MCF-7人乳腺癌细胞系
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中国普外基础与临床杂志!$J&&*年)月第&$卷第!期!5:&7EF,G.G56&70.7.1,68H1B6(&$$KB(!$?,19:!&&*I-&#’-
!文章编号&!#$&&#$%&’&’&&#&’$&!=%$&&
基础与实验研究
三氧化二砷诱导乳腺癌细胞系
?5DT*凋亡的实验研究
曲志博&!刘连新&!陈!炜&!郭化鑫&!杨海彦&!潘尚哈&
!摘要&作用不同时间后对乳腺癌细胞系?5RGDT*的影响及其作!目的!观察不同浓度的三氧化二砷!!/)&用机理#方法!应用不同浓度的R观察RGG!/)作用于乳腺癌细胞后$!/)对乳腺癌细胞生长状态的影响%用四甲基偶氮唑蓝!比色法观察其对?5?OO&DT*细胞增殖的影响%应用琼脂糖凝胶电泳和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法!检测ROCK^+&G5DT*细胞凋亡的诱导作用#结果!不同浓度的RG!/)对?!/)作用于乳腺癌细胞有明显的时间和剂量依赖性$并出现明显的凋亡特征性改变!细胞RG!/)作用后细胞生长明显受抑制$膜完整&染色质固缩&核碎裂&凋亡小体形成&%经&&’琼脂糖凝胶电!&$及%1;B6+$个剂量的RG%:后$!/)处理$泳检测到细胞发生凋亡时U’KR降解形成梯形分子条带%$1;B6+RG$&$%及*!:后OCK^+法可检测!/)作用!到细胞凋亡水平显著性升高#结论!R其机理主要是诱导乳腺癌细胞凋亡#G!/)可明显抑制乳腺癌细胞的生长$
!关键词&!!乳腺癌细胞!!细胞凋亡!!三氧化二砷!中图分类号&;文献标识码&@#(#&%!!!!
@&.E,$,P+80B+./12N/DO.@4/4-0-0.I8+1-/:1.C+8:+2260.+H:VK#A.ODC+OR8-+.0C)804P0O+!:1’F@&%&.;&&$#&$7%.;&&$%&.%&$@%&.@%A/#%C$D#&$,#&#C%&G7C#CK@#8&CJ$4T(9*V+10(=)*+(!)*GF-B3+-F$(,J&$%&,%CE&&L#M&?%&1&&N#CJ&$%CE&&PZQQQP$T@&&%B3(F$(
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()T+48O-1.,G=9,79.19.66.66,B=BG&G1G.7&9=1&Ba&2.!!F!!5!!RWWFU(&V4D.O1/04.0/+B)K,=&B7,6K,=H1,689&.79.DBH72,=&B7BA5:&7,!KB()&)&&))’
$在临RG!!砒霜的主要成分是三氧化二砷!!/)&
床上用于急性早幼粒细胞白血病!的治疗效果RN+&
&$!+显著#据报道*$该药对RN+初治患者有效率高达’并且毒&副作用较低#乳腺癌是女性常见&!$
恶性肿瘤之一$寻找有效的乳腺癌化疗药物具有重要的临床意义#本研究旨在观察RG!/)对人乳腺
癌细胞株?5并初步探讨其作用机DT*生长的影响$理$为乳腺癌的临床治疗提供新的理论和实验依据#
基金项目&’国家自然科学基金资助!编号,&)&)&&))’!!
作者单位&&哈尔滨医科大学第一临床医学院普通外科!哈尔滨!!
&%通讯作者,刘连新$,&#&&&&^T;,&66&H6&,7a&70;.2;,&6(9B;(97作者简介&曲志博!$男$黑龙江省哈尔滨市人$硕士研&’%&年&&!!
