1，铺细胞至6孔板，张满后，划痕
2，更换培养基为无血清培养基
3，每12h观察一次
4，结果为加入处理因素的细胞迁移速率增加（独立实验2个重复）
transwell（8um）：
1，重悬10e5个细胞至无血清培养基，加入transwell（密理博产品）
2，底部加入含10%FBS的培养基
3，培养8h，及15h后，结晶紫染色
3，结果为加入处理因素的细胞迁移速率降低（每个时间点有三个重复）
请各位老师多多指教，先行谢过！查看完整版本请点击这里：
hold住 ( 13:30:06)
因为我用的细胞不是肿瘤细胞，怕时间短，迁移不够。我再缩短时间试试.
我看了下室，没有细胞漏到下室。
另请教，下室的培养基是否也可以用无血清培养基？
因为我的处理因素,MTT实验显示是抑制细胞增殖的。
非常感谢！
abc816 ( 13:30:26)
你下室如果也换成无血清培养基那细胞的迁移动力是什么？呵呵，血清梯度应该算是迁移实验的基础之一吧……
ps：我用的也不是肿瘤细胞系，你预实验可以多设几个时间点观察一下
hold住 ( 13:31:56)
可是，8um的transwell可以允许血清的通过，1h内上下室就已经没有血清梯度了啊
不知道我的理解对不对？
abc816 ( 13:33:10)
可是，8um的transwell可以允许血清的通过，1h内上下室就已经没有血清梯度了啊
不知道我的理解对不对？
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最小的0.4um的膜大分子照样能通过，呵呵，造成梯度的原因正是因为有这些分子可以自由穿过的小孔，血清成分可以从下室穿过小孔扩散入上室，当然，这个扩散有个过程，在这个过程中小孔附近的细胞会感知到这个营养成分的流动,从而逆着扩散方向向营养成分更高的环境迁移,打个不恰当的比方。这个过程有点儿像飞蛾扑火……。
至于上下室完全平衡的时间我没做过具体实验，但几个小时以内肯定差不多了，所以实验时间过长没有任何意义而且细胞还容易掉进下室。
以下是我的理解，仅供参考。原来我也很困惑，后来和corning的人交流过一次，他们也大致是这个意思吧。
hold住 ( 13:33:40)
今天又做了 分别选择2h 4h和6h 3个时间点，细胞量5*10e5
2h时，处理组与对照组转移过去的细胞均很少
4h时，两个组均有少量细胞转移过去，但对照组明显多于处理组，大概在2-3倍左右。
6h时，还在等结果。。。。
但结合之前transwell的结果，基本可以确定transwell实验显示，处理组的细胞迁移能力下降。
如何解释这样一对截然相反的结果？
hold住 ( 13:34:10)
第6个小时的结果已出，很明显，对照组比处理组的细胞迁移数目大大增加。
图会稍后贴上。
请高手解惑。
fqswdzd ( 13:34:32)
wound healing experiment could be the result of cell proliferation.
