关于原位杂交实验技术
关于原位杂交实验技术原位杂交组化（简称原位杂交，in situ
hybridizationhistochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。
探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。菌落原位杂交（Colony
hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织原位杂交（Tissue in situ
hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。
（一）探针的选择
根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。在这种情况下，寡核苷酸探针和短的PCR标记探针（80～150bp）具有较大的优越性。
关于原位杂交实验技术在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。如在建立DNA文库时，手头没有筛选特定基因的克隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。但必须首先纯化该基因的编码蛋白，并测定6个以上的末端氨基酸序列，通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。如果已有其它动物的同种基因克隆，因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类基因克隆。对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆探针时，可采用PCR方法扩增某段基因序列，并克隆人合适的质粒载体中，即可得到自己的探针。这种方法十分简便，无论基因组DNA探针还是cDNA探针都可以容易地获得，而且，可以建立PCR的基因检测方法，与探针杂交方法可作对比，可谓一举两得。
（二）探针的标记方法
在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。放射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性
。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。
（三）探针的浓度
总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。依我们的经验，要获得较满意的敏感性，膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10
ng/ml和25～1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。
（四）杂交率
在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。
（五）杂交最适温度
杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm
10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。最适复性温度（Optimunm
renaturation temperature, TOR）：Tor
=Tm &25℃
苛刻复性温度：Ts = Tm & (10或15℃)
非苛刻复性温度：Tns =Tm & (30或35℃)
（六）杂交的严格性
影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。一般认为在低于杂交体&（七）杂交反应时间。在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。1966年Britten和Kohne推荐用Cot
=值来计算杂交反应时间。Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和
反应时间（t）的乘积。实验表明Cot=100时，杂交反应基本完成。Cot=0，基本上没有 杂交。例如在液相杂交中 未标记的DNA
400μg/ml（按单股DNA每微克紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为
9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot =9.6/21
=100.8,杂交完成了。对标记DN
A（浓度为0.1μg/ml）来说Cot值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体Tm 值。由此式可见，通过调节
盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。 （八）杂交促进剂
惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高
。硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺，平均分子量为500000。另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG则可产生很高的本底。因此，使用促进剂时有必要优化条件。另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90000）。
小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。
（七）杂交反应时间
在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。1966年Britten和Kohne推荐用Cot
=值来计算杂交反应时间。Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和
反应时间（t）的乘积。实验表明Cot
=100时，杂交反应基本完成。Cot=0，基本上没有杂交。例如在液相杂交中未标记的DNA
400μg/ml（按单股DNA每微克
紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为
9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot =9.6/21 =100.8,
杂交完成了。对标记DN
A（浓度为0.1μg/ml）来说Cot值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。
Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体
Tm 值。由此式可见，通过调节
盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
（八）杂交促进剂
惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小
，短探针本身的杂交率就高
。硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺，平均分子量为500
000。另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG则可产生很高的本底。因此，使用促进剂时有必要优化条件。另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90
000）。小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。
二、关于原位杂交实验技术主要器材
医用微波炉，恒温水浴箱、湿盒、PNP笔等。
● &2.5ml/L
的醋酸--2.5ml/L醋酸酐:
三乙醇胺 13.2ml
浓盐酸 4ml
醋酸酐（用前加） 2.5ml；
&20&SSC（pH7.0）：
氯化钠 175.3g
枸橼酸钠 88.2g
双蒸水定容至1L；
&100&Denhardt‘s:
ddH2O 定容至50ml；
● &杂交液：（50ml） 用量
100%去离子甲酰胺 25ml 50%
100%葡聚糖硫酸脂 5mg 10%
100&Denhard‘s 0.5ml 1
1Mtris-HCL（PH8.0） 0.5ml 10Mm
