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FACS-Aria流式细胞分选调试参数和最佳条件的设定
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3秒自动关闭窗口BD帮助人类健康生活 - 流式细胞术在蛋白质-蛋白质相互作用中的应用
>>流式细胞术在蛋白质-蛋白质相互作用中的应用
流式细胞术在蛋白质-蛋白质相互作用中的应用
前言蛋白质-蛋白质相互作用是分子生物学研究领域的重要分枝。研究蛋白质-蛋白质相互作用，不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能，而且对于提示生长、发育、分化和凋亡等生命活动规律至关重要，为探讨重大疾病的机理、疾病治疗、疾病预防和新药开发等提供重要的理论基础。蛋白质-蛋白质相互作用的研究通常分为三个阶段，第一个阶段是发现与某个感兴趣的蛋白质相互作用的其他蛋白；第二个阶段是考察两个具有相互作用的蛋白质的相互作用方式与性质；第三个阶段是研究调节这两个蛋白质相互作用的机制。研究蛋白质相互作用的方法有很多，目前仍很难有一种方法能够完全满足蛋白质相互作用研究的全部三个阶段。例如，酵母双杂交技术、TAP亲和纯化质谱联用技术能够高效的发现与兴趣蛋白相互作用的其他蛋白，并对这种蛋白加以鉴定，非常适合第一阶段的研究；第二阶段中首先是对第一阶段发现的成果加以鉴定，然后通过基因手段对蛋白质相互作用的结构域进行研究，并获得蛋白质相互作用的动力学性质，这一阶段常用免疫共沉淀、GST-Pulldown、荧光能量共振转移及biacore等技术；第三阶段使用的技术与第二阶段基本类似，但在蛋白质相互作用环境中增添了新的因素，并着重于考察这些因素对蛋白质相互作用的调节机制。以上三个阶段所使用的技术通常能够准确的获得研究者所需要的数据，但是在其结果输出的阶段，往往需要耗费较长时间与精力，部分操作步骤过多的技术还可能导致结果丢失，尤其是在第三阶段通常需要进行高通量筛选的工作中，显得有些捉襟见肘。流式细胞术在结果输出过程中，与传统技术相比具有很大优势，其快速、准确等特点尤其适合高通量筛选研究工作。本期专题，参考方法学权威期刊《Nature Protocols》发表的3篇研究流式细胞术在蛋白质相互作用中应用的文章，对双分子荧光互补技术、流式pulldown技术、调节蛋白质相互作用药物筛选、单链抗体制备过程中的动力学筛选与测定等方面向大家展示流式细胞术在蛋白质相互作用中的潜在应用方式。双分子荧光互补流式分析技术——最真实的活细胞内实时“免疫共沉淀”免疫共沉淀技术是研究细胞内蛋白质相互作用最常见的实验室技术之一，能够客观的反应蛋白在细胞内环境中的相互作用关系。但由于其结果输出过程中需要将细胞破碎，并经过较为复杂的处理过程才能通过免疫印迹的方法实现，因此通常会检测不到蛋白质间较弱或暂时性的相互作用。西班牙巴塞罗那自治大学研究者利用双分子荧光互补技术结合流式细胞术，创建了一种能够实时检测细胞内蛋白质相互作用的研究方法，被称为双分子荧光互补流式分析技术（bimolecular fluorescent complementation-flow cytometry, BiFC-FC）。双分子荧光互补流式分析技术——最真实的活细胞内实时“免疫共沉淀”免疫共沉淀技术是研究细胞内蛋白质相互作用最常见的实验室技术之一，能够客观的反应蛋白在细胞内环境中的相互作用关系。但由于其结果输出过程中需要将细胞破碎，并经过较为复杂的处理过程才能通过免疫印迹的方法实现，因此通常会检测不到蛋白质间较弱或暂时性的相互作用。西班牙巴塞罗那自治大学研究者利用双分子荧光互补技术结合流式细胞术，创建了一种能够实时检测细胞内蛋白质相互作用的研究方法，被称为双分子荧光互补流式分析技术（bimolecular fluorescent complementation-flow cytometry, BiFC-FC）。 一．方法介绍实验原理：& & &&双分子荧光互补技术是将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两段，分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合，只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下，两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白，发出荧光。