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服务名称： 定点突变|定点突变引物设计|定点突变技术
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简介：金开瑞生物拥有分子生物学、蛋白质组学、蛋白表达、抗体制备、试剂盒合作开发、检测分析等六大服务平台，专业为生物技术领域的科研人员提供高质量的生物技术外包服务。
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& 能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
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一、服务特色
1、金开瑞承诺以最低的价格在最短的时间内为您提供高质量的突变体产物；
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二、服务说明
接受订单及样品&&项目评估&&实验方案优化与确定&&实验开展&&测序验证&&质检&&发货
含待变基因的质粒一份，待变基因原始序列文件及原始测序图谱文件各一份；
待变基因及其载体质粒的生物特性等相关信息。
含有已诱变目的片段的高纯度冻干质粒DNA和含有重组质粒的穿刺菌；
发货文件主要包括如下内容；标准序列；测序结果；QC报告。
三、服务周期
自收到质粒起，10个工作日内发货。如遇特殊情况，我们会及时与客户联系，保证尽早发货。
如对感兴趣或者需要技术支持，请您与我联系QQ： ，或者浏览我们公司的网站，可以搜索到您想要的服务信息，武汉金开瑞生物有限公司期待和您的合作。
武汉金开瑞生物工程有限公司位于武汉国家生物产业基地，是一家专业致力于为全球制药企业、诊断试剂企业、科研试剂研发企业、高校和科研院所以及大型医院提供蛋白及相关研究技术服务的高新技术企业。
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&解&&&采用基因手段（干预、敲除或过表达）对预测的蛋白信息进行确证和深入分析；
&写&&&通过体外重组方法制备，并通过系列实验确认其结构与功能尽可能的接近天然状态；
&用&&&与客户合作讲蛋白的检测和合成领域的成果开发到市场需求标准的产品或平台。
六大技术平台：
蛋白质组分析平台&&iTRAQ、SWATH、SILAC、Label-free，各种蛋白质组定量技术协助您发现信号转导通路关键蛋白、发现疾病标记物、发现药物靶标。
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金开瑞坚持&以客户为中心&，专注于蛋白及相关研究，致力于做您最贴心的蛋白研究合作伙伴。
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【交流】定点突变失败N次，急求高手指点!
我现在做定点突变3个月,可是一直变不回去!我的基因长1700bp,要突变的碱基在600bp处,用的宝生物的突变试剂盒,每次按说明书实验后一测序,就是没有突变掉.试剂盒里的酶用的是pyrobest高保真的 ，高保真的一般扩增长片断有点难，后来我又用了LA酶，但这个酶在扩增后产物末端会多个A，也不行 ！求高手指点一下，三个月过去了 没有个结果，急啊 ！你的这个基因太长，而且你要突变的碱基在600多的位置，不好突变，也没有办法突变。因为在中间没有办法通过引物来引入突变碱基。我建议你把你的片断分成两端来扩，一段有突变，一段没有突变，分别设计引物，最后把这两段连起来就可以了，当然这样做是很麻烦，至少可以去试一试。突变是可以的，把基因片段连接到一个载体上，然后在要突变处设计一对反向互不的引物，三十多个碱基的，把要突变的碱基放在正中间，然后拿构建好的载体当模板扩增，再用dpnI消化掉质粒模板，将已经形成环状的PCR产物（带两个缺口）转化进大肠杆菌就可以。具体的方法原因可以参考分子克隆，strategene公司、赛百盛公司也有这类的定点突变试剂盒。takara的那个试剂盒应该也可以，但我总觉得那些步骤对操作要求太高，还要乙醇沉淀什么的，太麻烦。我最近在做跟你一样的，基因也是1700，在600bp也有一个突变，不过还有其它的突变位点，我是这么做的：在突变位点设计两个引物，一个正义，一个反义，当然在引物中已经包含突变了，而且两个引物完全互补共25bp。用这两个引物分别和上游和下游的另外两个不含突变的引物在模板也就是质粒上面扩增（用高保真酶），得到没有末端加A的600bp和1100bp片段，然后重叠PCR得到突变的全长基因（因为他们有25bp的重叠），我现在已经做成功四个了，还有三个没有成功（共七个点突变），正在努力。