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长链非编码RNA(lncRNA，lincRNA)数据库资源列表
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的确是好东西 本来实验室准备自己建这样的库 看来直接用你这个就行了
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一个植物的lncRNA数据库：PLncDB:植物长非编码RNA数据库. 网址：
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感兴趣，学习~
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的链接坏了，如楼主有找到新的网址，烦请告知！万分感谢！
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好贴，顶一个先
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有人会用NERD数据库的参数设置么？
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谢谢，好东西！
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好东西，感谢
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感谢楼主！！！
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多谢楼主分享！
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正需要这个，太谢谢了
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怎么更新时间不是很近呢？
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多谢楼主分享！UCSC也是很不错的
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不错 不够lncRNA更新很快
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人全长lncRNA克隆
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请问大家怎么预测lncRNA的靶基因啊？求分享经验啊。。。我也看了些资料，但是还是很迷茫，求一起交流
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谢谢分享。
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好帖，收藏。谢谢。投你一票。
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看看。。。。
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看看。。。谢谢
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没啥用，打广告的
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楼主请问一下，国内哪个公司lncRNA做得最好呢？
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收藏了，谢谢
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请教前辈，已知某个microRNA的功能，怎么找他的相关lncRNA呢？还有ceRNA 呢？
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关于丁香园生物研发服务 >>
服务名称： LncRNA实时定量PCR技术服务
英文名称： LncRNA-qPCR Service
简介：康成生物为您提供LncRNA实时定量PCR技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，康成生物专业的技术服务人员就可替您完成LncRNA实时定量PCR实验操作和数据分析，提供给您完整的实验报告。
参考报价：免费咨询800-820--5058
最后更新：
产品类别：
总点击数：406
本半年点击数：42
&&LncRNA实时定量PCR技术服务
& & LncRNA是目前生命科学以及医学研究领域中的研究热点之一。由于LncRNA具有一些重要的分子特征，在进行实时定量PCR检测的时候需要更为精细的实验设计:
&&& 可变剪接：大部分的LncRNA在成熟过程中，经过剪接步骤。一些LncRNA在这个过程中形成剪接异构体，这些异构体的表达具有组织特异性，其中部分具有不同甚至相反的生物学功能，因此需要对LncRNA进行转录本特异的检测。