活细胞收集后，在流式细胞仪中的检测是实时进行的，只要细胞中有荧光产生就会被捕捉到信号，因此，不论是亲和力较弱的结合还是暂时性的结合都不会被遗漏。& & & 双分子荧光互补技术原理示意图& & & (a) 诱饵和捕获蛋白分别携带CYFP和NYFP两段YFP荧光蛋白片段& & & (b)诱饵和捕获蛋白结合同时CYFP与NYFP形成YFP& & & (c) 形成的YFP发出荧光常见的用于双分子荧光互补技术的荧光蛋白
实验过程1、设计、构建带有合适荧光蛋白互补片段和目的蛋白基因的质粒；2、将两种质粒共同转染到表达系统（如细胞、细菌）中；3、流式检测表达体系内双分子互补荧光表达强度。4、（可选）如果具有相互作用，则使用基因突变的方式使蛋白质某结构域发生改变，以判定目标蛋白相互结合结构域。5、（可选）如具有相互作用，则可利用该体系进行调节目的蛋白相互作用药物的筛选或研究调节目的蛋白相互作用的分子机制。结果判定：1、设定单独转染一种质粒，不会发出报告荧光的阴性对照与转染完整报告荧光蛋白，发出最强荧光的阳性对照；2、与阴性对照荧光强度相比，发出显著高强度荧光的样本认为细胞内发生了目的蛋白的相互作用，反之则认为没有相互作用；3、结构域突变后荧光强度显著改变的提示可能是目的蛋白相互作用结构域发生突变，用以确定相互作用结构域；4、若对上述体系进行其他干预（如加入药物或对其他蛋白进行调节）后荧光强度发生显著改变，则提示干预因素能够调节目的蛋白间的相互作用。 二．内容解析& & &文中利用上述方法构建了表达Abl-SH3-CYFP和p41-NYFP的两种质粒，将两种质粒共同转染入细菌后，使用BD FACSCalibur检测YFP荧光强度，检测到显著高于阴性对照荧光强度的YFP表达峰，提示Abl-SH3与p41具有相互作用。而分别对其基因进行突变后，相互作用荧光强度显著减弱，提示AblP54L与p41Y4F是重要的相互作用结构域蛋白。 & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &Figure. Coupling bimolecular fluorescent complementation to flow cytometry for the analysis and discrimination of transient binders. (a) Bivariate forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC) dot plot showing the R1 gate. Cells in R1 were analyzed for yellow fluorescence emission. The sample shown corresponds to cells expressing yellow fluorescent protein (YFP) (positive control). (b) Frequency histograms of cells expressing: the prey fusion alone, Abl-CYFP (gray); native YFP (black); p41-NYFP and Abl-CYFP (blue); Abl-CYFP and p41Y4F-NYFP (red); AblP54L-CYFP and p41-NYFP (yellow) and AblP54L-CYFP and p41Y4F-NYFP (orange). The mean value of each population is shown below the histograms. The highest value (other than cells expressing YFP) corresponds to bacteria expressing both wild-type prey and bait proteins. When one mutation negatively affected the interaction, a decrease in the mean value was detected. This reduction of fluorescence signal was proportional to the weakening of the binding. Therefore, mutation AblP54L had a stronger effect than p41Y4F. 