韦玮莫可良曾定元谭广萍
　　广西医科大第四附属医院暨柳州市工人医院妇产科广西柳州545005
　　【摘要】
　　目的：通过单独或联合检测等多种方法在宫颈疾病检测中的应用，探讨更为合理、高效的宫颈癌检测方法。方法：对3001例患者进行宫颈液基薄层细胞学检测（TCT）、人乳头瘤病毒DNA（HPVDNA）检测、DNA倍体分析及阴道镜下活检送组织病理检查。比较单独或联合检测方式在早期宫颈病变诊断的灵敏度、特异度、漏诊率及误诊率。结果：单独DNA倍体分析敏感度高，漏诊率低（P＜001）。联合TCT与HPVDNA检测可提高敏感度及降低误诊率（P＜001）。结论：DNA倍体分析或TCT联合HPVDNA检测可作为经济、有效的早期宫颈病变筛查手段应用于临床。
　　【关键词】TCT；HPVDNA；DNA倍体；宫颈病变
　　【中图分类号】R71174
　　【文献标识码】B【文章编号】3)
　　宫颈癌是妇科恶性肿瘤中唯一可以通过早期筛查及干预的疾病。现对我院就诊3001例妇女进行早期宫颈病变筛查,包括宫颈液基薄层细胞学检测（TCT）、人乳头瘤病毒DNA（HPVDNA）检测、DNA倍体分析联合检查，结果总结报道如下。
　　1资料与方法
　　11一般资料：选择2012年1月至2013年1月间在本院妇科门诊就诊3001例妇女，年龄2568岁，平均41&83岁。平均产次16（04）次，无子宫切除史、无身孕、无盆腔放射史。
　　12标本采集方法：妇科医师将宫颈刷头中央较长刷丝从宫颈外口插人宫颈管内，两侧短刷丝在宫颈粘膜面旋转35圈，取下宫颈刷头并浸泡在样本收集管中固定，送病理科行TCT及DNA倍体分析检测。在被检者子宫颈移行带用Dacron棉签旋转3圈，停留10s后取出，放置HPV标本收集管，送检验科行HPVDNA检测（HCⅡ）。所有病例均在阴道镜检下对可疑病变部位及宫颈移行带区3、6、9、12多点活检。
　　13诊断方法及标准：TCT 采用TBS细胞学分级系统，以ASCUS及其以上病变定为细胞学阳性。HPVDNA应用PCR荧光法检测法，检出高危亚型为阳性。DNA倍体定量分析运用AcCell系统诊断软件，将细胞核DNA指数大于25的细胞定为DNA异倍体细胞，判断标准：未见DNA倍体异常细胞、可见少量DNA倍体异常细胞（12个）、可见DNA倍体异常细胞（315个）、可见大量DNA倍体异常细胞（&15个）。将DNA倍体异常细胞&3定为DNA倍体分析阳性。组织病理学均由2位高年资病理医师进行诊断，以意见相同者为准。
　　14统计学方法： 数据用SPSS 160统计软件分析，计量资料比较采用方差分析，以P＜005有统计学意义。
　　213001例检查中DNA倍体分析阳性116例（387%），TCT阳性76例（253%），DNA倍体分析阳性者TCT均为阳性。126例行宫颈组织活检。DNA倍体分析阴性者病理均为正常或炎症；TCT阴性者中有4例病理提示宫颈癌。18例宫颈癌患者中，高危型HPV阴性7例,详见表1。
　　表1DNA倍体分析、TCT、HPV检测及活检病理结果
　　宫颈癌是妇科恶性肿瘤中唯一可以通过早期筛查、预防及干预的疾病。目前宫颈癌的筛查方式多种多样,巴氏涂片、5%醋酸肉眼观察法、液基薄层细胞学技术、HPVDNA检测、阴道镜检及DNA倍体分析等，各有优劣。因此寻找经济、简便、高效、合理的筛查方法是我们研究的重点。
　　液基薄层细胞学技术较传统的巴氏涂片在标本采集、制作及阅片方法上得到了很大的改进。但液基细胞制片技术对细胞病理技术人员阅片水平有一定要求，大强度的阅片可出现误差，使其结果带有一定程度主观性。
