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细胞培养标准操作程序（SOP）
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细胞培养标准操作程序（SOP）
为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2．适用范围：
适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：
3.1& 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制
3.1.1& 1000ml培养液的配制
1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml&10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2～7.4生长，配制好后PH值会升高0.2～0.3，故配时调PH至7.0左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水&& &&&&&溶解&
配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水&&&&&&溶解&&
取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。
（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
&&&& 一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml&10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗
&&&& 水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
&3.1.2 &PBS（平衡盐溶液）的配制
&KCl&0.2g&&&&&&&&&&&&& ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ml
&Na2HPO4*H2O&1.56g
&KH2PO4 0.2g
&（1）&无需调PH值，其成分溶解后PH为7.4，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!）&
&（2）&Na2HPO4*H2O&1.56g&则Na2HPO4*12 H2O需3.4888g
&（3）&如欲配制500ml，以上成分减半即可
&3.1.3 &0.25%胰蛋白酶的配制
&& 胰蛋白酶粉&&&&&&& &&2.5g
&& EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 0.3g
&& NaCl&&&&&& &&&&&& &&&&& &8.0g
&&&&&&&&& &KCl&&&&&&&&& & &&&&&&&&&& &0.4g&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&& `&&&&& +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ML&
&NaHCO3& &&&&&& & &&&0.5g
&& Glucose(葡萄糖)&1.0g
&& 酚红&&&&&&&& &&&& &&&&&&&& 0.06g
（1）配出来的PH值为7.6，在PH值7.6～7.8范围内，故不需调PH值。
（2）用0.22um的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存备用。4℃可连续使用1月左右。
（3）用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
（4）如欲配制500ml，以上成分减半即可
3.2 &细胞复苏
1、准备：紫外线照台30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用前放水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。
2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基5ml加入试管中（一滴约为50ul）。
3、戴手套，从-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，保证冻存管内细胞1min内融化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（慢冻快融）
4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管，800rpm离心2min（用培养基且离心的目的:去除细胞冷冻保护剂DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS浓度为20％）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。
5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培养瓶中，标记日期、细胞名称，再把培养瓶放入CO2培养箱。（注意：加入到培养瓶后，培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁，左右上下轻轻摇晃几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。）
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
（1）入细胞室前观察CO2%压力，5-7.5mPa左右，减压器表压力不低于0.1mPa！