三．方法点评优势：1、样本量小。传统的co-ip实验通常每个样本需要至少2-3个90 mm培养皿的细胞，在实验过程中会有大量的样本损失。BiFC-FC是以细胞为单个样本的检测方式，只要有效细胞数能够满足统计学需求，就能保证得到准确结果，即是说96孔板的1个孔就足够满足样本需求。2、准确性高。传统Co-ip实验最后结果输出是通过半定量的westernblot免疫印迹法，而BiFC-FC则是完全定量。3、重复性好。传统Co-ip实验由于样本量和结果输出方式的问题，不易重复。BiFC-FC每个细胞都可以作为一个副孔，所需样本量少，结果输出简便，易于重复。3、敏感性高。传统的co-ip方式由于过程相对复杂，很难检测到低亲和力的相互作用，而BiFC-FC相互作用即发出荧光的特性和流式细胞术实时检测活细胞内状态的特点，使得弱结合和一过性结合的现象不会被丢失。4、更快速。传统的co-ip需要有繁琐的样本制备和western检测过程，通常需要2天的时间，BiFC-FC从样品制备到上机检测获得结果只需要大概10分钟时间。5、能够进行高通量筛选。传统的co-ip获得结果的速度较慢，很难进行高通量筛选，BiFC-FC只要筛选体系建成，可以轻松的进行各种高通量筛选。6、更真实。BiFC-FC是反应的活细胞在被检测的瞬间，目的蛋白相互作用的状态，这一相互作用是最真实的细胞内多因素综合调节的体现。这一优势是需要裂解细胞和单纯的体外研究体系所不具备的。不足：1、发现功能相对较弱。BiFC-FC通常局限于两种确定的目的蛋白相互作用的研究。不具备发现某一目的蛋白新的相互作用蛋白的功能。2、研究体系建立难度相对较高。和传统co-ip构建带有标签蛋白的目的蛋白基因质粒相比，BiFC-FC相关质粒构建过程中涉及一些分子构象和链接蛋白的选择，所需分子生物学知识相对较高。3、对于表达的目的蛋白较难定量。由于没有相互作用报告片段不带有荧光，因此在背景值较低（与FRET相比）的同时，很难判断质粒的转染效率。 四．文献欣赏流式pulldown技术——高通量的GST-pulldown技术GST(glutathione S-transferase, 谷胱甘肽巯基转移酶)-pulldown是一种行之有效的验证蛋白质相互作用的体外实验技术，能够很好的判定两种蛋白质间是否具有直接的相互作用。通常实验室研究中会使用免疫印迹的方式输出蛋白质相互作用的结果。这种方式需要的样本量通常较大，而且步骤繁琐不易重复，在需要研究大量样本的实验中显得有些捉襟见肘。美国新墨西哥州立大学健康科学中心和桑福德/伯纳姆医学研究所的研究人员，创新性的用谷胱甘肽荧光微球替代传统的谷胱甘肽亲和柱，并使用流式细胞仪进行结果输出，大大提高了研究工作的效率，使GST-pulldown技术真正实现了高通量应用。我们不妨暂且将这种技术命名为Flow-pulldown。流式pulldown技术——高通量的GST-pulldown技术GST(glutathione S-transferase, 谷胱甘肽巯基转移酶)-pulldown是一种行之有效的验证蛋白质相互作用的体外实验技术，能够很好的判定两种蛋白质间是否具有直接的相互作用。通常实验室研究中会使用免疫印迹的方式输出蛋白质相互作用的结果。这种方式需要的样本量通常较大，而且步骤繁琐不易重复，在需要研究大量样本的实验中显得有些捉襟见肘。美国新墨西哥州立大学健康科学中心和桑福德/伯纳姆医学研究所的研究人员，创新性的用谷胱甘肽荧光微球替代传统的谷胱甘肽亲和柱，并使用流式细胞仪进行结果输出，大大提高了研究工作的效率，使GST-pulldown技术真正实现了高通量应用。我们不妨暂且将这种技术命名为Flow-pulldown。 一．方法介绍实验原理：仿照传统的GST-pulldown技术，将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽包被荧光微球上，作为与目的蛋白亲和的支撑物与带有不同荧光标签的目的蛋白共同孵育，如果微球同时显示两种荧光则表示发生相互作用，目的蛋白荧光强度值越高则说明相互作用越强。