　　宫颈细胞DNA倍体分析是一种根据细胞DNA含量改变所作的客观判断，肿瘤早期细胞在分子水平上发生碱基对改变时，即能测定其核内DNA的含量，故能较早并较好的发现恶性增殖的肿瘤细胞。细胞癌变早期核内DNA含量及其结构的改变病理医师无法在显微镜下观测到的，所以DNA定量分析方法较液基薄层细胞学检查在宫颈癌的早期发现方面有更大的优势，敏感性更高［1］。DNA倍体分析中DNA异倍体细胞的程度可评估宫颈病变的恶性程度。异倍体细胞越多，肿瘤细胞分化程度越低，恶性程度越高。余秀荣［2］等对宫颈癌普查的7735例女性分别行常规液基细胞学及DNA倍体定量分析比较，发现CINⅡ以上病变147例，DNA倍体分析只有l例CINⅡ漏诊。细胞DNA倍体定量分析技术较常规细胞学敏感性高（836%：619%），特异性也较好。
　　目前联合筛查的方法报告显示，HPVDNA与TCT联合应用能够提高子宫颈癌及癌前病变的检出率，从而降低宫颈癌的发病率和死亡率［3~4］。高危型HPV感染是宫颈癌和癌前病变的主要致病因素。HPVDNA分型检测联合TCT作为宫颈癌筛查提高发现宫颈异常细胞，以及发现宫颈癌的诱因和分辨出将来有可能患病的妇女，可对该病高危妇女随访指标之一［5］。与传统宫颈细胞学检查比较，同时检测HPV和宫颈细胞学可以提高筛查宫颈癌前病变CIN2+的敏感性［6］。本文研究结果显示，DNA倍体分析灵敏度高于TCT检查，TCT联合HPV检查可以提高检查的敏感性。DNA倍体分析误诊率较高，但是对于CIN1及以上疾病无一例漏诊。TCT检查漏诊率较高，TCT阴性者中有4例宫颈癌，而这4例宫颈癌患者的DNA倍体分析均为阳性，其中3例HVP阳性。DNA倍体分析避免了宫颈癌的漏诊，TCT联合HVP检测亦提高宫颈癌及癌前病变检查的敏感性，减少漏诊。我们认为，宫颈HPV持续感染后可能是HPVDNA片段整合到宫颈上皮细胞核DNA内表达异常。HPV感染通常比形态学改变要早，故HPVDNA联合TCT检测将可以提高检出率、降低漏诊率。DNA倍体分析或是TCT与HPVDNA联合应用能够提高子宫颈癌及癌前病变的检出率，减少漏诊及误诊率。
　　综上所述，DNA倍体分析是宫颈病变筛查的新手段，其灵敏度高，漏诊率低，可作为宫颈癌筛查手段常规应用于临床。但是DNA倍体对检测设备仪器有一定要求，费用相对高，可根据地区经济条件、医疗水平情况采用TCT联合HPVDNA检测。DNA倍体分析或TCT联合HPVDNA检测可作为经济、有效的早期宫颈病变筛查手段应用于临床。
　　参考文献
　　［1］武卫华，曹红英，黄庆玉．DNA定量细胞学与液基细胞学联合检测宫颈癌的研究进展［J］.医学综述,)：
　　［2］余秀荣，刘勇.细胞DNA倍体定量分析技术在宫颈癌普查中的应用价值［J］.诊断病理学杂,)：289292
　　［3］陶林,贾薇,杨安强，等.普查方法的联合应用与新疆喀什地区维族妇女子宫颈癌的调查分析［J］.临床与实验病理学杂志,)：397401
　　［4］汪摇华，杨丽萍.宫颈液基细胞学与HPV检测技术联合应用在妇女病普查中的效果分析［J］.肿瘤预防与治疗,)：1832
　　［5］刘军，罗淑贞，卢义生，等．液基细胞学应用于宫颈癌筛查的研究［J］．中国实用妇科与产科杂志，)：553554．
　　［6］李克敏,尹如铁,康德英,等.人类乳头状病毒检测诊断宫颈癌前病变的价值［J］. 中国循证医学杂志，2011,ll(8)：910918
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宫颈细胞DNA倍体分析检测宫颈病变的临床价值
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50年来宫颈癌筛查虽然大大减少了发达国家和发达地区宫颈癌的发病率与死亡率，而在发展中国家以及经济欠发达等卫生资源缺乏的地区，宫颈癌的发病率与死亡率虽有所减低，但实际上仍比发达国家高许多。
据世界卫生组织统计的数据，2008年，在发展中国家，宫颈癌的新发病例则位于第二位。2012年，WHO估计世界范围内的宫颈癌新发病例为52.8万，85%发生于经济欠发达地区，中国新增患者6.20万。
