c.64G&A什么意思？是基因在这个位点原来是G，然后突变成了A？还是反过来的？
这是轻度α地贫的基因型. SEA（东南亚）缺失是很常见的α地贫致病突变。 患者失去了四个α珠蛋白基因中的两个（－－）， 另两个正常（αα）。未检出β地贫。 N=...
答: 成都熊猫基地距离市区有多远？半天时间够不够玩？
答: 你朋友是宫颈息肉.推荐一文,供你参考:什么是子宫颈息肉子宫颈息肉是慢性宫颈炎表现的一种，在已婚妇女中比较多见。　　子宫颈是子宫下端的部分，其内腔呈圆筒形或梭形，...
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CYP21A2 mutations in Portuguese patients with congenital adrenal hyperplasia
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Identification of two novel mutations and characte
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CYP21A2 mutations in Portuguese patients with cong
官方公共微信建立一种CYP21A2基因突变的方法
建立一种等位基因特异PCR结合测序检测
CYP21A2基因突变的方法
【摘要】 目的
建立一种等位基因特异PCR技术结合测序检测CYP21A2基因突变的方法。方法
通过对CYP21A2基因和相应假基因CYP21AP序列进行同源性比较，设计等位基因特异PCR引物。设计可同时扩增CYP21A2基和CYP21AP基因的同源性引物。选择4例先天性肾上腺皮质增生症患者和5例正常对照，利用设计的引物进行扩增检测，比较等位基因特异PCR引物与同源引物测序结果。结果
4例患者用等位基因特异PCR引物扩增和测序分析均发现突变，分别为IVS2-13A/C&G、R356W和Arg149Pro，对照序列正常。同源引物扩增分析只能明确Arg149Pro突变，患者和正常对照均存在IVS2-13A/C&G和R356W突变。
结论等位基因特异PCR技术结合测序可直接进行CYP21A2基因突变检测，方法简便、可靠、价廉，具有临床应用推广价值。
【关键词】 CYP21A2；等位基因特异PCR；同源引物
Establish a new allele-specific based-method to directly screen
CYP21A2 gene mutation
【Abstract】Objective To establish a new
allele-specific PCR-based method to detect CYP21A2 gene mutation.
Methods Allele-specific PCR primers as well as analogy
primers were designed according to the results of sequence
alignment of CYP21A2 and CYP21AP gene. Genomic DNA were extracted
from blood specimens of four patients with 21-hydroxylase
deficiency and five healthy controls and amplified with
allele-specific PCR primers and analogy primers separately and
sequenced.& Results Mutations of CYP21A2
were found with established allele-specific PCR-based method In
four patients but not in healthy controls, including
IVS2-13A/C&G, R356W and Arg149Pro. Correspondingly, when
detected using analogy primers set IVS2-13A/C&G and R356W were
observed in both patients and healthy controls. Conclusion
The allele-specific PCR-based method is simple, effective and
reliable to detect CYP21A2 gene
mutation.&&&
【Key words】CYP21A2; allele-specific PCR; analogy
先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia,
CAH）是一组以肾上腺皮质激素合成缺陷为特征的常染色体隐性遗传病。21-羟化酶缺陷症（21-hydroxylase
deficiency,21-OHD）是先天性肾上腺皮质增生症中最常见的一种类型，占90%以上。21-羟化酶基因位于人类第6号染色体短臂6p21.3的HLA
Ⅲ类基因区，由无活性的假基因（cytochrome P450, family 21, subfamily A, polypeptide
1 pseudogene；CYP21A1P）和有活性的真基因 (cytochrome P450, family 21,
subfamily A, polypeptide 2；CYP21A2)
