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免疫印迹技术对幽门螺杆菌感染的分型诊断及其临床意义
作者：张韶斌，陈斯亮，罗莞超，高映萍，罗秋红&&&&作者单位：深圳市第九人民医院，广东 深圳 518116
　　目的：探讨免疫印迹技术对幽门螺杆菌的检测及分型诊断的应用价值。方法：应用免疫印迹技术检测58例上消化道疾病的患者和20例无症状健康志愿者血清中的幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)、细胞毒素(CagA)和尿素酶(Ureas)等Hp抗体。根据Hp抗体的表达情况将Hp感染分为Ⅰ型和Ⅱ型，并结合14C呼气试验和胃镜检查进行分析。结果：慢性胃炎组、消化性溃疡组、胃癌组的HpⅠ型阳性率分别为66.7%、89.5%、100%，与对照组(25%)的差别有统计学意义。慢性胃炎组、消化性溃疡组、胃癌组的HpⅡ型阳性率分别为20%、2.6%、0，慢性胃炎组HpⅡ型阳性率与对照组的差别无统计学意义，消化性溃疡组、胃癌组HpⅡ型阳性率与对照组的差别有统计学意义。并且发现随着病变恶性严重程度的增加，CagA /VacA的表达呈上升的趋势，尤其是VacA的表达，在慢性胃炎组、消化性溃疡组、胃癌组的阳性率分别为53.3% 、81.6%、100%。结论：免疫印迹技术可应用于对Hp感染分型诊断，为临床治疗及判断预后提供一定依据。
【关键词】& 免疫印迹技术 幽门螺杆菌 分型
　　Application of Immunoblot Assay in Serotyping of Helicobacter Pylori and Its Clinical Significance
　　ZHANG Shao?bin, CHEN Si?liang，LUO Guan?chao,GAO Ying?ping,LUO Qiu?hong
　　（The ninth People&s Hospital of Shenzhen,Shenzhen,Guangdong 518116,China）
　　Abstract：Objective Investigate the applied value of detecting and typing Helicobacter pylori (Hp) by immunoblot assay. Methods The VacA,CagA,Ureas antibodies in serum for Hp of 56 patients who have disease of upper digestive tract and 20 health volunteers without symptoms in the control group were detected by immunoblot assay. Hp is divided into two subtypes base on those antibodies. And we analyse the Hp infection with those subtypes, the gastroscopy diagnosed and the 14C?Uneabreath test. Results HpⅠpositive incidence of the chronic gastritis group, peptic ulcer group and gastric cancer group is 66.7%,89.5%,100% respectively is statistically significant comparing with control group&s(25%). HpⅡpositive incidence of the chronic gastritis group, peptic ulcer group and gastric cancer group is 20%,2.6%,0 respectively. The chronic gastritis group&s incidence is not statistically significant comparing with control group&s, the other groups&s incidence is statistically significant comparing with control group&s. And we found that, with the lesion getting worse the positive incidence of VacA/CagA antibody will be rose, especially the positive incidence of the VacA antibody in the chronic gastritis group (53.3%), peptic ulcer group (81.6%), and gastric cancer group (100%).Conclusion Immunoblot assay can be used in detecting and typing Hp and it could provide some basis for clinical treatment and judging the prognosis.