&&& 长链反义非编码RNA（long antisense ncRNA）：大约50%的蛋白编码基因的基因组区域能够转录形成长链反义非编码RNA. 这些RNA分子转录方向和蛋白编码基因相反，没有蛋白编码能力，是LncRNA的重要组成部分。 sense转录本和antisense转录本可能具有不同的生物学功能，然而基于oligo（dT）或随机引物的标准RT-PCR方法缺乏链特异性，不能将两种转录本进行有效区分，得到的数值是两个转录本的总表达量。如图所示：经过第一轮PCR 反应后，sense转录本和antisense转录本产生相同的双链DNA产物,下游的PCR 反应无法进行区分。
*图释：&&应用oligo (dT) 和随机引物的RT-PCR反应不具有链特异性
康成生物为您提供LncRNA 实时定量PCR技术服务，通过转录本特异性的引物设计以及链特异性的RT步骤解决LncRNA PCR检测中的难点。高效，专一地精确定量样品中的LncRNA表达量。您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，康成生物专业的技术服务人员就可替您完成LncRNA实时定量PCR实验操作和数据分析，提供给您完整的实验报告，为您节省大量的时间和精力。
康成实例-1--- LncRNA qPCR&
&&& Dlx-5/6超保守区域转录形成两个剪接异构体LncRNA: Evf-1和Evf-2. Evf-2能够和Dlx-2蛋白结合形成稳定的复合物，进而刺激Dlx-5和Dlx-6的表达；而Evf-1功能未知。为了精确检测这两个LncRNA，我们在可变剪接位点设计了转录本特异的引物。如图2所示。
*图释：Evf-1和Evf-2的引物设计。绿色箭头代表的引物针对Evf-1设计，紫色箭头代表的引物针对Evf-2设计，红色的引物位于两个转录本共有的部分是非特异性引物所以不被选用。
康成实例-2--- LncRNA qPCR
&&& BACE1是是阿兹海默症病理学中的关键酶，催化A&蛋白形成，在阿兹海默病人的样品中表达量上升。BACE1基因DNA反义链上转录形成LncRNA& BACE1-AS. 细胞和活体实验证明 BACE1-AS具有调控BACE-1 mRNA稳定性的功能，因此能促进BACE-1蛋白的表达。准确检测BACE1-AS的表达量，是研究该LncRNA分子功能的关键。链特异性地RT反应，仅将靶标转录本（BACE1-AS）反转录成cDNA, 排除了反义链转录本带来的干扰。
*图释：&在RT步骤中选用链特异性地引物，仅检测BACE1-AS。
康成生物LncRNA实时定量PCR技术服务流程：
1.&引物设计、合成及测试
&&& a. 从权威数据库（Refseq, UCSC known gene, ensemble, 相关文献）中得到非编码RNA的序列，屏蔽SNP及重复序列。
&&& b. 在引物设计软件中，调整引物的设计位点，将引物设计在转录本特异的区域，如： exon-exon的连接点附近。然后根据PCR的反应条件，优化引物参数，如 Tm值，产物大小，二级结构，引物二聚体等。
&&& c.& 通过和数据库blast比对，降低引物非特异性扩展的可能性。
&&& d. 通过实验对引物的扩增效果进行测试。
2.&样品RNA抽提及RNA质量检测
&&& a． 紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值，获得RNA的浓度并通过 A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。
&&& b． 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。
3.&逆转录合成cDNA
&&& 利用链特异性的反转录引物进行RT反应，合成cDNA。
4. 实时定量PCR
&&& 以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增。同时检测每个样品中内参基因的表达量，校正上样误差。
5. 分析结果、提供实验报告
&&& 分析实时定量PCR结果，提供实验报告，包括详细的实验方法，实时定量PCR实验数据和图表。
上海康成生物工程有限公司&
地址：上海市漕河泾高新技术开发区虹漕路421号63号楼2楼&
免费热线：400-886-5058 ; 800-820-5058（座机）
电话：021-&&&&&&&&&传真：021-
康成生物工程有限公司（简称&康成生物&） 自2002年起专注于生物芯片技术服务，是国内最早一批专业提供生命科学前沿研究技术的高科技企业。总部位于上海，目前已在国内成立了10多家办事处，主要致力于为生命科学和临床医学等领域开发和提供创新性基因芯片、DNA高通量测序等产品和技术服务。
康成生物以lncRNA、small RNA、表观遗传学相关检测技术作为核心研发方向，依靠自身优秀的研发、技术、营销和服务团队，凭借国际领先的技术平台和高标准的质控体系，为广大科研学者提供高通量生物芯片、测序技术服务，以及行业应用整体解决方案。康成生物是Arraystar、Agilent、Exiqon、SABiosciences等国际知名芯片品牌的服务代理商。其中，作为Arraystar公司中国地区唯一代理商，目前康成客户采用Arraystar公司lncRNA芯片技术服务发表的SCI论文已超过180篇。
康成生物的产品和技术服务涵盖基因组学、转录组学、表观遗传组学以及蛋白质组学等各个研究领域，为广大科研学者搭建多个最前沿的一站式技术平台。
【生物芯片技术平台】LncRNA芯片、LncPath&芯片、环状RNA芯片、T-UCR芯片、microRNA芯片、piRNA芯片、全基因组表达谱芯片、DNA甲基化芯片、DNA羟甲基化芯片、染色质免疫共沉淀芯片、蛋白芯片等。