hold住 ( 13:35:22)
谢谢您的答复
可划痕过程中我用的是无血清培养基，其次细胞增殖的结果是与划痕的结果也是相反的，即药物处理导致细胞增殖下降，而划痕细胞迁移增强。
请多多指教
TAT ( 13:35:43)
我最近也在做transwell，不过做的是抗侵袭，我是铺胶的。我想问问楼主，观察时整个小室的迁移细胞是否均匀？如果不均匀，那么计数的结果可以差别很大，我的实验有一次就不均匀，结果给药组（抗侵袭）看上去侵袭细胞要比空白组多得多，于是我用33%将结晶紫脱色，测OD，发现还是空白组吸收度高，给药组少。
希望楼主来反馈结果，我很想知道后来怎么样了。因为下一步我也要做抗迁移了。
101010 ( 13:36:00)
各位前辈好：我也正准备做细胞侵袭实验，需要用到什么仪器呢，迁移率是怎样计算呢
小鱼鱼 ( 13:36:29)
各位前辈好，我最近在用transwell做迁移和侵袭试验，发现侵袭试验有细胞穿出，但是迁移试验没有细胞，这是怎么原因呢？我观察的时间都是18h，两个实验处理都是一样的。请各位指教。
xevin ( 13:39:39)
各位前辈好，我最近在用transwell做迁移和侵袭试验，发现侵袭试验有细胞穿出，但是迁移试验没有细胞，这是怎么原因呢？我观察的时间都是18h，两个实验处理都是一样的。请各位指教。
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时间太长？细胞都已迁移过去了
redbutterfly ( 13:40:07)
刚看了，24孔板里没有细胞，干净的很。我现在怀疑是不是血清很快就弥散进入上室，导致没有趋化作用了，不知道大家一般迁移实验多久收细胞呢？
ALALA ( 13:40:45)
以下这段话是我从别人的回帖中看到的，我认为很好，送给你：
“我个人认为选择scratch assay 或者是 transwell assay 是根据所研究的细胞系的特点来决定的。
上皮细胞，癌细胞，角质细胞，在生理状态下，形成单层或者复层上皮，当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，scratch assay 很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。
neutrophil, monocyte/macrophage, mesenchymal stem cell, 这类细胞在生理状态下并不形成monolayer, 病理状态下的细胞迁移是在细胞因子或趋化因子的影响下在基质中纵向运动，transwell assay 模拟了这种运动形式，是适合的模型。
在伤口弥合中，fibroblast的向创口处迁移就是典型的侧向爬行。但是其实癌细胞的迁移倒不是侧向爬行那么简单，我觉得应该是综合效应，而且要看是什么类型的肿瘤。因为对于远端病灶的转移，显然是通过血液运输的。这是一个细胞去黏附和再黏附的过程。其实transwell也不能很好的模仿这个过程。只是transwell+matrigel可以模仿肿瘤细胞融解基质，侵入到正常组织的这个过程。也就是侵袭。所以对于做cancer的来说，可能transwell会更好些。但我觉得并不能就简单否定scar assay。细胞的迁移作为细胞的一个正常生理活动，是表征细胞生理变化的一个重要指标。这点是很主要的意义”
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[求助]细胞侵袭实验到底怎么做？
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[求助]细胞侵袭实验到底怎么做？
我想知道如果想做细胞侵袭实验，
１需要用什么型号的ｔｒａｎｓｗｅｌｌ？
２包被用什么是FN还是胶原，还是其它的什么东西？
３加入的细胞数是多少？
４实验的时间和条件是什么？
５结果怎么统计？
希望有战友可以系统的回答一下，谢谢了。
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1:ｔｒａｎｓｗｅｌｌ分厂家,一般用COSTAR的,就那一种型号.大约375一块,24孔,但只有12个有小室.
2:侵袭实验最好用MAGEL胶,你搜一下就可以找到.大约1000元
3:细胞数根据细胞的不同差别很大,我一般是10的5次方数量级
4:试验的时间跟条件与细胞和你的药物作用时间有关
5:随机选取5个视野计数就可以了!
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回复 #2 乌贼老弟 的帖子
先谢谢楼上，还有一些细节问题
１　你指的ＭＡＧＥＬ是不是ＢＤ公司的Matregel，如果用这个包被的话，每空用多少量，具体的方法是什么。
２。实验的时间一般是干预过后加入到Transwell板中后，大概加入Transwell中多长时间可以计数看结果（期间是不是放在培养箱就可以了）？
3.　实验结果是不是就是计数下槽的细胞数就代表穿过的细胞数，也就代表细胞的侵袭能力？
问题比较多，不好意思。
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1 包被基底膜：50mg/L Matrigel 1:8 稀释液包被Transwell小室底部，4℃风干。
2 水化基底膜.....
3 接种细胞 .....