究生$主要从事普外科肿瘤的临床与实验研究#
!!材料与方法
!&!!主要材料
乳腺癌细胞系?5DT*购自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所#UKR提取试剂盒&
)&4&)中国普外基础与临床杂志!%J&&*年)月第&$卷第!期!5:&7EF,G.G56&70.7.1,68H1B6(&$%KB(!%?,19:!&&
OCK^+检测试剂盒购自博士德公司!SN?YT&4$&培养基&小牛血清&琼脂糖&?OO&RG!/)均购自N?YT&4$&配制成&&8&;,公司#RGI!/)应用S
$于$f保存%备用#;;B6+的储备液%!&’!方法!&’&!!细胞培养!?5DT*细胞在#!5/!孵箱中培养%培养基为含&%&!灭活小牛血清的SN?YT&4$&含&青霉素和链霉素’#细胞为上皮样细胞%!双抗&每取对数生长期细胞用于实验#)$2传代&次%!
&&&&$!&’&’!药物诱导!观察&(#&!$%及&41;B6+蛋白酶Q处理细胞%)*f湿盒2CON标记!:%
过氧化物酶结合%8RF5链酶亲和素TURF显色#未加RG!/)组作阴性对照用#染色后细胞核呈棕黄色的细胞被判为凋亡细胞%并通过细胞计数板计数’#&&&&个细胞中的凋亡细胞数作为凋亡指数&RY
凋亡细胞数RYM总细胞数d&&&!
个细胞接种于!&’&&!细胞形态学观察!将!d&&
每一浓度设)个复孔%在倒置显微镜下!$孔板上%
观察不同浓度的RG/作用不同时间后乳腺癌细
个浓度梯度的RG!/)作用不同时间&
!$&$%&*!&’4及!&:
’后对乳腺癌细胞的影响%以未加药物组作为阴性对照%并设定一组加用稀释剂NF8作为空白对照组#&’&(!细胞生长抑制实验!采用?OO比色法#取对数生长期的乳腺癌?5DT*细胞%用&(!#!胰酶消化%NF8液洗涤&次%用SN?YT&4$&培养液调细胞数
$;6%每孔&(&;6%)*f&#!5/!孵育箱中
培养!$:后%待细胞至4&!融合&
且贴壁良好时分别加入用SN?YT&4$&培养液稀释的RG!/)%终浓度分别为&(#&&&!&$&%及&41;B6$+%
每个浓度设4个复孔%并设定一组加用稀释剂NF8为空白对照组#分别培养!$&$%&*!&’4及&!&:后加入#!?OO溶液
&16$孔%继续培养$:%弃上清%每孔加入U?8/溶液&#&16%)*f&#!5/!孵育箱继续培养&
!:后%酶标仪上测定#*&7;波长的吸光度&)’值#本实验重复)次#按下式计算细胞生长抑制率(
细胞生长抑制率M&&&
&&&!&’&&!UKR梯状电泳!将生长至对数生长期的乳腺癌?5DT*细胞&至少&d&&4
个’%用空白对照和&&!&$及%1;B6$+的RG!/)连续培养$
%:%细胞常规消化后%应用NF8洗涤!遍%离心&离心速度为&#&&1$;&7%1M%9;%时间#;&7’后沉淀%按照小量UKR提取试剂盒步骤提取UKR%于&!的琼脂糖凝胶中以)&!$&J电压电泳%观察UKR
,22.1图像#&’&=!原位细胞凋亡检测!通过原位细胞凋亡检测试剂盒检测乳腺癌细胞凋亡#细胞爬片%加含1;B6$+的RG!/)与细胞共育!$&$%及*!:#每个时间组均设NF8对照孔%
药物作用后的细胞制成活细胞悬液%浓度为&d&&
$;6%取’#16的细胞悬液加入#16的储备液混匀%
吸&滴混合液点于洁净玻片上%荧光显微镜观察并摄片#之后用$!多聚甲醛固定&:&新鲜配制)!过氧化氢溶液及预冷的
!)胞的形态学改变%并观察细胞的凋亡过程#!&(!统计学处理
实验结果采用8N88&&(&软件分析%比较分析采用单因素方差分析%行&检验%检验水准.M&(&#
’&!!@-’S(对细胞生长的抑制作用
不同剂量RG!/)处理?5DT*细胞不同时相后%各组细胞的增殖受到不同程度的抑制&图&’%并随着时间的延长%各浓度RG!/)处理组细胞与对照组相应时间点细胞相比%)值逐渐降低%差异均有统计学意义&!均$&(&#’!各浓度RG!/)处理组之间相应时相比较%差异亦均有统计学意义&!均$&(&#’#通过?OO比色实验得出%RG!/)对?