在高通量研究中，仿照BDTM CBA技术原理，将结合不同靶蛋白的微球上结合不同强度的荧光染料，以便区别不同蛋白种类，并同时与荧光标记的目的蛋孵育，从而实现同时进行“多对一”蛋白质相互作用的研究，并能够高通量的同时筛选调节目的蛋白与多种靶蛋白相互作用的药物。& & & 实验原理示意图. a 不同荧光强度微球携带不同目标蛋白与靶蛋白结合; b 选择代表微球的区域; c 以SS为横轴，FL8为纵轴，分离代表不同蛋白的各群细胞。&实验过程：1、表达多种靶蛋白并与GST融合，再各自与一定（红色）荧光强度的微球结合；2、表达带有绿色荧光的目标蛋白；3、将不同靶蛋白微球与目标蛋白共同孵育；4、流式细胞术检测微球上的荧光强度。5、（可选）可将某些已知具有“多对一”相互作用的蛋白共同孵育（如文中Bcl2家族成员与Bim-BH3）然后对候选化合物进行高通量筛选，同时对多组蛋白质间相互作用调节进行研究。结果判定：1、根据微球红色荧光强度不同，可将微球分群，每群微球代表一种蛋白；2、带有绿色荧光的蛋白，如果没有与靶蛋白结合，会在样本处理过程中被洗掉，即不会出现单独的绿色荧光；3、与红色荧光共定位的绿色荧光强度值越高提示蛋白质相互作用越强；红色荧光值仅用于根据荧光强度不同区分不同蛋白；4、高通量筛选中，以时间为坐标横轴，绿色荧光值为坐标纵轴，通过每孔样本上样时间一致和换孔间隙信号空白区分各孔细胞荧光信号； 二．内容解析 & & & & & & & && &文中利用微球荧光强度的不同，将不同目的蛋白区分开来，下图所示是文中Gate 6即影响Bcl-B与Bim-BH3结合的药物的筛选过程。研究者利用高通量筛选中每孔检测时间相同和时间轴上孔间信号空白的特点，利用时间轴将每孔样本区分出来，通过图形级联放大和数据统计结果我们可以发现，B5孔药物对Bcl-B与Bim-BH3的相互作用具有显著的抑制作用。&
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &Figure. Finding an inhibitor specific for Bcl-B. (a) Time bins corresponding to bead-containing wells are partitioned and analyzed in ~3 s for a 384- we use no beads in columns 23 and 24, leaving 352 bins with beads. A plot of events (beads per 0.1 s) versus time for a plate is displayed. (b) An enlarged view of Row B. (c) An enlarged view of the wells around well B5, with log FL1 (green fluorescence) on the y axis. (d) Median fluorescence intensity (MFI) measurements for the wells around well B5. Only the Bcl-B value in B5 is significantly decreased. 三．方法点评优势：1、Flow-pulldown技术以流式细胞术替代了传统GST-pulldown技术中免疫印迹法作为结果输出的方式，显著缩短了检测时间；2、Flow-pulldown技术与传统GST-pulldown技术相比，检测所需样本量显著减少；3、Flow-pulldown技术与传统GST-pulldown技术相比，以完全定量的流式细胞术代替了半定量的免疫印迹法，更易于准确定量；4、Flow-pulldown技术能够同时检测“多对一”的，甚至“多对多”（加入不同荧光标记的多种目的蛋白）的蛋白质相互作用药物高通量筛选，这是传统GST-pulldown很难实现的。不足：由于加入荧光标签，在高通量实验设计时需要考虑荧光配伍的问题，但通常是易于解决的。 四．四文献欣赏高效的单链抗体动力学筛选技术与快速的动力学测定方法抗体药物的开发是当前全球医药发展的必然趋势。