4 常规培养（培养箱）24－48小时（依干预情况和癌细胞侵袭能力而定）
5 固定及染色：取出Transwell 小室，PBS 淋洗，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，95％乙醇固定，4g/L 台盼蓝溶液染色。
6 镜检：在倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞。每个样本计数5－10个视野。
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回复 #4 woshituzhu 的帖子
谢谢楼上的详细回答。
1。楼上的意思是先将matrigel以1:8稀释，是不是用DMEM原液或者1640原液稀释？　还有八倍稀释是不是太稀了啊。
２。楼上指的染色是指染色贴壁在底部的迁移细胞吗？如果是悬浮细胞是不是就是把下槽全部吸出来，然后细胞计数就可以了？
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回复 #5 白白的 的帖子
1 八倍稀释应该可以，不过具体还是要自己摸索。
2 我没做过悬浮细胞。我想应该是这样的吧。仅供参考。
祝试验顺利！
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请问楼上两个问题
1、包被基底膜：如何进行包被？就是用吸管低在小室上面吗？怎样才能够铺的均匀呢？我看有的文献上说小室上腔面铺Matrigel，下面铺Fn，有这个必要?
2、关于Matrigel的浓度和量各文献上报道的也不一样，到底是多少比较合适？听说小室是一次性使用的，尽量要一次成功啊，我老板很抠门的！所以请大家多提宝贵意见
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另外，选用哪种细胞做侵袭实验比较好啊？
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是啊，好像没有必要两面都包被吧，有没有人回答一下啊，我主要做内皮细胞的迁移实验，谢谢。
　　还有如果是8倍稀释的话应该很容易铺平的，但是如果太稀，包被的液体不是也会流到下槽去吗？
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使用8倍稀释的浓度还可以，用DMEM溶解。没那么容易流下去的。
我们第一次用PBS溶结果效果很不好，根本铺不开。
另外楼上的做迁移的话可以做划痕实验啊。关注今日：3 | 主题：480837
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即送15丁当
【求助】transwell和划痕实验过程……请教各位高手！！实在出不来结果，相当着急！！
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这个帖子发布于6年零131天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
transwell迁移实验过程(没有铺胶的)：1，上室是：加100微升不同浓度的含药，细胞悬液，细胞数50000个，无血清；下室是600微升含10%血清的培养基。2，培养箱中孵育8h；3，拿出小室擦去上室细胞，冰甲醇固定下室细胞，风干，0.1%结晶紫染色半小时，PBS洗3次，风干；4，镜下观察。划痕实验过程1，铺满六孔板细胞，贴壁；2，划痕，PBS洗一遍；3，换含不同药物浓度的无/有血清培养液继续培养；3，12h，24h后观察划痕距离。（如果大于24H，药物会影响细胞的生长，所以不能做大于24h的划痕实验，对否？）论坛中有好多好多迁移侵袭等细胞实验高手专家，麻烦各位指导帮助一下！！看我实验哪里有问题啊，就是做不出阳性结果来，每次结果都是实验组和对照组没有什么差别；而且没有阳性药物，也不知道自己的实验方法有无错误。即使是药物没有作用，也得给自己个证明啊。请大家帮帮忙，先谢过了！！
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请大家不吝指教呵，感激不尽！
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我也在做，现在遇到了这种情况。但是我的细胞是贴壁细胞，用药物处理后浓度高的实验组不在贴壁，不知道你的是什么样子的细胞。
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rainbow696865 我也在做，现在遇到了这种情况。但是我的细胞是贴壁细胞，用药物处理后浓度高的实验组不在贴壁，不知道你的是什么样子的细胞。我的也是贴壁细胞啊，加到小室里后就在那层膜上一层，没有看到过漂起的细胞，是不是你的药物浓度太高了，把细胞杀死了呢？我的浓度尽量设计在不影响细胞的生存。