5DT*细胞!$:的#&!有效浓度&Y5#&’为%1;B6$+%$%:的Y5#&在!!$1;B6$+之间%而*!:的Y5#&在&
!!1;B6$+之间#提示%RG!/)对?5DT*细胞的增殖有抑制作用%并且随着时间的延长和剂量的增加%抑制率逐渐上升%增殖抑制效果增强%呈时间T
剂量效应关系#图!!?OO法检测不同浓度RG!/)作用?5DT*不同时间后的)值曲线V0G
&!!O:.,[GB1W=&B7A,9=B1T=&;.9H1V.G:B\&7I=:..AA.9=GBAV,1&TBHG9B79.7=1,=&B7GBARG!/)B
7=:.I1B\=:BA?5DT*9.66G’&’!LW@琼脂糖凝胶电泳结果
结果见图!#从图!可见%用&&!&$及%1;B6$+的RG!/)培养?
5DT*细胞$%:后%均出现梯形分4&!!!6!$
中国普外基础与临床杂志!!J&&*年)月第&$卷第!期!5:&7EF,G.G56&70.7.1,68H1B6(&$!KB(!!?,19:!&&*I)&4&)
子条带!且以!和$1&;B6+剂量组梯形条带更为明显#提示RG5DT*细胞发生凋亡#!/)能诱导?
’&(!)^W,6检测结果
荧光显微镜观察可见标记后荧光显色的凋亡细胞&图)’#加入URF显色底物后在原位出现有色沉淀!从而观察到被着色的凋亡细胞!细胞核可见棕黄色颗粒&图$’#$1&$($%及;B6+RG!/)作用!
两两*!:后RY分别为&!(%!($%(4!及4#(#!!比较!差异有统计学意义&’#!$&(&#
’&&!细胞形态学观察结果
对照组细胞呈高折光率!胞体大!成梭形&图#’!随时间延长变化不大#&(&#!!1;B6+浓
变圆(折光度的R$:后细胞逐渐变小(G!/)作用!
图’!示U&KR琼脂糖凝胶电泳结果#?$UKR(&&2+%
&&&&&$&1;B6+%!$!1;B6+%)$$1;B6+%$$%1;B6+
$&$&&(&&2&&1;B6+%!!1;B6+%V0&’KR6,22.1(?$UKR+%!UG
&&)$$1;B6+%$$%1;B6+
率减弱!但细胞膜完整&图4’!最后裂解%$!&4&;B6+浓度的RG%:后见细胞形态改变!/)作用$1
加速!并出现大量的凋亡细胞&图*’#
图(!示$1&吖啶橙染色!d!’!!图&!示$1&;B6+RG$:后!可见标记后荧光显色的凋亡细胞&&&;B6+RG$:后!!/)作用!!/)作用!