【高通量测序平台】small RNAs测序系列（microRNA测序、tRF&tiRNA测序、sdRNA测序、piRNA测序等）、RNA测序、DNA甲基化测序、DNA羟甲基化测序、染色质免疫共沉淀测序、人体微生物组测序等。
【实时定量PCR服务平台】nRStar& ncRNA PCR芯片（tRF&tiRNA，tRNA，snoRNA，Functional LncRNA）、miRStar&癌症特异性microRNA PCR芯片、Exiqon microRNA PCR芯片、功能分类PCR芯片、LncRNA实时定量PCR、环状RNA实时定量PCR、microRNA实时定量PCR、mRNA实时定量PCR、MeDIP-PCR、ChIP-PCR等。
康成生命科学实验中心拥有一流的实验设备，专业、经验丰富的实验技术团队和强大的生物信息团队，以专业的知识与优质的服务为广大科研学者提供产品和技术服务，创造科研价值。迄今为止，康成生物与来自中国科学院、香港大学、清华大学、北京大学医学部及附属医院、中山大学医学院及附属医院、上海交通大学医学院附属瑞金医院、复旦大学医学院附属中山医院、华中科技大学同济医学院附属协和医院、Novartis（诺华）、gsk（葛兰素史克）等1000多家国内一流科研院所、医疗机构及跨国医药集团建立了长期合作关系，合作发表的SCI文章已超400篇，其中包括lncRNA领域180余篇、microRNA领域120余篇，分别发表在Nature Medicine、Nature Genetics、Nature Immunology、Molecular Cell、Circulation、Hepatology等国际顶级期刊。
促进生命科学研究技术的发展与创新。
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LncRNA-HIT在肿瘤中的表达及临床意义的研究
长链非编码RNA(lncRNA）是长度超过200nt，没有开放阅读区、缺乏蛋白编码能力的一类转录物。LncRNAs在细胞生物过程中发挥广泛的作用，如细胞生长、生存、迁移、侵袭和分化等。肿瘤的发生、发展是多因素多步骤的演变过程，上皮细胞间质化(MET)是其中一个重要过程，大量研究表明lncRNAs在其中发挥了重要作用。　　目的:　　本次实验旨在筛选与MET相关的一种新长链非编码RNA并研究其在相关肿瘤中的表达及其临床意义。　　方法:　　(1)采用昂飞人全基因组表达谱芯片检测经空载体或TGFβ处理大鼠乳腺上皮细胞系（NmuMG细胞系）后lncRNAs的表达情况。　　(2)通过基因芯片信号的分析和基因位点分析确定LncRNA-HIT(AK020562)为研究对象。　　(3)RT-qPCR验证lncRNA-HIT在TGFβ诱导的NMuMG细胞中的表达。　　(4)利用BLAST分析软件评估lncRNA-HIT在人体中的保守性，及种间同源基因定位于同一区域的可能性。　　(5)利用组织芯片(TMA)和锁核苷酸原位杂交(LNA-ISH)的实验方法检测lncRNA-HIT在89例乳腺癌组织（15例侵袭性，74例非侵袭性）和4例正常组织及9例异型增生乳腺组织中的表达。　　(6)利用组织芯片(TMA)和锁核苷酸原位杂交(LNA-ISH)的实验方法检测lncRNA-HIT在392例肺癌组织中的表达。　　结果:　　(1)在NmuMG中TGFβ诱导EMT后，633个lncRNAs表达下调，680个lncRNAs表达上调。在表达上调的lncRNAs中，AK020562定位于HOXA基因簇中，并且被TGFβ显著地诱导，因此我们将其列为研究对象，并命名为lncRNA-HIT(HOXAtranscript induced by TGFβ)　　(2)人类lncRNA-HIT与大鼠lncRNA-HIT具有很好的保守性　　(3) lncRNA-HIT的表达在人类乳腺正常组织、异性增生组织、非侵袭性乳腺组织、侵袭性乳腺癌组织中的表达不断上升。　　(4) lncRNA-HIT的表达与肺癌的病理类型相关　　(5) lncRNA-HIT与早期（Ⅰ-Ⅱ期）肺癌患者的复发相关，晚期(Ⅲ-Ⅳ)期肺癌患者的复发无关，P均＜0.05。　　(6) lncRNA-HIT与早期肺腺癌的无病生存期和总生存期相关。　　结论:　　lncRNA-HIT在TGFβ处理NmuMG细系所诱导的MET中过表达，在人类乳腺正常组织、异性增生组织、非侵袭性乳腺组织、侵袭性乳腺癌组织中的表达不断上升，说明lncRNA-HIT在乳腺癌的发生发展中发挥着一定作用。lncRNA-HIT的表达与早期肺癌、淋巴结转移阴性的肺腺癌的复发和早期肺腺癌的预后相关，说明lncRNA-HIT可能与早期肺癌的耐药性及发生发展相关。总之，lncRNA-HIT作为新发现的一种长链非编码RNA，具有肿瘤治疗靶点和早期诊断分子标记物的潜力，其在肿瘤中的作用及作用机制还需进一步研究。
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杨歆，黎伯胜，胡长江，邓西尹，游扬，常杏，杨仕明，凌贤龙. 血清中lncRNA HOTAIR检测方法的建立及其在结肠癌诊断中的应用价值[J]. 第三军医大学学报, ):
Yang Xin, Li Bosheng, Hu Changjiang, Deng Xiyin, You Yang, Chang Xin, Yang Shiming, Ling Xianlong. Establishment of detection method of serum lncRNA HOTAIR level and its significance in diagnosis of colon cancer[J]. J Third Mil Med Univ, ): .