2010年全球销售额前十名的药物中，有一半是抗体类药物，目前临床上的抗体类药物主要集中在肿瘤和自身免疫病治疗领域。据2010年统计数据显示，全球有5000余种抗体药物正在进行不同阶段的临床实验，进行临床前实验的潜在抗体药物更是数量繁多。抗体药物凭借其安全有效、特异性高、性质均一、靶点定制等特点在未来医药产业领域尤其是当前严重威胁人类健康的慢性复杂性疾病治疗领域将具有很大市场。抗体制备过程中候选抗体与抗原亲和力动力学性质的优化是抗体研发过程中的第一个难关。动力学性质良好的候选抗体会使抗体研发成功率大大提高，也是很多制药公司和投资人选择项目的重要指标之一。 然而，传统的动力学筛选与测定如生物淘洗法和竞争/非竞争性ELISA法在抗体动力学筛选和测定过程的初期，面对大量筛选和检测工作时会显得捉襟见肘。由于药物研发的时效性，开发者需要一种能够快速对候选抗体进行动力学筛选和测定方法。美国马萨诸塞州立技术研究所研究人员，利用结合酵母展示技术、荧光抗原表达技术和流式细胞术，建立了一种能够快速、高效的对单链抗体进行动力学筛选和测定的方法。 一．方法介绍实验原理：向大库容单链抗体酵母展示库中，加入少量（红色）荧光标记的靶抗原蛋白，过量的带有（绿色）荧光的单链抗体会竞争性的与靶抗原进行结合，亲和力较高的组合会显示双荧光，被流式细胞分选仪分选出来。通过检测事先设定好的不同抗原/抗体数量比样本的荧光强度值，根据解离常数公式计算解离常数。& & & 酵母表面展示单链抗体与抗原结合示意图.&实验过程：1、建立库容大于109的酵母展示单链抗体库，并对单链抗体标记绿色荧光；2、构建和表达带有红色荧光标签的靶抗原；3、将少量靶蛋白加入单链抗体库进行竞争性结合，并使用磁珠分选将库容缩小至107，并使用流式细胞术验证次级库可用性；4、将次级库酵母再次富集后，再次进行动力学筛选，利用流式细胞分选技术对双荧光酵母进行初次分选5%动力学性质较好酵母；5、并将这部分酵母进行富集扩增后，再次加入少量抗原进行竞争性结合，并利用流式细胞分选技术，再次分选0.1-1%高亲和力的酵母；6、反复几次直到获得较好亲和力的候选抗体；7、对候选抗体进行动力学性质即解离常数进行初步测定，并进行使用基因突变的方式进行体外亲和力成熟，随时使用流式细胞术检测动力学性质，直到获得动力学性质合格的候选抗体。结果判定：1、红色荧光代表抗原蛋白，绿色荧光代表酵母表面单链抗体，酵母可以视为是类似微球的存在，能够被流式细胞仪检测出来，抗原蛋白如果不被抗体“捕获”，在样本处理过程中会被洗掉，理论上不会出现检测到只有红色荧光蛋白表达的情况；2、双色荧光散点图中，红绿双阳性（右上区）代表抗原与抗体结合，红色荧光越强，说明酵母上单链抗体结合的抗原越多，即亲和力越高，动力学性质越好；3、本方法中以MFI作为荧光强度的指标，进行各种数据统计与计算。4、本方法中假定每个酵母表面表达5X104个相同的单链抗体，进行计算。 二．内容解析 & & & & & & & && &本方法中，应用流式细胞分选技术对单链抗体进行动力学筛选是方法的关键环节。如下图所示是研究者第一次动力学筛选的过程。研究者使用未标记的酵母细胞作为阴性对照，使用Alexa Flour 488单阳性酵母细胞调节与PE共同标记的补偿值，并将Alexa Flour 488和PE双阳性细胞作为第一次分选的目标群。同时利用与单链抗体上的c-myc相互结合的Alexa Flour 488荧光强度检测酵母展示的效率。为接下来的次级库富集和进一步筛选奠定了坚实的基础。&& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &&Figure. Representative flow cytometry data. (a) Unlabeled yeast cells. (b) Yeast cells labeled with chicken anti-c-Myc IgY followed by Alexa Fluor 488–conjugated goat anti-chicken (Alexa Fluor 488 control), compensated to reject crosstalk between the Alexa Fluor 488 and phycoerythrin