　　Key words： H subtypes
　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)于1983年首次由Warren和 Marshll［1］报告在人胃黏膜活检组织中分离，是一种革兰阴性微需氧菌，并且提出这种弯曲样细菌主要定植于胃窦，可能是人类慢性胃炎的病原菌。近年来，越来越多的研究表明Hp感染是慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关性淋巴组织恶性淋巴瘤、胃癌等疾病的重要病因之一［2］。Hp在胃内定植，通过对胃黏膜上皮细胞的黏附性、胃肠激素的作用、细胞壁脂多糖脂质A的致炎作用、产生多种酶以及产生细胞毒素导致临床疾病的发生［3］。尤其是60%的Hp临床分离株使上皮细胞产生空泡样变，该特性与Hp的VacA基因型和CagA蛋白有关。目前认为这是Hp致病性菌株差异性的重要原因。人类感染Hp后，会针对Hp的尿素酶(Ureas)及其分泌的空泡毒素（VacA）和细胞毒素相关蛋白（CagA）等产生非保护性抗体，本次实验采用免疫印迹法检测这些Hp抗体，从而区分不同类型的Hp感染，并且结合14C呼气试验和胃镜检查进行分析，研究不同类型Hp及其相关抗体谱与上消化道疾病的关系。
　　1& 材料和方法
　　1.1& 研究对象& 从2006年12月至2007年5月因胃、十二指肠疾病在深圳市第九人民医院住院并且经过胃镜和14C呼气试验检查（未经过抗Hp治疗）的58例患者，其中慢性胃炎15例、消化性溃疡38例和胃癌5例，年龄为16岁～76岁，其中男35例，女23例。对照组为20例健康体检的并且无上消化道疾病的志愿者，年龄为20岁～65岁，其中男12例，女8例。
　　1.2& 检查方法
　　1.2.1& 胃镜检查& 患者入院后做胃镜检查，根据镜下所见及病理检查结果作出慢性胃炎、胃或（和）十二指肠溃疡以及胃癌等诊断。
　　1.2.2& 14C呼气试验(深圳海得威生物公司产品)& >100 dpm/mmol14CO2为阳性。14C呼气试验阳性为Hp现症感染患者。
　　1.2.3& 免疫印迹检测& 抽取研究对象肘静脉血2 ml，离心，取血清，-20℃保存。Hp抗原印迹膜(上海元谷科技发展有限公司提供)是将Hp产毒株的全菌抗原液经聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小不同依次分成各种抗原蛋白区带，再将其转移至硝酸纤维素膜上而制成。在含有Hp抗原印迹膜的反应槽中加入1 000 &l洗涤液，再加待检血清10 &l，直接放在摇床上摇动30 min，弃槽中液，在摇床中用洗涤液洗涤4次，再加500 ml洗涤液，并加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体10 &l，放在摇床上摇动30 min，弃槽中液，如前洗涤4次，加A、B显色液各500 &l，8 min后观察结果，待区带显色清晰，即加终止液500 &l，2 min后弃去液体，用水冲洗后取出印迹膜，待干后对比标准带判断结果，显色区带包括128 KD、116 KD、95 KD、91 KD、66 KD和30 KD抗体区带。本实验通过检测128 KD和116 KD区带（与CagA抗体相关，Ⅰ型Hp可出现）、95 KD和91 KD（与VacA抗体相关，Ⅰ型Hp可出现）、66 KD和30 KD（与尿素酶抗体相关，分别为UreB和UreA抗体，Ⅰ型和Ⅱ型Hp均可出现）而区分不同类型的Hp。
　　1.3& 抗体阳性判断& CagA阳性:出现128 KD和116 KD两条区带或128 KD单独出现；VacA阳性：出现95 KD和91 KD两条区带或95 KD单独出现；Ureas抗体阳性：出现66 KD和（或）30 KD区带。
　　1.4& Hp分型& Ⅰ型Hp感染：CagA或VacA抗体同时阳性或是任意一种阳性；Ⅱ型Hp感染：仅出现Ureas抗体阳性。Hp感染阴性：CagA、VacA和Ureas三种抗体均为阴性。
　　1.5& 统计学处理& 各组间比较均采用chi?square test检验。以P<0.05为差异有显著性。
　　2& 结果
　　见表1。慢性胃炎组的HpⅠ型阳性率(66.7%)高于无症状的正常人群(25%)，P0.05；消化性溃疡组的HpⅠ型阳性率(89.5%)高于无症状的正常人群(25%)，P<0.01。而HpⅡ型阳性率(2.6%)低于正常人群(50%)，P<0.05；在胃癌患者中，HpⅠ型阳性率(100%)远高于无症状的正常人群 (P<0.01)，也明显高于慢性胃炎组和消化性溃疡组。
　　表1& 各种消化道疾病与对照组中Hp抗体的表达（略）
　　注：溃疡组，P<0.05。而消化性溃疡组HpⅠ型阳性率高于慢性胃炎组，P<0.05。
　　以上数据显示随着上消化道的病变恶性程度增加(慢性胃炎&消化性溃疡&胃癌)，VacA/CagA的表达也随之增加，即HpⅠ型感染率呈增加的趋势。而健康人群中多为阴性或致病性较低的HpⅡ型感染。
　　3& 讨论