5M NaCl 3ml 0.3M
0.5M EDTA （PH8.0） 0.1ml 1mM
10mg/ml 变性鱼精DNA 0.5ml 100ug/ml
ddH2O定容至25ml
&0.1M甘氨酸/PBS:
甘氨酸 7.5g
Na2HPO4 30.8g
NaH2PO4 2.8g
溶于800mlddH2O，定容至1000ml，高压，室温储存；
●TSM1 （1000ml）：
1MTris-HCL（PH8.0） 100ml
5M NaCl 20ml
1M MgCl2 10ml
ddH2O定容至1000ml；
●TSM2 （1000ml）：
1MTris-HCL（PH8.0） 100ml
5M NaCl 20ml
1M MgCl2 50ml
ddH2O定容至1000ml；
● &抗体稀释液：
Tris X-100 0.4ml
叠氮钠 0.4g
0.05M PBS （PH7.2）调至100ml；
● &0.05M PBS
（PH7.2）：1000ml
Na2HPO4 15.4g
NaH2PO4 1.4g
NaCl 4.25g
●去内源性酶液（40ml）：
储存液 用量 终浓度
10%甲醛 4.0ml 0.3—0.5%
冰醋酸 10.0ml 25.0%
加0.05MPBS至40ml
● &0.4% Triton-X
四、关于原位杂交实验技术操作步骤：
一质粒制备
1质粒的转化和扩增
1.1制备XL1-Blue感受态细菌
1． &取400uL
XL1-Blue菌种加入到含200ml LB培养基的锥形瓶中，37 ℃、100 rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1
CaCl_2重悬细菌，冰浴30 min，
离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200
&μ／tube)，-80
℃保存。
&转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng／μ1的质粒
DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3． &轻轻摇匀，冰浴30
4．42 ℃热激9O秒，然后迅速冰浴2 min。
&加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37 ℃，100转／min水浴孵育 60
6．取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的 LB-氨苄青霉素50
mg／ml,1μl／ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平 板于37
℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落
&用无菌牙签挑取单菌落，接种到10 ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37
℃，200转／分培养2h，取1
ml之一Eppendorf离心管，加50μl 10mmol／L
EDTA(pH 8.0)。
&加入50μl新配置的0.2mol／L
NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振荡3O秒。
3． &在70 ℃温育5
min，然后冷却到室温。
4． &加1.5μ14mol／L
KCl和0.5μ1含0.4％溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。
5． &12000g，4 ℃离以 3
min，以除去细菌碎片。
&制备1％的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg／ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNA
Marker。恒压50V，进行电泳。
&当溴酚兰迁移到凝胶全长的2／3-3／4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。
1.3质粒的扩增和纯化
&用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30ml
LB-氨苄青霉素(50μg／ml)培养液的聚丙烯管中，于37 ℃，200转／分培养3h。
2． &将菌液转入含70 ml
LB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37 ℃，200转／分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。
&菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170
μ／ml)。37 ℃，200转／分培养12-16h。
&将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4 ℃离,th,15
min，沉淀细菌。
&弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5 min
6. &加入新配制的溶液II
4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10 min。
7. &加入预冷的溶液III
3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10 min，出现白色絮状沉淀。
8． &6000rpm，4 ℃离心15
min，保留上清。
&将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入O.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10
min。(或-20 ℃4h，或4
℃过夜，可便核酸沉淀)
10.12000 rpm，4 ℃离心15
min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残 兼上清液流尽。
11．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000
rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
12．用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5 ml
Eppendorf管中。
13．加入用冰预冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混匀。12000 rpm，4 ℃离心15
min，以沉淀高分子量的RNA。
14.将上清转移到另一1.5 ml
Eppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。
15.12000 rpm,4 ℃离心15
min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。
16．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000
rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另－1.5 ml
Eppendorf管中，室温放置1.5ml
Eppendorf管中30min。
18．加入400μl
&13％(v／v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol／L)，混匀，4 &#
min以回收质粒DNA，弃去上清。
19．加入400μl TE缓冲液(pH
8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20．将水相(上清)移入另一1.5ml
Eppendorf管中，加入O.1体积(约50μ13M 的醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积(大约1
ml)的无水乙醇，充分混匀后于4 ℃放置30 min。
21．于4 &# rpm离心5
min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。