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做个阳性对照，否则不能肯定是不是试验方法出问题了，也可能是药物本身就没作用，如果药物有报道是阳性的结果，也不能排除是不是买了假货?在当今时代的中国，一切皆有可能，就像生命科学本性一样。如果没有促迁移的药物，那抑制迁移的也可以用用的。
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erik 做个阳性对照，否则不能肯定是不是试验方法出问题了，也可能是药物本身就没作用，如果药物有报道是阳性的结果，也不能排除是不是买了假货?在当今时代的中国，一切皆有可能，就像生命科学本性一样。如果没有促迁移的药物，那抑制迁移的也可以用用的。好的，谢谢版主，提醒了我，我一直在找抗迁移的阳性药物，但是没找到，好像有促迁移的药，可以把它来作为阳性药物了，对啊。
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请教各位大侠，我做的迁移实验，因为没有加胶，通过膜的细胞好多好多，细胞有成团的，分布不均，中央和边缘区域细胞分布明显不同，给计数带来困难，这种情况下，是不是可以用结晶紫法测od值更客观准确呢？只是要确保结晶紫染色后要洗净染液，否则也会带来误差的，对吗？另加附图帮忙提议。
(4112.37k)
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另外请教大家，本迁移实验，因为做到24h药物才有点作用，只是细胞数目太多仍不易记数，后来我故意把加的细胞数减少到1完/室，是不是太少了呢？会不会因为细胞数比以前少了而相对的增加了药物作用效果呢？
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顶自己一下。。。。。。
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没人帮忙吗？？顶顶
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最近也在做这个两个实验，学习一下！
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楼主真是垃圾 大家千万别下载它的附件 我还想的帮他分析一下图呢 浪费我5个叮当不说 根本不是transwell和划痕的片子 是一个没用的幻灯 德行就这样还要做好实验啊 鄙视
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lium 楼主真是垃圾 大家千万别下载它的附件 我还想的帮他分析一下图呢 浪费我5个叮当不说 根本不是transwell和划痕的片子 是一个没用的幻灯 德行就这样还要做好实验啊 鄙视哪里的同学，首都的朋友吗，说话这么难听，我当时发这文件的时候还不流行叮当这一说好不好，注意口德！也许当时我也是刚来到丁香园，没有注意到叮当什么的说明，请谅解，不要说脏话。
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【求助】SiRNA干扰后如何进行划痕实验和Transwell实验
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这个帖子发布于2年零108天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位前辈，大家好，我最近在做SiRNA干扰肿瘤细胞一个基因的实验。我从sata公司订购了SiRNA、阴性对照SiRNA和引物，设置了空白对照组（lipo3000），阴性对照组（紊乱的序列RNA）和SiRNA干扰实验组。干扰后48小时收集细胞，提示在实验组中基因的表达下降了约70%。同时，观察到空白对照组的细胞无明显死亡，阴性对照组的细胞少量死亡（10%），但是实验组的细胞出现大量的死亡（50%）。请教各位前辈下一步的细胞功能实验如何进行？1.检测细胞增殖，细胞死亡这么多，还能用MTT的方法吗？如果不行选择哪种方法比较合适？2.检测细胞迁移实验，细胞死亡这么多，还能用划痕实验？如果可以，具体要如何调整呢？在划痕后进行干扰？还是把细胞消化好，再种板，长满后再划痕？3.SiRNA干扰的肿瘤细胞能否进行Transwell实验？4.SiRNA干扰的肿瘤细胞，消化后再种板会是否会影响到SiRNA对基因的干扰效果？
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各位前辈帮忙提提建议啊
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多好的问题怎么没人能帮忙了，也求经验
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1.可以，也可以用cck82.只要达到你需要的量就可以做3.可以。4.不会影响~