channels. (c) MACS-sorted population labeled for the initial round of flow cytometry sorting. Cells are double-labeled with anti-c-Myc IgY as in b plus biotinylated antigen followed by streptavidin-phycoerythrin. The thick red outline indicates a typical sort gate. (d) Histogram of Alexa Fluor 488 signal for cells labeled in c, indicating yeast surface expression of scFvs. The left peak represents the nondisplaying fraction of yeast due to plasmid loss. PE, phycoerythrin. 三．方法点评优势：1、传统的抗体亲和力筛选是使用生物淘洗法，生物淘洗法是采用一种抗原过量的淘洗方式，不具有动力学筛选的功能，很难筛选到低解离常数的抗体，而且与流式细胞分选技术相比过程较复杂，周期较长，准确性也不高；2、传统简单测定抗体亲和力的方法为竞争/非竞争性ELISA法，使用流式细胞术进行抗体亲和力初步检测较传统方法更加快速、高效、简便和准确；3、经典的测定抗体亲和力的方式为biacore生物大分子相互作用分析仪，但该方法检测一个样本至少需要6个小时时间，不适用于亲和力成熟阶段所需的大量亲和力测定工作，本方法中使用流式细胞术检测一次亲和力只需要对12个抗原/抗体不同比例的样品进行检测即可获得较为准确的数据，按照每个样本30s计算只需要6分钟时间；4、与经典的放射免疫分析法相比，使用流式细胞术测定抗体亲和力更安全、更简便、更高效。不足：目前本方法不能替代经典的biacore或放射免疫分析法的根本原因在于不能对酵母上表达的单链抗体数量进行准确定量，如果能够解决这一技术难题，本方法将会在这一领域获得更多的青睐。目前本方法检测数据与biacore检测数据相比，相差不超过1个数量级，完全能够满足抗体亲和力成熟阶段对候选抗体亲和力的初步检测工作。 四．四文献欣赏编后随着蛋白质-蛋白质相互作用研究的深入和蛋白质-蛋白质相互作用技术在多领域尤其是制药领域的推广，传统的研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法由于结果输出过程较为复杂，不能准确反映真实状态下蛋白质-蛋白质相互作用的情况，难以适应研究与开发人员对于高通量实验的要求。荧光标记的使用，是科学界的一次革命，不仅使原本“黑箱操作”的分子生物学技术变得可视，也使相关检测更加高效准确。流式细胞仪是快速、高效、准确进行荧光检测的最专业的设备之一，与传统的荧光分光光度计和荧光显微镜等技术相比，在高通量实验中具有明显的优势。本期专题介绍的几种研究蛋白质相互作用的方法，正是将蛋白质-蛋白质相互作用、分子生物学荧光标记技术、流式细胞（分选）术有机的结合起来，为蛋白质-蛋白质相互作用及其相关领域研究提供了高效、可靠地方法，我们相信，随着相关技术的进一步发展，流式细胞（分选）术在包括蛋白质-蛋白质相互作用等分子生物学领域将大有可为。各种实验中对流式细胞仪的选择_百度文库
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各种实验中对流式细胞仪的选择
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应该是蛋白质，因为细胞干重的含义就是细胞除去水份后的灰质重量，所以不应该是水。如果是考查水，应说占细胞湿重的百分之多少，我记得活细胞的含水量应该是不低于75％。
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第1个流式细胞仪展会的名称是：2012中国(苏州)国际医疗器械展览会暨论坛，这个会的开始日期是日，到11月11日结束,在苏州...
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