　　Hp是一系列上消化道疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的病因之一。1994年，国际癌症研究机构(IARC)将Hp列为人类Ⅰ类致癌原。在国内有流行病学研究调查表明，我国的Hp感染率较高［4］。但是在已感染Hp的人群中，其临床表现有着很大的不同，有的出现上消化道疾病症状，有的人却不发病，而且发病的情况各有不同。造成这种状况的原因除了与患者的体质和其他引起消化道疾病的因素有关以外，还与不同类型Hp的致病力有着极大的关系。现在的研究根据HP是否分泌VacA（空泡毒素）/CagA（细胞毒素）将其分为Ⅰ型和Ⅱ型［5，6］。VacA分子量为90 KD，是能使细胞产生空泡变性的蛋白，具有对热稳定和对蛋白的敏感性。CagA（细胞毒素）分子量为120 KD～140 KD，其致病作用尚未完全阐明，CagA无致空泡变性作用，但是VacA与CagA两者之间存在着良好的相关性，可视为Hp的毒力标志［7］。
　　本次实验使用免疫印迹法检测血清抗体谱，发现在疾病组（慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌）中VacA总阳性率分别是53.3%、81.6%和100%，而同时出现CagA +VacA的阳性率是40%、63.2%和80%，可以看出VacA总阳性率随着慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的病变严重程度呈逐渐升高的趋势，其差异具有显著性。结果显示VacA与严重的胃十二指肠疾病，如溃疡和癌肿的发生密切相关。VacA可能通过改变离子的通透性导致细胞空泡的形成，进而损伤胃黏膜，造成糜烂和溃疡的形成。而CagA在慢性胃炎中单独表达的阳性率是13.3%，比消化性溃疡(7.9%)和胃癌(0)要高，有研究［8］表明CagA作为一种表面蛋白，具有很强的抗原性，可诱导组织中较高水平的IL?8产生，所以虽然CagA没有致空泡变性作用，但其可能通过诱发炎症反应引起组织损伤。而HpⅡ型在慢性胃炎组和对照组的阳性率明显高于消化性溃疡组和胃癌组。因为HpⅡ型不表达CagA /VacA，无毒素活性，所以在感染此型Hp以后发病较轻或不发病。结果显示HpⅡ型与HpⅠ型的致病性有较大差异，同时说明CagA /VacA是Hp的主要致病因子。
　　免疫印迹法检测血清Hp抗体属于非侵入性检查，而且可对Hp感染情况进行分型，方法简单，而且特异性强、敏感度高，但是在某些方面尚有值得商榷的地方：我们发现，某些检测出HpⅠ型抗体阳性的患者，其胃镜和呼气试验并不支持患者现在患有慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等胃肠道疾病。其原因可能是抗体的水平高低与患者本身的免疫力有关系，或既往感染Hp经治疗后康复的患者，其体内Hp抗体仍为阳性，因为抗体含量下降缓慢，存在血液中长达1 a～2 a［9］，因此Hp的抗体检测不能作为Hp现症感染或是疗效观察的指标，须结合胃镜或呼气试验的结果来临床治疗及判断疾病的预后。
【参考文献】
& 　　［1］
Warren JR, Marshll B, Normrre L, et al. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis［J］, Lancet 73.
Bjorkholm B,Befrits R，Jaup B, et al. Rapid PCR detection of HP associated virulence and resistance genes directly. from gastric biopsy material［J］.Clin Microbiol,9?3690.
洪秀华，刘运德，李向阳.临床微生物学检验［M］.中国医药科技出版社，7.
李喻元，胡品津，杜国光.胃幽门螺杆菌感染的流行病学调查［J］.中华医学杂志，):168?171.
Xiang Z,Censini S, Bayeli PF, et al. Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicolbacter pylori reveals that clinical isolates can he divided into two major types and that CagA is not necessary for the vacuolating cytotoxin［J］.Infect Immun,):94?98.
Aydin F, Kaklikkaya N，Ozgur O，et al. Distribution of vacA alleles and cgaA status of Helicobacter peplori in peptic ulcer disease and non?ulcel dyspepsia［J］.Cain Microbiol Infect,):.
潘秀珍，陈明红.幽门螺杆菌毒力与分型［J］.世界华人消化杂志，):551?553.
郭飞，胡伏莲，贾博琦.幽门螺杆菌细胞空泡毒素与细胞毒素相关蛋白［J］.胃肠病学，)：113.
陈海英，番敏，张柳.免疫印迹技术在临床幽门螺杆菌检测中的应用［J］.中国实验诊断学 ):995?996.
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碳-14呼气试验;HP阳性DPM=10
健康咨询描述：
碳-14呼气试验;HP阳性DPM=102提示幽门螺旋杆菌感染
请问这个病症.严重吗
平时有腹泻的毛病,不过没有胃病的症状
想得到怎样的帮助：如果治疗的话需要从那些方面入手?而且本人有小孩.害怕传染.平时要注意那些地方``谢谢
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