（2）刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让FBS浓度达到20％。
（3）离心时间为1～2min，速度为800转，不要离心太久，避免对细胞伤害较大。
（4）滴管使用注意事项：
&& a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。
&&&b.培养基和FBS（胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！
&&&c. FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,因为血清对胰酶活性有抑制作用。
&&&d．胰酶和PBS（平衡盐溶液）可以用一根滴管，不过最好分开
（5）不是所有的细胞复苏后都能活。死亡原因：冻存时间太长（如2年以上），技术不过关（如吹打太激烈）、细胞传代数太多等。
（6）关于PBS（平衡盐溶液）:
&&&a. PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用；PBS高压时其瓶塞一定要插针头。
&& b. PBS和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质，但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。PBS虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不可经常冲洗细胞。
&&&c．不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化。
&&&d．消化后暂时不养细胞的培养瓶，可以往其中加入2～3ml PBS（防止培养瓶干燥），培养瓶放CO2培养箱里短时间保存。下次用该培养瓶再养同种细胞时，把PBS吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即可再用。
（7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞复苏后应及时洗涤冷冻保护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！
3.3 &细胞换液
1、倒置显微镜下观察细胞生长状态：
a.移动细胞培养瓶时，观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞；
b.生长状态良好的细胞：透明度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。
c.生长状态不良的细胞: 细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞间空隙加大，细胞变得不规则，失去原有特点。
d.只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和实验。
2、紫外线照台30min，准备好吸管、试管饭盒，温育培养基，FBS（胎牛血清）可不温。实验开始时打开照明灯和抽风机，用75%酒精喷双手。酒精灯点燃放中间。滴管放滴管架上，从左到右顺序为：吸细胞液的滴管、吸培养基的滴管、吸FBS（胎牛血清）的滴管。从水浴箱中取出培养基，擦干水放入操作台的左边。
3、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处（注意不要把胶盖烧焦），滴管（前端90%部位）灼烧。细胞培养瓶倾斜，用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中，尽量吸干净。注意：滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培养瓶内，避免产生气泡，且不要伸入瓶内太多，防止造成污染；滴管尖端悬空弃液，不要触到废液碗（要亲眼看到弃液，防止滴管尖端触到废液碗）！
4、用吸培养基的滴管吸取培养基90滴加入到培养瓶（25c㎡）中，再用吸FBS（胎牛血清）的滴管吸取FBS 10滴加入到培养瓶中。（使FBS浓度为10％）
5、旋紧细胞培养瓶盖后，再旋回半圈，以利于空气流通。平放回CO2培养箱中。
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
（1）在打开培养基、FBS（胎牛血清）、培养瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖，严格注意无菌操作。灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开。
（2）镊子每次使用前均需灼烧。装FBS的瓶子瓶盖小，用镊子夹住盖子灼烧后，再用其夹住瓶盖盖上；取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。
（3）滴管在第一次使用前也需灼烧。注意：除吸取细胞液的滴管外，其他滴管滴加液体时都要悬空滴加。已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧！滴管千万不能混用！
（4）培养瓶口不要对着自己，不加试剂时要平放。
（5）培养液以没过细胞为宜。
（6）细胞液颜色变黄，死细胞多时换液。不要求每天换液，容易增加污染机会。
3.4 &细胞计数
（1）计算细胞数目用血球计数盘计数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2&0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
& &&&&&&&&&&&&&细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4&104
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
2、计数方法：