串联排列组成，真假基因之间有高度同源性。导致21-羟化酶缺乏症的突变主要是一些从CYP21A1P转位到CYP21A2基因的序列，影响功能基因活性而产生症状。目前检测CYP21A2突变的方法主要是设计特异引物扩增长片段CYP21A2基因序列，然后进行巢氏PCR和测序分析。巢氏PCR的引入使得操作步骤和相应的质控体系复杂，也增加了假阳性的可能。
等位基因特异PCR技术常用于多态性位点的检测，可区分单个碱基的差异，目前已经广泛用于不同物种的筛查，但用于遗传病检测的报道较少。我们参照以往报道，建立检测CYP21A2基因突变的等位基因特异PCR结合测序方法，并对4例21-羟化酶缺乏症家系进行检测，均发现突变。
1. 对象与方法
收集先天性肾上腺皮质增生症患者4例，诊断依据根据临床表现和实验室检查。血浆睾酮、促肾上腺皮质激素、17-羟孕酮均增高，血皮质醇水平降低，骨骺提前融合，肾上腺增强扫描发现存在不同程度的双侧肾上腺增生。选取5例正常健康人群作为对照。
1.2.1& 基因组DNA提取
&采用经典酚-氯仿的方法提取患者和对照组外周血白细胞DNA，定量后稀释至100mg/L备用。
1.2.2& 等位基因特异PCR引物的设计 &登录NCBI
(美国国立生物技术信息中心)，GenBank数据库下载CYP21A2基因（Accession No:
NG_007941）和CYP21A1P（Genbank No:
NT_167245）基因序列。使用Invitrogen公司的vector
NTI软件中Align工具进行同源序列比对，寻找不同的碱基位点。采用oligo
6.0软件设计引物，根据Align比较结果，选择同源性不同的碱基作为引物3’端碱基。引物扩增区域包括所有CYP21A2基因编码区以及外显子-内含子接头区域。引物在Align比较结果上的位置见图1。引物3’端至少有2个碱基与CYP21AP基因对应序列不同；如果同源分析引物3’端只有1个碱基不同，则引物3’端倒数第2个碱基应该进行变换。例如，引物exon
3’端位置CYP21A2和CYP21AP只有1个碱基不同，因此倒数第2个碱基由T为C。引物序列见表1。同源PCR引物采用oligo
6.0软件，可同时扩增CYP21A2和CYP21AP基因，引物序列见表2。
图1& CYP21A2与CYP21AP序列比较结果及对应引物位置。A, exon
1-2引物位置；B, exon 3-5引物位置；A, exon 6-8引物位置；A, exon
9-10引物位置。阴影方框示引物位置。
表1　CYP21A2基因等位基因特异性PCR引物序列
Table 1　allele-specific PCR primer sequences of
CYP21A2 gene
5'- CCAGGTGGGGGCGGACACTA -3'
5'- GGCTTTCCAGAGCAGGGAGTAGTCTC-3'
5'- TTTGGGGCATCCCCAATCCAGG -3'
5'- GAGGGGAGGCCGTCCACGT -3'
5'-GCCTAGACACCCCTGGGTTGCA -3'
5'- CCCTCAGGGATGTCGTAGCGG -3'
exon 9-10F
5'-CCAGATTCAGCAGCGACTCC -3'
exon 9-10R
5'- TGGTTGAGTGCTGGGAGGT -3'
&表2　 CYP21A2和CYP21AP基因同源引物序列
Table 2　analogy primer sequences of CYP21A2 and
CYP21AP gene
5'- GTCAAGGGAGGCCCCAAAACAGTCTACAC -3'
5'- TCTTGGAGTTCAGCACCACCACATCTG -3'
5'- TCCCAATCTATCTGCTTGGCCTGACTCAGA -3'
5'- GCCTGGGCAGCATAGCAAGAACCCAT -3'
5'- GGGGCATATCTGGTGGGGAGAAAG -3'
5'- CATGCGCTGTGGAGAAACAGTGTG -3'
5'- CCACAAGAAGCTCACCCGCTCA -3'
5'- GGGAATCACGTCCACAATTTGGATG -3'
5'- CTCCTCACCTGCAGCATCATCTGTTACC -3'
5'- TCTCCACGATGTGATCCCTCTTCTCTATG -3'
5'- CTGGCAGGACGACAACTTAATGCCTG -3'
5'- TAACTGGGGTATGCAAAAGAACCCGC -3'
5'- GCCATAGAGAAGAGGGATCACATCGTG -3'
5'- CACAGCCCCAGCCGCACAGT -3'
5'- TGCCTCACCGGCACTCAGG -3'
5'- CAGAACTCATGTGGCCTCTCCCAG -3'
5'- GTGCACGGCTGCCCTTGCTC -3'
5'- GGGACCAGCCTCCACCACATTTTC -3'
5'- TCCCTGAGGGCACAGTCATCATTC -3'
5'- GGGGTTCGTACGGGAGCAATAAAGGAG -3'
1.2.3& PCR扩增与测序分析&
PCR反应体积50ul，含100ng模板DNA，引物10pmol， dNTPs终浓度0.2mol／L，Taq酶0.5U，Mg++
2.5mmol/L。采用降落PCR进行扩增，PCR反应条件为首先95.0°C,5min。然后前10个循环： 95.0°C,
30sec，65°C-61°C& 30sec（每循环降落0.5°C），72°C, 2
min；后30个循环：95.0°C, 30sec，62& 30sec，72°C,
2min。最后72°C延伸10min。PCR扩增产物用ABI 3730遗传分析仪进行检测，操作步骤参考厂家说明书。
4例先天性肾上腺皮质增生症患者均发现突变，包括1个常见热点突变和1个新发突变。
2例患者（患者1和患者4）用等位基因特异PCR产物扩增检测，发现IVS2-13A/C&G突变；对照该位点序列正常。同源引物扩增检测，患者为纯合突变，对照为杂合突变。见图2（患者4数据未显示）。