这种方法分子克隆上面有，另外我还试过另一种方法，大引物法，就是用刚才这个600bp的片段做引物在原模板质粒上面做单引物扩增20循环，然后加两边的引物，这样也能做出来，但是这里因为加了原模板，所以不能保证它完全突变了，需要筛克隆（这个分子克隆上面也有，你可以参考一下。刚看了看takara的说明书，我想有个地方要问一下：你用来扩增的模板是线性的1700bp的片段还是一个含这个片段的质粒？如果是质粒，在转化之前，有没有把这个质粒去掉？质粒转化跟跟连接片段的转化相比，可是太有优势了，最后你挑克隆的时候，自然多数机会挑到的都是这种没有任何突变的“原始质粒”，哪怕你最初只用了0.1ng的模板。bact wrote:刚看了看takara的说明书，我想有个地方要问一下：你用来扩增的模板是线性的1700bp的片段还是一个含这个片段的质粒？如果是质粒，在转化之前，有没有把这个质粒去掉？质粒转化跟跟连接片段的转化相比，可是太有优势了，最后你挑克隆的时候，自然多数机会挑到的都是这种没有任何突变的“原始质粒”，哪怕你最初只用了0.1ng的模板。我用的是质粒呀，但是PCR出来后会切胶回收呀，所以肯定不会有质粒了呀，只是还有少量产物是以没有突变的质粒为模板扩出来的，所以要筛选。但是重叠PCR就不用筛选了，每一步都回纯化呀。感谢这么多高手的指点!bact,你好!我就是把目的片段连接到了一个载体上,加上载体共3kb左右吧,我就是按你说的方法做的,但我没有用dpnI消化掉质粒模板这一步.我是在PCR后做磷酸化,再连接,使产物重新成为环状,再转到大肠杆菌,刚开始时p出的产物和对照一般大,但转化后都是未突变成功.再后来P出的产物总比对照小,不知道为什么.是不是我的基因太长了(3kb),高保真酶效率太低,后来我又换了LA酶,但该酶在PCR产物后都会加个A,没办法使其再环化,能有什么办法把A去掉?请各位高手继续指点!bleding,你好,用重叠PCR的方法扩1700bp长度的基因,用什么酶好呢,保真性好的扩增效率低,扩增效率高的保真度不好吧?lielieyuyu wrote:bleding,你好,用重叠PCR的方法扩1700bp长度的基因,用什么酶好呢,保真性好的扩增效率低,扩增效率高的保真度不好吧?长了确实不是那么容易做，我也是试了好多条件才试出来，将近做了一个月，天天P。你最好用一个好点的酶，我用的是TIANGEN的2*mix，然后加的PFU。现在还刚转进质粒，还没有测序验证，所以还不敢保证没有其它的突变。我觉得你那个方法也挺好的，只是应该消化一下原模板。我在PCR后会跑电泳胶回收的啊,原来的质粒模板应该不会有了吧?此帖加精，欢迎讨论突变技术！lielieyuyu,你的质粒是3k的，平常提取出来的超螺旋状态在电泳时候正常来讲大概会在2k左右的位置，跟你的pcr产物离得就非常近了，我觉得有可能有微量的交叉部分，也可能在切胶的时候切的比较宽，造成质粒回收。另外，3k对于普通pfu的扩增来说，确实很难，但你既然有pcr产物了，说明不是酶扩增效率的问题。建议：1。减少扩增时的模板，减少最后回收到模板的机会，当然，也不要太少，不然产物会太少。
2。回收PCR产物的时候电泳时间要足够长，充分分开质粒和产物。
3。合成一对引物，把突变位点放在最3‘端，根据PCR的原理，当3’端不匹配的时候，PCR扩增无法进行（详见分子科隆第三版PCR部分），这样可以用来作是否突变的筛选，就不用一个个测序了，测序太贵，而且耽误时间。等确定了再去测序。bact,谢谢你的建议!首先我的模板是稀释了800倍的,你建议的合成一对筛选用的引物很好,这样可以节约好多时间!我再试吧!我个人一般不建议用质粒全长做模板然后PCR突变，因为载体越大PCR过程中出现突变的几率越高，我说的这个突变几率指的是在你需要突变的位置突变了，在你不需要的地方也突变了。所以我建议1、如果你的突变位点附近，比如20-30bp处有一个限制性位点，那么设计一对引物，把需要突变的位点放在其中一条引物内部，PCR扩增以后re-insert进载体，也就是替换原来没有突变的片段即可构成突变载体了。2、如果突变位点附近没有合适的内切酶位点，那么在更远处找一个合适的内切酶位点，选一段大小合适的片段，利用重叠延伸PCR的方法引入突变，看图。