(1) 75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板，再用干纱布或棉签再擦一遍，放好盖玻片。
(2) 用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边，再用加样枪吹打混匀该滴液体，从中吸取13ul至盖玻片边缘（注意不要溢出，不要有气泡）。
(3) 观察计数：压线的记左不记右，记上不记下；成团的细胞只记为1个；先用低倍镜（红色，4&）找出大位置，再用中倍镜（黄色，10&）进行计数。
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4&104
(4) 计数完毕用75%酒精棉签擦盖玻片及计数板，再用干纱布（或干棉签）擦一遍。
3.5 &细胞传代
1、紫外线照台30min，准备好细胞培养所需物品。
2、取灭菌试管1支，配完全培养基（含10%FBS）3ml（培养基:FBS=54滴：6滴）。
3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液。
4、胰酶消化：加入约1ml（20滴）胰酶到培养瓶里消化。胰酶铺平培养瓶底为佳。倒置显微镜下观察培养瓶内细胞，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，把细胞培养瓶放入CO2培养箱让残存的胰酶继续消化，（在37℃胰酶消化效果最佳）。
5、每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆，透亮，细胞间隙明显增大时,用吸细胞液的滴管从试管中吸取事先配好的完全培养基3ml加入到培养瓶中终止消化。
6、用吸细胞液的滴管轻柔吹打，保证培养瓶底的每个角落都吹打到，斜坡处不能忽略（可以把滴管卡在瓶口处吹打斜坡处。吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害；需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害。新学者可固定每个角落包括斜坡处吹打5次，靠近瓶口端处的角落也要吹到），把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入试管中，再用滴管吹打混匀细胞悬液。
7、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验，观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略。如需进一步进行铺板则一定要计数！）
8、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等，一般按照1：5比例进行传代。先用滴管吹打混匀3ml（60滴）细胞悬液，取12滴细胞悬液到培养瓶中，补足完全培养基（培养基:FBS=9:1）使液体总体积达到4ml，平放到CO2培养箱中继续培养。
9、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。&
（1）对于难消化的细胞（如Bxpc-3胰腺癌细胞）在用胰酶消化前，先用1～2ml（即20～40滴，或1～2滴管）4 ℃PBS冲洗一遍，较易消化的细胞不需要此步骤。
（2）一定要防止细胞过消化！因过消化，使细胞成团，不均匀，且对细胞伤害很大，影响细胞贴壁和导致生长状态差等。
* 过消化特征：
a.在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落，胰酶里出现很多悬浮物，为掉下来的细胞。
b.培养瓶底板上本身为白茫茫（细胞贴壁生长），而过消化后细胞脱壁掉下来，则可见培养瓶底板有一片片空隙。
（3）过消化的处理：不吸出胰酶，立刻加入3ml完全培养基终止消化后一并收集入试管中，经过800 rpm 离心3min，弃去上清（失活的胰酶、培养基、FBS）。细胞沉淀（白色沉淀物）在试管底，用手指轻弹打散细胞，重新加入适量完全培养基，混匀后放入培养瓶中继续培养。
（4）在加入未经37℃温育的胰酶（指仅为室温）消化细胞时，即使细胞已经变圆，且透亮，用完全培养基终止消化后仍很难吹打下来。那是因为胰酶的温度不适宜；而应该把残留有胰酶作用的培养瓶放到CO2培养箱中，放置5min,让胰酶在其最佳温度(37℃)下消化细胞。
（5）把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时，每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体，以防止细胞成团不均，影响在培养瓶中生长。
（6）用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害，故应轻柔吹打并尽量减少气泡产生。
（7）吹打结束使细胞尽量分离成单个细胞为宜。
（8）完全培养基为含有10％FBS（胎牛血清）的培养液（基）。
（9）小牛血清使用范围：5～20%，10%最常用。血清可控制细胞生长速度，若想减慢细胞生长速度可减少血清浓度，反之亦然。对于刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，则血清用20%。
（10）一般25c㎡培养瓶需培养液5ml，通常需90滴培养基+10滴胎牛血清（FBS），一滴液体体积为50ul,即20滴为1ml。
（11）一般细胞生长铺至瓶底约80%，则可传代或用来做实验，否则细胞进入生长平台期进而缺少营养而状态老化，不易用于后续实验。
3.6 &细胞铺板（如12孔板）
1、紫外线照台30min，准备好细胞培养所需物品。
2、在灭菌试管1中配完全培养基3ml（培养基:FBS=54滴：6滴）
3、消化同前，注意防止过消化。吹打混匀计数，如为：8.0&10 5个/ml
4、稀释细胞悬液：根据经验，细胞密度0.8&10 5个/ml较合理，因每孔需加培养液1ml，共需12ml,分2次，每次6ml（因试管体积有限，6ml即120滴），则配制细胞悬液： 8.0&10 5个/ml &x ml = 0.8&10 5个/ml & 6ml，x=0.6ml&