22．加入400 μl处于4 ℃的70％乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4 ℃
12000 rpm离心2 min。
23．吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。
24．用100μl TE缓冲液(pH 8.0)溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的
纯度和浓度(OD260／OD280&1.8。OD260／OD280对DNA而言其值大约为1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。；DNA浓度
=OD260 X 0.05 X稀释倍数(μg／μl)。
26．质粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。
cRNA探针的标记
&将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。
&线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针
标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探 针。
&进行体外转录，步骤如下：
4． &在冰上将各试剂加入一1.5
ml无RNA酶的Eppendorf管中。
DEPC处理的三蒸水8μl
质粒DNA模板 &0.05μg／μl
10 x NTP地高辛标记混合物 &1
0.1 M DTT溶液 & 10 mM
5 x转录缓冲液 1 x &
RNAse抑制剂 &2U／μl
RNA聚合酶 & 2U/μl
反应体系总体积 &
&加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37 ℃孵育2h。
&加入2μl无RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37 ℃孵育15
min降解模板DNA。
7． &加入0.2M EDTA(pH
8.0)溶液2μl终止反应。
8． &加入2.5μl的4 M
Licl和7.5μl冷的无水乙醇，混匀，-20 ℃放置2h。
9． &12000g下离以 15
min，弃上清，小心地用50 μl冷的70％乙醇洗涤沉淀。
1O．室温下稍干燥，溶于100μ1
DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20 ℃下保持备用。
冰冻切片与杂交前预处理：
1． &将样品从-80
℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡至少30
min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg／m1)的玻片上(玻片预先经180
℃干烤6小时)，保存于-70
℃冰柜备用。
2． &冰冻切片经室温干燥10
min后，在4％的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin。
&活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1％DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5
4． &在0.2M的盐酸作用中作用10
min后，重复步骤4)。
&在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg／m1)，37 ℃孵育15 min，重复步骤4)。
6． &经0.1M
TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1M TEA (乙酸酐／三乙醇胺，pH
8.0)中乙酰化10
min。(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)
7． &5 x SSC中平衡15
& &脱蜡，水化：
1、 &二甲苯10min
2、 无水乙醇3min 两次
３、95%乙醇3min 一次
４、75%乙醇3min 一次
５、50%乙醇2min 一次
６、重蒸水2min 一次
７、PBS洗涤5min
（二）将组织芯片放入去内源性酶液中浸泡30min；PBS洗涤5min
（三）0.1M甘氨酸去游离醛基
15min；0.4%tritonX-100 洗10min；
（四）用蛋白酶K与37℃孵育30min ，PBS振洗5min
（五） 在0.1mol/L三乙醇胺——0.25%乙酸酐中孵育10min
;在2&SSC中洗5min ；
滴加预杂交液42℃,30min；将RNA探针用预杂交液稀释（1ng/ｕL~2ng/ｕL）
（七）杂交
１、在载玻片表面覆盖上杂交小室，加20~50ｕL的杂交液到组织芯片TMA上，423湿盒中过夜。
２、在4&SSC中37℃洗涤15min
３、2&SSC，加入RNA酶（大致为10ｕg/ml）37℃中洗涤30min，
４、0.5&SSC,37℃洗涤15min
（八）关于原位杂交实验技术封闭
１、1%正常山羊血清孵育30min
２、用抗体稀释液稀释碱磷酶标记的抗地高辛抗体（1：500）37℃中孵育3h，PBS洗三次，每次5min
３、TSM1洗；
４、TSM2洗；
（九）显色：用TSM2将NBT/BCIP按2：1稀释进行显色；显微镜下掌握染色程度
（十）终止显色：用水终止
&脱水，透明，封固
１、85%乙醇脱水，2min
２、95%乙醇脱水5min
３、无水乙醇脱水15min
４、二甲苯20min
５、封片，镜检
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RNA原位杂交中的探针种类
RNA原位杂交中的探针种类
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RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性cDNA，cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。
单链cDNA探针： 由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cDNA探针的制备比较困难，在RNA原位杂交中已很少见有应用。
cRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNA-RNA杂交体稳定。cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。由于cRNA探针具有以上这些优点，cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍，因此在原位杂交中应用广泛。cRNA探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对RNA酶敏感，易受破坏，操作中要谨防RNA酶污染。
寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的寡核苷酸探针的缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它与mRNA形成的杂交体不如cRNA-RNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。
依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括3H，35C，32P和125I等，不同的同位素探针其穿透力，定位和半衰期各不相同，无一种同位素探针具有穿透力强，定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短，性能不稳定，污染环境和危害健康等原因，在RNA原位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少，而非同位素标记探针在近年来得到迅速发展，其标记物主要有生物素，地高辛，酶和荧光标记等。其中地高辛标记的cDNA，RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点，其应用越来越广泛。
相关实验方法
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