可见被着色的凋亡细胞!细胞核内可见棕黄色颗粒&’胞体大&倒置显微镜!d&’OCK^+染色!d!&&&&!!图=!示对照组细胞高折光率!图&!示&1&变圆!折光率减弱!但胞膜完整&倒置显微镜!d&’&;B6+RG%:后少量细胞逐渐变小(&&;B6+RG!!图#!示%1!/)作用$!/)作用’变圆!折光率差!出现大量凋亡细胞&倒置显微镜!d&’4:后大量细胞变小!&&&$’&V0&(!!$:,A=.1$1;B6+RG1.,=;.7==:.A6HB1.G9.79.T9B6B1,=.2,B=BG&G9.66G&R/!d!&&0&&!!$:,A=.1$1;B6+RG!!VWW!/)=!/)GG
’$$OCK^+!d!&&0&=!5B7=1B61BH.66G=1.,=;.7==:.W&;.7=.2,B=BG&G9.66G\&=:G.9&A&9[1B\7T.66B\I1,7H6.G&7=:.-,1B7&!!VIW9IWWW33G
’&$:&:1.A1,9=&V.&72.a,72[&.19.66[B2Y7V.1=.2;&91BG9B.&&0&&!$%:,A=.1&1;B6+RG1.,=;.7=G;,66,;BH7=GBA!d&!!VIII3&W!/)=G!9.66G[.9,;.G;,66.1,72=:.G:,.=H17.21BH72(O:.1.A1,9=&V.&72.a[.9,;.\.,-.1[H==:.9.66;.;[1,7.G\.1.&7=.1&=Y7V.1=.2;&91BTWI3&$’&1.,=;.7=,I1.,=;,7A9.66G[.9,;.;H9:G;,66.1,721BH72(O:.1.A1,9=&V.&72.aG9B.&&0&#!’4:,A=.1%1;B6+RG!d&!!V3BW!/)=G’\,GWBB1,72=:.1.\.1.,6B=BA,B=BG&G9.66G&Y7V.1=.2;&91BG9B.&&!d&WWW
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RG!&世!/)是中国传统医药砒霜的主要成分!纪*针对R&年代以来!N+的治疗取得了显著性效果&近年来!人们将RG!/)研究的重点转移到各种
)!$$实体瘤的治疗上!并取得了一定的疗效#&F,_#$等#报道!砷剂对乳腺癌细胞株有诱导凋亡的作用&
乳腺癌细胞系作用时间的延长和药物浓度的增加!
进一步证明了R?5DT*凋亡指数逐步增高!G!/)诱
导乳腺癌细胞系?5DT*凋亡的作用&随着对RG!/)抗癌机理的不断深入研究以及
毒副作用的减少!用药安全性的提高&RG!/)必将为乳腺癌的治疗打开新的思路!带来新的希望&
参!考!文!献
&!张!鹏!王树叶!胡龙虎!等(三氧化二砷注射液治疗*!例急
$’(性早幼粒细胞白血病#E(中华血液学杂志!&’’4%&*!]#%!!倪建华!陈国强!沈志祥!等(静脉滴注三氧化二砷治疗急性早
幼粒细胞白血病的药代动力学分析#$E(中华血液学杂志!’(&’’*%&%#]!#&
)!刘连新!朱安龙!陈!炜!等(三氧化二砷对原发性肝癌的作用
及其机理研究#$’(E(中华外科杂志!!&&#%$)&]))
$!8:,BX8!‘.c‘!+&7X!#$%&(5.66996.,11.G=,72,B=B=&9Ic3WW
9.662.,=:&79H6=H1.2:H;,7I,G=1&99,19&7B;,9.66G;.2&,=.2[3$!’(,1G.7&9=1&Ba&2.#E(PB162E0,G=1B.7=.1B6!&&#%&&!!])$#&#!F,17H6ABR!U.,6&B8!#$%&(R1G.7&9=1&Ba&2.,72[1.,G=_0!RI
)!29,79.1,7,6G&GBA=:.,B=B=&9&AA.1.7=&,=&V.,72&;;H7BT3WW$!%’(;B2H6,=B1AA.9=G#E(F1.,G=5,79.1S.GO1.,=!&&!*)&]4&3.4!刘连新!朱安龙!姜洪池!等(三氧化二砷对肝癌细胞系F^+T
$’(*$&!的影响#E(中国普外基础与临床杂志!!&&&%%$]!&’
’!&&4T&!T&%收稿!!&&4T&%T&!修回(
’本文编辑蒲素清(
本实验体外观察了不同浓度的RG!/)对乳腺癌
发现不同浓度R?5DT*细胞的生物学作用!G!/)均不同程度地抑制?5且具有剂量和DT*细胞的增殖!