即 &&细胞原液：&0.6ml&20滴/ml=12滴
完全培养基： 6ml-0.6ml=5.4ml （5.4&20滴=108滴）
97滴培养基+ 11滴FBS
故取12滴细胞悬液、108滴完全培养液加入试管中。用吸细胞液的滴管吹打混匀细胞悬液。
5、在超净工作台里打开细胞板，铺板，注意无菌操作。每孔1ml(20滴)，分4次滴加，每次5滴，按顺序依次滴入。注意：每次从试管中吸细胞悬液时都应吹打以使细胞均匀！
6、继续稀释细胞悬液6ml，操作同前。
7、加完之后，小心平稳地将培养板放入培养箱内，静置5min后，在显微镜下观察细胞是否铺均匀，如不均匀，将影响后续实验，则需在细胞板内吹打混匀细胞：因孔内细胞悬液1ml，采用700ul枪吹打（不能用滴管，会刮花底面），可以轻轻抵着底面往各个方向吹打。
注意：小心吹打，最好不要起气泡，否则会导致细胞不均，且影响观察。吹打后放倒置显微镜下观察，若不够均匀，继续吹打。将细胞板拿出操作台时需盖板盖，避免污染。
8、吹打完毕后，小心将细胞板放CO2培养箱培养。（注意：拿细胞板避免晃动，最好直拿直放，不要推动移动，否则细胞容易成团。）
9、清洁操作台面，用75%酒精喷洒操作台，擦台。
&注意：（1）若铺96孔板，则需在96孔板周围一圈孔中加入PBS，防止干燥。
&&&&&&&&&&&&&&（2）各种不同规格板的铺板细胞数量：&&
3.7& 细胞冻存
1、冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。欲冷冻保存之细胞应在生长良好（log phase）且存活率高之状态，约为80&90％致密度。
2、依细胞传代培养之操作，收集培养之细胞于试管中，取少量细胞悬浮液，计数细胞浓度，一般冻存细胞浓度约1～5&106 cells/ml，依细胞种类而异。
3、用试管塞塞住试管，配平，800 rpm 离心3min，去除上清液，加入适量完全培养液，使细胞浓度为1～5&106cells/ml，混合均匀。
4、吸取16滴细胞悬液到冻存管中，再加入2滴FBS，2滴DMSO（二甲基亚砜，为细胞冻存保护剂），使FBS浓度为20%，DMSO浓度为10%。盖紧冻存管盖，在壁上标记好冻存细胞名称、冻存年月日。
5、把冻存管放到-70℃冰箱程序降温盒中24小时（勿超过1周），然后转移到-196℃液氮罐中长期保存。
（1） 注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
（2）冷冻保存之细胞浓度：
①normal human fibroblast:1～3&106cells/ml
②hybridoma：1～3&106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherent tumor lines：5～7&106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3&106cells/ml
④other suspensions：5～10&106cells/ml，human lymphocyte须至少5&106cells/ml。
（3）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
（4）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，且能以较快的速度渗透到细胞内，故冻存细胞时使用室温下的DMSO，在冻存的细胞复温后，应及时洗涤冷冻保护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO对细胞产生毒性。
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细胞培养的一代生长过程如何
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你应该是指动物细胞培养吧（植物的话我们叫做植物组织培养和植物体细胞杂交）.原代培养的过程就是动物细胞培养的第一代细胞.原代培养是这样的：取出动物胚胎或者幼龄动物组织或器官后用胰蛋白酶使其分散为单个细胞,然后配置成一定浓度的悬浮液放入培养瓶（其液体培养基含动物血清）中置于培养箱中培养.原代培养的特点是：细胞贴壁生长.所以,随着细胞的生长和增殖,要定期的用胰蛋白酶把细胞从细胞壁上脱离下来,进行下一步的培养.
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扫描下载二维码胰酶消化细胞时胰酶加入的比例
是的.胰酶的作用就是：分解细胞间的胶原蛋白,使得细胞分散开来. 再问： 那去除胰酶时会倒去一部分细胞吧？ 再答： 去除胰酶，不是直接倒去的。加入胰酶抑制剂就可以了，就可以终止胰酶对细胞的过度消化。 如果倒的话，会倒掉很多细胞的。再问： 那是不是再加入培养液后，脱落的细胞又会贴壁生长，再次传代吸取旧培养液时将上次加的胰酶
细胞之间是通过CAM（细胞粘性分子）相连的,而很多粘性分子只有在有+2价金属离子,如Ca2+,Mg2+,的存在下才能行使这种功能.在胰酶中加EDTA的作用是熬合这些二价离子,使细胞被消化成单细胞形态 再问： 首先谢谢您的回答。 还想再请教下，EDTA的浓度提高到多少比较好呢，我的细胞消化后不易形成单个，是不是需要底稿下
如果含有EDTA,是应该去除胰酶的.操作步骤应该是加入培液终止消化反应,轻轻吹打细胞,转入离心管,离心,去上清,再用培液悬浮细胞,分装到培养瓶中.
除了胰酶还有胶原酶I型,II型,III型等,还有透明质酸酶,主要根据不同的细胞类型选择不同的消化酶.
在显微镜下看,大约一半细胞变圆,另一半开始变圆.加培养液终止消化,然后用吸管反复吹吸就可以把贴壁的细胞吹下来.
血清终止的原理其实是竞争抑制.就是用过量的牛血清中含有的蛋白来和胰酶结合.不给胰酶消化细胞蛋白的机会.培养液中有什么一般没有关系,因为你消化无非是为了细胞传代,培养液终归是要弃去的.除非你要对培养液做成分分析,那可能会影响结果.
胰蛋白酶的酶切位点是肽链的Lys和Arg两个残疾的羧基端肽键,血清的加入可使酶饱和,严格上说不是竞争性抑制,因为血清蛋白不是抑制剂,还是底物!