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=415 height=457 title="Click to view full .jpg (415 X 457)" border=0 align=absmiddle>mybbff ，我记得以前跟别人讨论过突变几率的问题，你说的长度越长，突变几率越高，确实是这样，但是多出来的突变几率发生在载体那部分序列，并不影响我们的实验啊，发生在那1700bp的突变的可能性跟是否连接载体应该是没有关系的。在突变位点设计一条引物，与1700片断的上游引物做PCR，获得一条较长的片断，回收，以该回收片断为大引物，再与1700片断的下游引物做PCR,即可获得突变的片断。注意使用高保真的酶，模板少加，循环数要少。最好 能在 突变位点形成酶切位点，这样便于检测hnsdly,你好,我想问一下,我的片段长1700左右,突变位点在559位,P出的大引物太大了吧,能结合上吗?请问各位高手,我能不能在突变位点处设计引物,扩两条带,再用PCR拼接起来!因为我的突变位点在559位,P出的两条带一个为500多bp,一个为1200bp,这样的两条带拼接是不是有些困难!另外一种途径是用LA酶,但它会在最末端引入一个多余的A,请问有什么方法能把A去掉?lielieyuyu wrote:请问各位高手,我能不能在突变位点处设计引物,扩两条带,再用PCR拼接起来!因为我的突变位点在559位,P出的两条带一个为500多bp,一个为1200bp,这样的两条带拼接是不是有些困难!另外一种途径是用LA酶,但它会在最末端引入一个多余的A,请问有什么方法能把A去掉?去A可以用pfu酶mybbff wrote:我个人一般不建议用质粒全长做模板然后PCR突变，因为载体越大PCR过程中出现突变的几率越高，我说的这个突变几率指的是在你需要突变的位置突变了，在你不需要的地方也突变了。所以我建议1、如果你的突变位点附近，比如20-30bp处有一个限制性位点，那么设计一对引物，把需要突变的位点放在其中一条引物内部，PCR扩增以后re-insert进载体，也就是替换原来没有突变的片段即可构成突变载体了。2、如果突变位点附近没有合适的内切酶位点，那么在更远处找一个合适的内切酶位点，选一段大小合适的片段，利用重叠延伸PCR的方法引入突变，看图。其实定点突变最简单最有效就是全质粒扩增的方法，虽然可能引进不需要的突变，但是只要加大最初的模版量5－50ng，减少PCR的循环次数（12－18次），使用高保真的酶（pfu等），再用dpnI消化，就可以避免引入不需要的突变，实验结果就完全没有问题。而且节省时间和精力，本人做了不下40－50个位点的突变，每一个都是一次成功，而且大部分都是只挑了一个clone就搞定的，少数得挑2－3个clone。虽说有运气成分，但这个方法阳性率高是没说的。而且一次可以同时做几十个位点的突变，比引物延伸的方法要方便很多。其实也完全不用买试剂盒，自己就能搞定，我就是买了Takara的Pyrobest和NEB的DpnI拼凑的，为老板省了不知道多少银子，而且现在实验室也一直在用。引物的设计可以参照stratagene的说明书，质粒模版的处理可以参照分子克隆。呵呵，祝大家实验成功！smartkevin ，这种方法我用过，似乎高保真酶是个关键，主要是因为加上质粒之后，需要扩增的片段就大了许多，很多pfu就不能满足要求了，不知道takara的pyrobest性能怎么样？能不能介绍一下，你都扩增过多长的片段（包括质粒）？smartkevin,我一开始也是用的质粒扩增,但我的片段加上质粒共5k,太大了,用pyrobest试了好多次,P出的产物都变小了,你说的减少PCR的循环次数（12－18次），能有PCR产物吗?还有,想问一下如何用PFU去掉A?有没有人试过用核酸外切酶1去掉PCR产物中末端多余的碱基?lielieyuyu，我以前做的时候用的是赛百盛的试剂盒，加上质粒一共扩增8k的都能做出来，试剂盒说明书说能扩增15k的，对此我一直表示怀疑，但5k应该没问题，还有像strategene的试剂盒应该也没问题，pyrobest能不能扩增出来，还不知道。再有一点，PCR的循环数12-18是为了减少突变的几率，不过12似乎太少了，我那时候是18-25好像，记得不是很清除了，可以看看说明书。琼脂糖电泳看到片段大小不对，那可能是扩增的特异性不好，但看不到产物不一定就不行，毕竟十几个循环产物确实很少，很多时候不能通过EB染色观察到，但那个浓度只要感受态细胞转化效率高，就可以通过转化得到。bact wrote:smartkevin ，这种方法我用过，似乎高保真酶是个关键，主要是因为加上质粒之后，需要扩增的片段就大了许多，很多pfu就不能满足要求了，不知道takara的pyrobest性能怎么样？能不能介绍一下，你都扩增过多长的片段（包括质粒）？如果有stratagene的pfu当然是最好的，但是就是贵。我用的都是pyrobest的，最大扩增过8k的，没有问题。pyrobest说明书好像说扩增lamda可以到10k以上，没试过。扩增效率我觉得挺好的，一般我做单碱基突变只作12cycles，扩增的条带很亮，多碱基可用16cycles，缺失或者插入可用18cycles，具体可参照stratagene 的Quik Change 说明书中的条件。