在这些国家和地区，普遍存在着人口基数大、卫生资源缺乏、病理医生缺乏，尤其是出色的细胞病理学医生，以及经济基础和实力不够的情况，这些情况无疑放大了细胞学检查的不标准性、不确定性、不稳定性。由于病理医师缺乏以及水平低下，一些地区甚至摒弃细胞学检查，而采用灵敏度较低的宫颈醋酸白染色（VLI）以及宫颈卢戈氏碘染色（VILI）作为宫颈癌的初筛。
近年来国内外已有报道细胞DNA倍体分析作为新的光电自动检测法来行宫颈癌癌前评价。宫颈脱落细胞DNA倍体分析较宫颈细胞的TBS分类诊断用于宫颈癌筛查是否有更高或者相当的灵敏度，能否在三阶梯筛查中取代TCT, 实现宫颈癌筛查的自动化、智能化以及标准化是本研究的目的。 1.对象与方法
1.1研究对象& &选取2013年2月至2013年10月在夷陵妇幼保健院妇科门诊及住院接受宫颈癌筛查的942例患者，同时进行宫颈细胞DNA倍体分析和TCT检查，其中96例因宫颈细胞DNA倍体分析异常、98例因TCT检查异常、94例因上述两项检查均异常行阴道镜引导下宫颈活检，进行病理组织学检查。108例因功能失调性子宫出血或子宫腺肌病或多发子宫肌瘤行全子宫切除术而获得宫颈病理检查结果，而DNA倍体分析以及TCT检查均未提示异常。这四种情况共396例患者中，年龄最大69岁，最小21岁，平均年龄40.32+8.3岁。 1.2研究方法
1.2.1取材&&常规暴露宫颈，用武汉兰丁医学高科技有限公司配套的一次性宫颈细胞采集刷插入宫颈口1-1.5cm，直到采样器的外部刷毛接触到宫颈，以顺时针方向旋转5-10周后慢慢取出，收集宫颈口及宫颈管内脱落细胞，将其放入相应的含有固定液的样本保存管中，下推其刷头入管，拧紧瓶盖。
1.2.2制片、染色 充分振荡样本保存管，以减少宫颈脱落细胞在宫颈采样刷上的黏附，取出宫颈采样刷。将标本由样本保存管移至含有30ml固定液的标本收集管中，加入酶消化液，振荡120min（150次/min），离心5min（800rpm），50%乙醇清洗，离心2次，弃上清液，加固定剂2-3ml，振荡，混匀，加200ul细胞悬液入细胞离心管，离心、甩片5min，制成液基薄层细胞片2张。1张采用巴氏染色做常规细胞学检查，另1张采用Feulgen染色进行DNA倍体分析。 1.2.3检测方法&&DNA倍体分析使用LD DNA-ICM系统进行分析，后者由奥林巴斯BX41显微镜、浪潮NP370D2服务器、自动控制平台以及控制系统、ueyeM2240摄像头以及相应的辅助配件组成。在软件方面安装了武汉兰丁医学高科技有限公司自行研制的细胞图像分析软件。操作人员为一般的技术人员。细胞学检查由具有资质的病理医生阅片，采用TBS系统对结果进行分级判断，细胞学结果异常的需经病理主任医师确认。
1.2.4阴道镜检查及病理学检查&&凡是宫颈常规细胞学检查结果为未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS）及以上，包括ASCUS、低级别鳞状上皮内病变（LSIL）、高级别鳞状上皮内病变（HSIL）、不排除高级别鳞状上皮内病变的ASCUS （ASC-H）、不典型腺细胞（AGC）、鳞癌、腺癌，均认为细胞学检查结果异常；当细胞DNA值&5时，即可认为是DNA异倍体细胞，DNA倍体分析结果可分为未见DNA异倍体细胞、见少量DNA异倍体细胞（有1~2个异倍体细胞）、 可见DNA异倍体细胞（有3~14个异倍体细胞）、大量DNA异倍体细胞（有异倍体细胞15个及以上）。凡DNA倍体分析提示有DNA倍体异常细胞，均认为DNA倍体分析检查结果异常。两项检查有一结果异常，则行阴道镜检查并多点活检。部分病例虽然上述检查未提示异常，但是肉眼观察宫颈颗粒样外观、网格状血管走行等情况下，也行阴道镜引导下的宫颈活检。病理诊断分为无病变组（NILM, 包括慢性宫颈炎伴或不伴鳞状上皮增生、湿疣样改变、乳头状糜烂及息肉样增生等改变）、CINI（包括CINI累腺）、CIN II（包括CINI~II级、CIN II级、以及两者的累腺情况）、CIN III级(包括CIN II ~ III级、CIN III 级、以及两者的累腺情况)、宫颈癌（原位癌、鳞癌、腺癌、腺鳞癌等）。 1.3统计学方法&&采用SPSS 19.0统计学软件进行统计学处理。