细胞消化成团个人认为是和消化酶有关,消化酶是否保存不当（主要为温度）并且时间过长失去了消化活性（可以做酶活测定）,或者酶的浓度配的不合适,在允许范围（防止消化过度损伤细胞）内适当加大酶液量.以上是某f发表的一些浅见解.关于第二个有大量细胞脱落,我想是没有做好及时的细胞传代,细胞汇合80%（理想）就应该进行传代,因为在培
组织是多细胞的,胰蛋白酶处理后,形成分散的多细胞,也就是分散成单个细胞了,便于制备细胞悬浮液
但是传代的细胞出现很多细胞团,不知道原因出现在那?请高手指教谢谢!消化后有细胞团,是正常现象.如果细胞团过多,可能是消化时间太短,再是消化过程尽可能不晃动培养皿/瓶,防止细胞成片脱落成团.另一个解决办法是消化后将细胞悬液取出移至离心管或试管内,反复用力吹打,可以使细胞团散开.zgxsea wrote:消化后有细胞团,是
可能是胰酶没有预热；也可能是细胞太密集了,或者营养过剩,细胞贴壁过紧! 再问： 我觉得细胞是有点密了，我们平时用1ml胰酶,细胞瓶是小细胞瓶，如果遇到这种情况，可以增加胰酶用量吗？
博凌科为1．贴壁细胞 ,让细胞自己在盖玻片上爬片.操作如下：A.取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间,无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍,再用细胞培养液洗涤一遍.将盖玻片置于六孔板内,种入细胞培养过夜,使约为50%-80%满.B.刺激细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入0.5m
消化以后好像就是要吹打吧……不过不应该是絮状的,絮状的有可能是细胞间质粘在一起使细胞成团,反正听你的描述,细胞状态是不好了……有的时候出现絮状的话,细胞就不容易贴壁,一消化细胞就成片的下来了,有的时候支原体污染也容易出现絮状沉淀.再养养看看吧,实在不行就弃了再复苏吧.
A.淀粉水解时消耗水,而不是产生水,水是来自葡萄糖被氧化B.被细胞结合的应该是结合水,自由水是在组织液,血液中游离的水C.生理盐水主要是为了补水,加点无机盐是为了维持内环境平衡,因为体液含无机盐0.9%
胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,血清中含抗凝血酶Ⅲ,是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂.因此血清可抑制对胰戴白酶的消化作用.而胰脂肪酶的催化部位主要由催化三联体组成,即组氨酸,色氨酸,天冬氨酸,我目前没有查到血清对胰脂肪酶的抑制作用.希望共同探讨.
这些都会被分解成能直接吸收的小分子物质通过蛋白质酶、解旋酶等作用下一步一步在消化器官中不断分解后吸收
细胞培养液中是不可能含有EDTA的,EDTA会螯合Ca2+和Mg2+,而钙镁离子是细胞贴壁和正常生长所必须的.而胰酶中一般含有EDTA,目的是螯合掉培养基中的这两个离子,防止钙镁离子抑制胰酶活性,以便胰酶将细胞消化下来.