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意境 1.可以，也可以用cck82.只要达到你需要的量就可以做3.可以。4.不会影响~请问是先siRNA转染再把消化细胞接种到小室中，还是先接种再转染？
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ibug 各位前辈，大家好，我最近在做SiRNA干扰肿瘤细胞一个基因的实验。我从sata公司订购了SiRNA、阴性对照SiRNA和引物，设置了空白对照组（lipo3000），阴性对照组（紊乱的序列RNA）和SiRNA干扰实验组。干扰后48小时收集细胞，提示在实验组中基因的表达下降了约70%。同时，观察到空白对照组的细胞无明显死亡，阴性对照组的细胞少量死亡（10%），但是实验组的细胞出现大量的死亡（50%）。请教各位前辈下一步的细胞功能实验如何进行？1.检测细胞增殖，细胞死亡这么多，还能用MTT的方法吗？如果不行选择哪种方法比较合适？2.检测细胞迁移实验，细胞死亡这么多，还能用划痕实验？如果可以，具体要如何调整呢？在划痕后进行干扰？还是把细胞消化好，再种板，长满后再划痕？3.SiRNA干扰的肿瘤细胞能否进行Transwell实验？4.SiRNA干扰的肿瘤细胞，消化后再种板会是否会影响到SiRNA对基因的干扰效果？你好，楼主，我也在做跟你一样的实验，请问你的问题解决了吗?望回复。非常感谢！
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请教楼主是否解决上面的问题，求赐教经验，十分感谢
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增殖：6孔板转染siRNA后，第二天消化计数种96孔板，加CCK-8测OD值 迁移：6孔板转染siRNA后，第二天消化计数种12孔板，划痕，拍照
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薛定谔的正太 增殖：6孔板转染siRNA后，第二天消化计数种96孔板，加CCK-8测OD值迁移：6孔板转染siRNA后，第二天消化计数种12孔板，划痕，拍照现在面临同样的问题，这样做的前提是转染成功吗？可是怎么检测是否成功呢？才可以种板进行实验呢？急等回答！
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ibug 各位前辈，大家好，我最近在做SiRNA干扰肿瘤细胞一个基因的实验。我从sata公司订购了SiRNA、阴性对照SiRNA和引物，设置了空白对照组（lipo3000），阴性对照组（紊乱的序列RNA）和SiRNA干扰实验组。干扰后48小时收集细胞，提示在实验组中基因的表达下降了约70%。同时，观察到空白对照组的细胞无明显死亡，阴性对照组的细胞少量死亡（10%），但是实验组的细胞出现大量的死亡（50%）。请教各位前辈下一步的细胞功能实验如何进行？1.检测细胞增殖，细胞死亡这么多，还能用MTT的方法吗？如果不行选择哪种方法比较合适？2.检测细胞迁移实验，细胞死亡这么多，还能用划痕实验？如果可以，具体要如何调整呢？在划痕后进行干扰？还是把细胞消化好，再种板，长满后再划痕？3.SiRNA干扰的肿瘤细胞能否进行Transwell实验？4.SiRNA干扰的肿瘤细胞，消化后再种板会是否会影响到SiRNA对基因的干扰效果？不知楼主以上问题，解决了吗？我现在在做类似的工作，想知道楼主最后怎么解决的！尤其是TRANSWELL部分实验！
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自在的天堂 薛定谔的正太 增殖：6孔板转染siRNA后，第二天消化计数种96孔板，加CCK-8测OD值迁移：6孔板转染siRNA后，第二天消化计数种12孔板，划痕，拍照现在面临同样的问题，这样做的前提是转染成功吗？可是怎么检测是否成功呢？才可以种板进行实验呢？急等回答！同一批次细胞转siRNA，48小时后提RNA检测抑制效率~
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cheff0412 edited on
薛定谔的正太 增殖：6孔板转染siRNA后，第二天消化计数种96孔板，加CCK-8测OD值 迁移：6孔板转染siRNA后，第二天消化计数种12孔板，划痕，拍照请问直接用SiRNA 干扰细胞之后，培养48小时，然后直接在板内做划痕实验可行吗
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48小时能长满就可以，就怕48小时不能长到划痕需要的密度
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轻轻的我走了，正如我轻轻的来。我挥一挥衣袖，不带走一片云彩。
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