2.1&&DNA倍体分析结果与宫颈活检组织病理学诊断的关系&&
有一例因上皮细胞过少，DNA无法判读，故行阴道镜引导下宫颈组织活检的396例病例中只有395个DNA倍体的分析报告。35例为CIN II+ 病变，其中28例DNA倍体分析结果提示为异常。结果见表1。&&
& & & & & & & & & & & & & & & & &&
对DNA倍体分析与病理诊断结果做Spearman等级相关的SPSS计算结果显示：相关系数rs=0.374&0，P=0.000&0.01，相关系数rs有统计学意义。即随着dna倍体分析级别的升高，病理诊断异常的可能也有逐渐提高的趋势。见表2及图1。
& & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & &
2.2&&TCT结果与宫颈活检组织病理学诊断的关系&&
因血液成分过多TCT结果无法判读，故396例中只有380个细胞学检查报告。在CIN II+ 病变中，TCT结果异常的有21例。结果见表2。随着TBS诊断级别的升高，病理诊断CIN II+ 的比例总体是不断增加的，但是细胞学检查结果为NILM与ASCUS的患者，其病理诊断CIN II+ 的比例并无明显区别（7.45% VS 6.89%）。见表3，图2。
& & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & &
对TBS诊断与病理诊断结果做Spearman等级相关的SPSS计算结果显示：相关系数rs=0.136&0，P=0.000&0.01，相关系数rs有统计学意义。即随着tbs诊断级别的升高，病理诊断异常的可能也有逐渐提高的趋势。& span=&&& 2.3 DNA倍体分析结果与宫颈细胞学检查结果比较
随着细胞学检查结果级别的升高，DNA异倍体细胞的比例也不断升高。在细胞学结果为ASCUS中，有DNA异倍体细胞的比例为46.82%，而在细胞学结果为HSIL中，存在DNA异倍体细胞的比例高达100%。两者的关系见图3。
& & & & & & & & & & & & & & & &
分别取细胞学检查结果为ASCUS+为细胞学检查阳性、查见异倍体细胞即为DNA倍体分析阳性，对此两种检测方法做配对卡方检验，McNemar's Test 的结果为：P=0.659&0.05（Excat Sig（2-sided）），两种方法诊断结果差异无统计学意义。 2.4两种宫颈癌筛查方法诊断试验的评价结果
TCT诊断CINⅡ+（宫颈高度病变及宫颈癌）的敏感度为57.6%，准确度为50.8%；DNA倍体分析诊断CINⅡ+的敏感度为80%，准确度为56.9%。详见表4。
& & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & &
图4为DNA倍体分析、细胞学TBS诊断以及两种方法联合诊断CINⅡ+病变的ROC曲线，三者的曲线下面积分别为0.769、0.580、0.732结果提示，DNA倍体分析诊断CINⅡ+病变优于单独细胞学TBS诊断以及两种的联合应用。 3.讨 论
　　细胞DNA定量分析技术主要通过对细胞核内DNA含量或倍体的测定来判断细胞的生理状态和病理改变。目前主要是使用全自动DNA图像分析系统（DNA-ICM）。定量分析细胞DNA具有如下特点：①检测细胞核内的相对DNA含量，而不是绝对值。常用c（content）作为单位来衡量DNA的含量。1个c为正常G0/G1细胞DNA含量的一半。②Feulgen染色使DNA特异性着色。其染色的深浅与DNA的含量成正比。③通过测量光密度（灰阶）计算被测细胞细胞核的积分光密度值(IOD, integrated optical density)。④用DNA指数来表示DNA含量。DNA指数=被测细胞DNA IOD值/正常细胞DNA IOD平均值。⑤由于淋巴细胞内DNA含量及形态较为稳定，细胞DNA倍体分析时常用同一标本的淋巴细胞作为标准对照。⑤分析每个细胞的DNA含量，并用DNA直方图，散点图显示标本恶性度。按细胞DNA含量高低，由高到低自动排序，将核酸含量高的前20个细胞核酸含量值直接报告，高于正常值为癌变细胞。（如图5）。