时间效应关系%倒置显微镜下可见细胞的凋亡改变%并通过?OO法检测RG!/)对乳腺癌细胞系
发现其抑制作用具有?5DT*的体外生长抑制作用!明显的剂量和时间相关性!随着剂量的增加&时间的延长!抑制作用增强!进一步证实了RG!/)的体外
关于RG!/)治疗肿瘤的机理一直也是人们不断探索的问题!大量的研究
表明!诱导细胞凋亡
是RGKR琼!/)抑瘤作用的主要机理&本研究中U脂糖凝胶电泳结果充分肯定了RG!/)具有诱导
且呈明显的剂量效?5DT*细胞发生凋亡的作用!T应关系&OCK^+检测可见核呈棕黄色的凋亡细胞呈小片或散在分布!细胞核碎裂&大小不一!并随着
*************************************************
中国普外基础与临床杂志&征订启事’&&#年!
中国普外基础与临床杂志+是由中华人民共和国教育部主管&四川大学华西医院主办的专业性学术期刊&其办刊宗旨!!*
是)面向临床!突出基础研究与临床应用相结合!理论与实践并重!提高与普及兼顾!为提高广大普外专业医生对疾病的诊治水平而服务&主要刊登普外专业和相关学科的临床成果!以及与临床联系紧密的基础研究&实验研究成果与进展&主要设有基础与实验研究&临床研究&临床经验交流&新术式及新技术介绍&论著摘要&腹部影像&讲座&继续教育问答&综述等栏目!并且根据普外专业特点每期就某一热点问题开设述评&专家论坛等栏目进行重点讨论&以从事普外专业的临床&科研&教学的高&中级人员&研究生!以及相关专业的医药卫生工作者为主要读者对象&本刊为国家科学技术部中国科技论文统计源期刊’中国科技核心期刊(&*中国科技引文数据库+及*中国学术期刊综合评价数据库+来源期刊!并被俄罗斯文摘’(&美国化学文摘RE’以及国内5?F&中国医学文摘外科学&*中国期刊网+&*中国学术期刊’光盘版(+&*万方数据,,,数字化期刊群+5R(5?55&等收录&
本刊为双月刊!大&每单月!科研及教学人员以及4开!&&!!&!%页!#日正式出版&欢迎全国广大从事普外专业的临床&相关专业的医药卫生工作者到当地邮局订阅!如漏订者可直接汇款至本刊编辑部订阅&国内邮发代号)国内每册定价4!&*!全年4邮政编码)电话)&&(&&元!&(&&元&编辑部地址)四川省成都市国学巷)*号四川大学华西医院!4&&&$&!&!%&传真)电子信箱)%#$!!&*!!&!%&%#$!)*!$!H\,&@,@:&4)(9B;&0&W
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大豆异黄酮与玉米赤霉烯酮对乳腺癌细胞系MCF
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【中文摘要】玉米赤霉烯酮(zearealenone,ZEA)是我国饲料中污染比较严重的一种霉菌毒素,具有雌激素活性,对动物的繁殖性能构成巨大的危害。大豆异黄酮(soybeanisoflavone,SIF)主要存在于豆科植物的荚豆类,以大豆中含量较高,也具有轻度雌激素作用,能够与动物雌激素受体结合,当体内雌激素水平较低时可以表现出雌激素活性而当异黄酮浓度较高时则表现为抗雌激素活性,具有双向调节平衡功能。富含大豆异黄酮的豆粕等大豆制品是重要的蛋白质补充饲料,而玉米赤霉烯酮在配合饲料中污染十分普遍,因此,ZEA与GEN在配合饲料中常常共存,存在着对动物的联合作用。本课题以雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞系MCF-7为研究对象,研究ZEA和GEN联合作用对MCF-7细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响,并揭示其作用的可能机制。将ZEA、GEN和E2用无水乙醇溶解,用无酚红DMEM(含5%CDT-FBS)培养液稀释到所需浓度。