A、间期的时间长，占到细胞周期的90-95%，则视野内看到的细胞最多，故A正确；B、有丝分裂的前期细胞出现染色体和纺锤体，核膜和核仁解体，但占细胞周期的时间短，故B错误；C、中期时染色体的着丝点排列在赤道板上，是观察染色体数目的最佳时期，但占细胞周期的比例小，故C错误；D、末期时细胞出现核膜和核仁，染色体和纺锤体消失，
一、有丝分裂各时期的特点细胞以分裂的方式进行增殖,而有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式.为了研究方便,人为的把分裂期分为四个时期,即前期、中期、后期、末期.下面以植物细胞为例简单介绍各个时期细胞所发生的变化及特点.间期：主要特征是完成DNA的合成、复制,以及RNA和蛋白质的合成,为分裂期的细胞提供物质准备.同时,
硼砂是一种有毒物质,人食用到一定量时,可引起脑、肝、肾脏及皮肤黏膜的损害,严重的可发生休克,不应食用.卫生部也早已明令禁止在食品中添加四硼酸钠（硼砂）.据了解,民间包粽子一般会加入硼砂,这是因为硼砂具有防腐、增加弹性和膨胀等作用,按赣州人的说法是吃起来更有嚼头.但是,硼砂进入人体经胃酸作用变成硼酸,在体内积蓄,妨碍消化& 实验与探究知识点 & “（14分）生长因子通常是指具有刺激细胞生...”习题详情
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（14分）生长因子通常是指具有刺激细胞生长的多肽类物质，主要通过与细胞膜上特异性的受体结合，来调节细胞生长及相关的功能。请根据以下提供的实验材料与用具，来研究内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PIGF）对小鼠干细胞分化的影响，完成以下问题。实验原理：VEGF和PIGF均能促进干细胞生长，干细胞分化后细胞内&&&&会明显增加，可用&&&&判断干细胞是否分化。实验材料：怀孕的小鼠，干细胞培养液、VEGF试剂、PIGF试剂、生理盐水、细胞培养瓶、检测试剂盒、CO2培养箱等。（要求与说明：答题时不考虑加入试剂后的体积变化等误差。）实验思路：（1）在&&&&条件下，取出小鼠胚胎的肝脏，用机械法剪碎至1mm3大小的组织块，再用适当的方法获得干细胞悬浮液。（2）取动物细胞培养瓶，平均分成若干组，并标号，每组设置若干个重复，每个培养瓶&&&&。（3）&&&&。（4）在&&&&中培养一段时间后，用试剂盒检测培养液中Akt蛋白含量，统计并分析所得数据。预测结果：请用柱形图表示支持VEGF试剂和PIGF试剂能共同促进小鼠干细胞分化的实验结果。Akt蛋白含量&&&试剂盒检测Akt蛋白含量（1）无菌&&&&（2）加入适量且等量的干细胞培养液（3）A组：培养液中加适量干细胞悬浮液；B组：培养液中加等量干细胞悬浮液+VEGF；C组：培养液中加等量干细胞悬浮液+PIGF；D组：培养液中加等量干细胞悬浮液+VEGF+VEGF&（4）CO2培养箱 预测结果：请用柱形图表示支持VEGF试剂和PIGF试剂能共同促进小鼠干细胞分化的实验结果。（画在下框内）&
本题难度：一般
题型：解答题&|&来源：2013-浙江省临安中学高三上学期10月月考生物试卷
分析与解答
习题“（14分）生长因子通常是指具有刺激细胞生长的多肽类物质，主要通过与细胞膜上特异性的受体结合，来调节细胞生长及相关的功能。请根据以下提供的实验材料与用具，来研究内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PIGF）对...”的分析与解答如下所示：
试题分析：实验原理：在实验思路中提出“培养一段时间后，用试剂盒检测培养液中Akt蛋白含量”，故推测干细胞分化后细胞内Akt蛋白含量会增加，可用试剂盒检测Akt蛋白含量判断干细胞是否分化。⑴动物细胞培养时，需在无菌条件下进行。⑵本实验的目的是看不同条件下小鼠干细胞分化情况，应在培养瓶中加入适量且等量的干细胞培养液。⑶本实验为研究内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PIGF）对小鼠干细胞分化的影响，故单一变量应是内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PIGF）的不同。即A组：培养液中加适量干细胞悬浮液；B组：培养液中加等量干细胞悬浮液+VEGF；C组：培养液中加等量干细胞悬浮液+PIGF；D组：培养液中加等量干细胞悬浮液+VEGF+VEGF。⑷把处理不同的各组细胞放在CO2培养箱进行培养，然后观察细胞生长分化的情况。预测结果：因实验原理中指出“VEGF和PIGF均能促进干细胞生长”，且在预测结果中提出“支持VEGF试剂和PIGF试剂能共同促进小鼠干细胞分化”故小鼠干细胞分化的分化程度依次是A&B=C&D，具体图解见答案。考点：本题考查动物细胞培养的相关实验，意在考查考生具备验证简单生物学事实的能力，并能对实验现象和结果进行解释、分析和处理。
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等考点的理解。
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实验与探究
与“（14分）生长因子通常是指具有刺激细胞生长的多肽类物质，主要通过与细胞膜上特异性的受体结合，来调节细胞生长及相关的功能。请根据以下提供的实验材料与用具，来研究内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PIGF）对...”相似的题目：
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