不同的是我用的延伸温度为72度，1min/kb，效果很好。12cycles可以检测到很亮的条带？我总觉得挺玄乎的。pyrobest看说明书上说是一种扩增能力不错的酶，但网上看很多人意见相反，自己没用过，一直不清楚。lielieyuyu wrote:smartkevin,我一开始也是用的质粒扩增,但我的片段加上质粒共5k,太大了,用pyrobest试了好多次,P出的产物都变小了,你说的减少PCR的循环次数（12－18次），能有PCR产物吗?“P出的产物都变小” 你是指质粒扩增吗？如果是的话可能是你的延伸时间不足。原则上单碱基突变12cycles足矣，这主要是由于起始的模版量很大的缘故，一般是5-50ng。其中有个关键因素是模版量和引物量的配比，所以扩增不出来最好先摸一下条件。可以先固定引物浓度，比如1－2uM，然后用不同的模版浓度试验一下扩增效果，我一般在10－20ng以上就能够扩增得到很好的结果了。我把我的实验结果给你看看吧lane 1 lane 2, lane 3, native plasmid + DpnI; lane 4, 6, 8, 10, mutated plasmids produced by PCR; land 5, 7, 9, 11, mutated plasmids treated by DpnI
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=198 height=212 title="Click to view full 1.jpg (198 X 212)" border=0 align=absmiddle>bact wrote:12cycles可以检测到很亮的条带？我总觉得挺玄乎的。pyrobest看说明书上说是一种扩增能力不错的酶，但网上看很多人意见相反，自己没用过，一直不清楚。模版量大是没问题的，你可以试试，呵呵bact wrote:12cycles可以检测到很亮的条带？我总觉得挺玄乎的。pyrobest看说明书上说是一种扩增能力不错的酶，但网上看很多人意见相反，自己没用过，一直不清楚。你用的模版量是多少？如果还是按常规的模版量（质粒 0.1ng）的话是看不到条带的我当时是按照说明书来的，模板量多大我忘了，记得说明书上说模板量太大的话，DpnI降解不完全就可能挑到没有突变的，所以一直严格按照说明书，没有加大模板量。难道DpnI很强悍？另外，你上面的图片颜色比较古怪，是不是曝光时间调的很长，然后对比度调的很高？如果直接用紫外投射仪肉眼观察的话，lane3、lane4、lane7、lane8能不能看到？以前曾经碰到有人PCR的时候产物浓度很小，琼脂糖电泳几乎看不到，我就建议他直接转化，结果也做出来了。我自己从来没有做过琼脂糖检测，都是直接转化，所以有个问题一直没有弄清楚，请教一下smartkevin，得到的PCR产物，众所周知是带缺口的环形，它电泳的速度是怎样的？跟超螺旋质粒、线性DNA还是开环质粒一个速度？bact wrote:我当时是按照说明书来的，模板量多大我忘了，记得说明书上说模板量太大的话，DpnI降解不完全就可能挑到没有突变的，所以一直严格按照说明书，没有加大模板量。难道DpnI很强悍？另外，你上面的图片颜色比较古怪，是不是曝光时间调的很长，然后对比度调的很高？如果直接用紫外投射仪肉眼观察的话，lane3、lane4、lane7、lane8能不能看到？DpnI的确很强悍，如lane 3就全部背降解。同时我一般制备的模版都是经过NaOH/EDTA处理的，转化效率很低，降低了背景。我使用的是invert的，黑色的是电泳条带。曝光时间很短，正常的曝光度。你说的条带都能看到的。bact wrote:以前曾经碰到有人PCR的时候产物浓度很小，琼脂糖电泳几乎看不到，我就建议他直接转化，结果也做出来了。我自己从来没有做过琼脂糖检测，都是直接转化，所以有个问题一直没有弄清楚，请教一下smartkevin，得到的PCR产物，众所周知是带缺口的环形，它电泳的速度是怎样的？跟超螺旋质粒、线性DNA还是开环质粒一个速度？得到的质粒是双缺口的，比超螺旋稍慢（如图所示），我记得好像是比线性的快。那可能是螺旋程度比较轻吧，所以介于超螺旋和线性之间，呵呵，猜测。谢谢smartkevin，以前 一直以为对这种方式的定点突变比较熟悉了，今天又学到了很多以前不知道的。楼主去看看，当时就犹豫应该写在核酸版还是PCR版>我应该写得很清楚。
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单位点突变引物设计软件
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