& & & & & & & & & & & & & & & &
宫颈细胞的恶变由胞核染色质首先改变，高危型HPV的DNA整合到宫颈细胞核DNA上，病毒蛋白E6/E7分别通过与抑癌蛋白P53、RB相作用，干扰中心体合成，纺锤丝缺陷，出现异倍体细胞核，最终才发展到晚期癌变细胞。这是细胞DNA定量分析技术可用于宫颈癌筛查的理论依据，也是全自动DNA图像分析系统在诊断CIN病变有可能较常规细胞学敏感的理论基础。 　　1924年Feulgen和Rossenbcek发现了细胞核内DNA染色技术后，使得这一理论转为实际应用。这一技术才得以开展、应用于实验室及临床。早在2004年，The EuropeanSociety of the Analytical Cellular Pathology 就对DNA倍体分析适用于辅助诊断宫颈病变达成共识。近十多年，不断有DNA倍体分析技术用于临床的报到,在妇产科，多限于对宫颈癌及癌前病变的DNA倍体分析，而用于宫颈癌普查则报道的较少。
　　本研究结果显示，随着细胞学检查结果级别的升高，DNA异倍体细胞的比例也不断升高，与Nguyen VQ 等研究结果相似，同时，随着DNA倍体分析级别的升高，病理诊断异常的可能也有逐渐提高的趋势。此外，相对于单项筛查，宫颈细胞DNA倍体分析检测出CINⅡ+病变的敏感性要高于细胞学的TBS诊断（80% VS 57.6%）,两者的特异度差别不大（54.7% VS 50.1%）。就筛查方案而言，DNA倍体分析诊断CINⅡ+病变优于单独细胞学TBS诊断以及两种的联合应用。
　　当然，宫颈细胞DNA倍体分析也有其不足之处。目前宫颈癌的趋势之一腺癌的比例，而腺癌细胞比起鳞癌细胞，更容易重叠，聚集成团，造成一定程度的分割困难，DNA图像分析系统极易将这类细胞视为垃圾细胞，不能做出诊断，增加了误诊和漏诊率。此外，维生素B12缺乏、放疗、化疗、HPV病毒感染等因素均可能影响DNA含量的测定，目前实际所测得的数据并不能将这些影响因素加以区分。
　　虽然现已明确，高危型HPV感染是95%以上宫颈癌的明确病因，但是HPV感染不能机械地等同于肿瘤进展，在妇女一生中高达80%的人会感染HPV, 其中90%的HPV DNA 可在2年后转阴，这是HPV感染最常见的结局。只有不到10%的感染会持续存在，但这其中也只有少部分高危型HPV持续感染可能引发宫颈病变或者宫颈癌。这也是不提倡单独将高危型HPV检测作为宫颈癌筛查的主要原因。美国癌症协会、美国阴道镜和宫颈病理学会（ASCCP），和美国临床病理学会（ASCP）新近更新的宫颈癌筛查的联合指南强调的是细胞学的筛查或者是细胞学联合高危型的HPV筛查。新近的研究也支持联合筛查,虽然液基细胞学检查为目前主流的细胞学筛查方法，但不同国家、地区因经济情况、细胞病理医师水平、工作量不对等原因，无法彻底改变液基细胞学检查不标准性、不确定性、不稳定性的“三不”缺憾。DNA倍体分析也是针对宫颈细胞的检测，且核酸的改变早于细胞形态学的改变，这也是DNA倍体分析敏感度较液基细胞学检查高的可能原因。此外，相较于TCT，DNA倍体分析自动化程度高、更经济实用。在部分文献中，推荐将DNA倍体分析或者DNA倍体分析联合高危型HPV检测作为宫颈癌的一线筛查。本研究的结果也支持DNA倍体分析用于宫颈癌的一线筛查。在今后的研究中， 将进一步比较此两者种针对宫颈细胞的检查联合针对宫颈癌病因的高危型HPV检查各种筛查方案的优劣。
（来源：中国妇产科在线&&）
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