图2& IVS2-13A/C&G突变（反向测序）。A: 同源引物扩增序列；B:
等位基因特异PCR引物扩增序列。
1例患者（患者2）用等位基因特异PCR产物扩增检测，发现c.1066C&T（R356W）突变；对照该位点序列正常。同源引物扩增检测，患者和对照都有干扰峰，近似纯合突变，见图3。
图3& c.1066C&T（R356W）突变。A: 同源引物扩增序列；B:
等位基因特异PCR引物扩增序列。
&1例患者（患者3）用等位基因特异PCR产物扩增检测，发现c.446G&C（Arg149Pro）突变；对照该位点序列正常。同源引物扩增检测，患者为纯合突变，对照正常。
图4& c.446G&C（Arg149Pro）突变。A: 同源引物扩增序列；B:
等位基因特异PCR引物扩增序列。
21-羟化酶缺陷症占先天性肾上腺皮质增生症90%以上，致病基因CYP21A2，定位于人类6号染色体短臂6P21．3的HLAⅢ型区域，该区域同时存在相应的无活性假基因(CYP21P)，其与真基因CYP21A2同源性高达98％。国外研究认为CYP21A2基因约95％的突变是由于真假基因重组而引起的，包括基因缺失、长短不一的片段置换等。21-羟化酶缺陷症的分子诊断最主要的困难是CYP21A2和CYP21P基因具有高度的同源性，设计特异性高的引物对目的片段的有效扩增至关重要。由于CYP21A2和CYP21P基因同源性很高，往往特异性引物需要扩增的片段距离较长，而目前Sanger测序长度一般为700bp左右，即使正反向测序片段超过1400bp也比较困难。解决的方法一个是进行克隆测序，步骤繁琐；另一个是设计巢氏PCR引物进行扩增，伴随的问题是容易产生假阳性，也增加了阳性污染的几率。
我们对CYP21A2和CYP21P基因序列进行比较分析，发现只有1个碱基差异的位点分布相对比较均匀，在此处设计引物扩增片段可直接进行测序，但引物3’端只有1个碱基差异无法保证扩增特异性。等位基因特异PCR技术常用于多态性位点的检测，关键在于分析引物3’端碱基错配时的扩增效率，并在引物3’端引入第2个错配碱基以保证扩增特异性。参照以往报道，我们设计了检测CYP21A2的等位基因特异PCR引物，并选择患者与正常对照进行验证。引物扩增片段最长为1141bp，正反向测序可以直接测通。我们在4例患者中均发现突变位点，分别是IVS2-13A/C&G、R356W和Arg149Pro，而正常对照中没有发现，表明等位基因特异PCR方法结合测序可以直接进行CYP21A2基因突变检测，
为了证明采用等位基因特异PCR引物检测结果的准确性，我们还设计了可同时扩增CYP21A2和CYP21P基因的同源PCR引物进行检测。同源引物只能明确Arg149Pro突变，而对于IVS2-13A/C&G和R356W突变，无法排除假基因干扰。上面提到，CYP21A2基因约95％的突变是由于真假基因重组而引起的，IVS2-13A/C&G和R356W突变属于这一类，因此同源引物在正常对照中也检测到。Arg149Pro突变为CYP21A2基因新发突变，与CYP21AP假基因无关，因此同源引物可以明确。除此以外，我们注意到同源引物检测R356W突变时，正常人突变位点并不是明显双峰，而是近似于纯合突变，表明CYP21A2和CYP21AP不一定具有相同的扩增效率，因此排除CYP21AP基因的干扰十分重要。
综上所述，我们建立的等位基因特异PCR结合测序的方法，可以直接、简便、准确地进行CYP21A2基因突变检测，同时降低了巢氏PCR可能造成的实验室污染风险，具有广泛的临床应用前景。本研究中由于患者数目较小，没有检测到其他CYP21A2常见热点突变，有必要进行大规模样本研究，以进一步证实方法的可靠性。
参 考 文 献
[1]& Wedell A. Molecular genetics of
21-hydroxylase deficiency. Endocr Dev. -7.
[2] Wang H, Jiang L, Wang PP, Zhou HB, et al. Mutation analysis
in families with 21-hydroxylase deficiency. Zhonghua Yi Xue Yi
Chuan Xue Za Zhi, -684.[
王慧，蒋玲，王萍萍，等。21-羟化酶缺乏症家系的基因突变研究。中华医学遗传学杂志，-684.]
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1，escapeHTML将& & & " '转成字符实体&使用场景：&（1）用户在页面中录入（比如输入框） &script&alert(2);&/script&， js将该内容提交给后端保存&（2）显示时，后端将字符串返回前端；js接收到之后：&a, 使用escapeHTML，将字符串转为 &script&alert(2);&/script&此时，浏览器将能正确解析，因为浏览器接收到实体字符后，转成对应的尖括号等。&b, 不使用escapeHTML，浏览器一看到&，便认为是html标签的开始，直接把刚才的字符串当脚本执行了，这就是xss漏洞。&2，unescapeHTML将字符实体转成& & & " '&使用场景：&后端将已经转义后的内容显示到页面；比如&script&alert(2);&/script&&js收到后：&a，前端进行unescapeHTML，则可以直接dom操作，将标签显示到页面。&b，前端没有unescapeHTML，则原样输出&script&alert(2);&/script&，但此时并没有执行。&转义字符：&
提示：使用实体名而不是数字的好处是，名称易于记忆。不过坏处是，浏览器也许并不支持所有实体名称（对实体数字的支持却很好）。
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