试验共分10个组,分别为:(1)溶剂对照组;(2)阳性对照组:8nmol/LE2;(3)处理1:10nmol/L ZEA;(4)处理2:20nmol/LZEA;(5)处理3:16μmol/LGEN;(6)处理4:32μmol/LGEN;(7)处理5:10nmol/LZEA+16μmol/LGEN;(8)处理6:10nmol/LZEA+32μmol/LGEN;(9)处理7:20nmol/LZEA+16μmol/LGEN;(10)处理8:20nmol/LZEA+32μmol/LGEN。通过流式细胞仪在448nm波长下进行细胞DNA含量和细胞周期分布百分比分析;MTT比色试验,观察各处理对细胞增殖的影响;采用RT-PCR和Western印迹法定量检测细胞周期蛋白E1(CyclinE1)、细胞周期蛋白激酶2(CDK2)、死亡抑制基因(bcl-2)与死亡诱发基因(bax)mRNA表达及蛋白质表达丰度,采用RT-PCR检测雌激素受体(estrogen receptor,ER)mRNA表达丰度,并通过Giemsa染色法检测细胞形态判定各处理对细胞凋亡的影响。试验结果:1.对细胞增殖的影响:同溶剂对照组相比,ZEA在较低浓度条件下(10nmol/L,72h)就能促进MCF-7细胞增殖(p＜0.05),32μmol/L GEN对MCF-7细胞处理24h可明显抑制MCF-7细胞增殖(p＜0.05)。同处理1、处理2相比,处理5、处理6、处理7、处理8中,16μmol/L、32μmol/L GEN可显著降低10nmol/L、20nmol/L ZEA处理24h、48h、72h引起的MCF-7细胞增殖(p＜0.05)。2.对细胞周期的影响:同溶剂对照组相比,处理3、处理4 S期细胞比例显著减少(p＜0.05),阳性对照组、处理1、处理2显著增加了MCF-7细胞S期的分布(p＜0.05)。同溶剂对照组相比,处理5、处N6、处理7、处理8中,16μmol/L、32μmol/L GEN可显著降低10nmol/L、20nmol/L ZEA引起的S期细胞比例增加(p＜0.05),同时显著的增加了G2/M期的细胞比例(p＜0.05)。3.对ERα、ERβmRNA表达影响:同溶剂对照组相比,阳性对照组,处理2显著的上调了MCF-7细胞ERα、ERβmRNA表达丰度(p＜0.05),处理4显著下调了MCF-7细胞ERα、ERβmRNA表达丰度(p＜0.05)。同处理1、处理2相比,处理5、处理6、处理7、处理8显著下调了MCF-7细胞ERα、ERβmRNA表达丰度(p＜0.05)。4.对bcl-2、bax mRNA及蛋白质表达影响:同溶剂对照组相比,阳性对照组和处理1、处理2均可明显上调bcl-2,下调bax的mRNA和蛋白质的表达(p＜0.05),但是,处理4、处理5却明显下调bcl-2,上调bax的mRNA和蛋白质的表达(p＜0.05)。同处理1、处理2相比,处理5、处理6、处理7、处理8显著下调了bcl-2,同时上调了bax mRNA和蛋白质的表达(p＜0.05)。5.对CDK2、CyclinE1 mRNA及蛋白质表达影响:同溶剂对照组相比,处理1、处理2可明显上调CDK2和CyclinE1 mRNA和蛋白质的表达(p＜0.05),但是,处理3、处理4明显下调CDK2和CyclinE1 mRNA和蛋白质的表达(p＜0.05)。同处理1、处理2相比,处理5、处理6、处理7、处理8显著下调了CDK2和CyclinE1 mRNA和蛋白质的表达(p＜0.05)。6.对细胞凋亡的影响:Giemsa染色显示溶剂对照组、处理3、处理4、处理5、处理6、处理7、处理8,能够抑制MCF-7细胞生长,促使其凋亡,而阳性对照组、处理1、处理2中MCF-7细胞则未见有深染的凋亡细胞。结论:1.16μmol/L、32μmol/L的GEN能够抑制10nmol/L、20nmol/L ZEA诱导的MCF-7细胞增殖。2.16μmol/L、32μmol/L的GEN能够下调MCF-7细胞bcl-2、CyclinE1以及CDK2mRNA及蛋白质表达,同时上调bax mRNA和蛋白质的表达。3.32μmol/L的GEN降低了10nmol/L、20nmol/L ZEA雌激素方面的活性,这种作用可能是通过下调ERα、ERβmRNA表达而实现的。
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