血清中lncRNA HOTAIR检测方法的建立及其在结肠癌诊断中的应用价值
杨歆, 黎伯胜, 胡长江, 邓西尹, 游扬, 常杏, 杨仕明, 凌贤龙&&&&
400037 重庆，第三军医大学新桥医院消化内科
通信作者：凌贤龙，E-mail：
摘要：目的 建立血清中长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)
HOTAIR的检测方法及评价其在结肠癌诊断中的作用。
收集结肠癌患者血清样本47例，正常志愿者血清样本40例，10对结肠癌及癌旁组织。采用TRIzol LS和TRIzol分离组织和血清中的RNA；采用qRT-PCR检测HOTAIR在组织及血清中的表达。
结果 结肠癌组织或结肠癌患者血清中HOTAIR的表达显著高于癌旁组织或正常志愿者(P<0.05, P<0.01)，且TNM Ⅲ/Ⅳ期的结肠癌患者血清中HOTAIR的表达高于正常志愿者(P<0.05)，Ⅲ/Ⅳ期显著高于Ⅰ/Ⅱ期 (P<0.01)；淋巴结转移及非转移的结肠癌患者血清中HOTAIR的表达均显著高于正常志愿者(P<0.01)，且淋巴结转移患者显著高于非转移患者(P<0.05)；血清中HOTAIR的表达值诊断结肠癌的敏感性为65.96%，特异性为85.00%，曲线下面积为0.741 0；血清中HOTAIR的表达与CA199值呈显著正相关(P<0.01, R2=0.147 1)。
结论 成功建立血清中HOTAIR的检测方法，血清中HOTAIR的高表达可能作为诊断结肠癌的生物标志物。
HOTAIR&&&&
结肠癌&&&&
血清&&&& 生物标志物&&&&
Establishment of detection method of serum lncRNA HOTAIR level and its significance in diagnosis of colon cancer
Yang Xin, Li Bosheng, Hu Changjiang, Deng Xiyin, You Yang, Chang Xin, Yang Shiming, Ling Xianlong
Department of Gastroenterology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037, China
Corresponding author: Ling Xianlong, E-mail:
Abstract: Objective To establish detection method of lncRNA HOTAIR expression in serum and access its significance in the diagnosis of colon cancer.
Methods In total, 47 serum samples from identified colon cancer patients, 40 serum samples from healthy subjects and 10 pairs of colon cancer tissues and tumor-adjacent tissues were collected. Total RNAs were isolated from the serums and tissues by using TRIzol LS and TRIzol reagents. The HOTAIR expression in the serums and tissues was measured by qRT-PCR.
Results The HOTAIR expression was significantly higher in the colon cancer tissues or serums of patients with colon cancer than in the tumor-adjacent tissues or serums of healthy subjects (P<0.05, P<0.01). Furthermore, the colon cancer patients with TNM stage Ⅲ/Ⅳ had significantly higher serum levels of HOTAIR than the healthy subjects (P<0.05), and the patients with TNM stage Ⅲ/Ⅳ had significantly higher serum levels of HOTAIR than ones with TNM stage Ⅰ/Ⅱ (P<0.01). Moreover, the colon cancer patients with or without lymph node metastasis had significantly higher serum levels of HOTAIR than the healthy subjects (P<0.01), and the patients with lymph node metastasis had significantly higher serum levels of HOTAIR than ones without lymph node metastasis (P<0.05). The sensitivity and specificity of serum HOTAIR in the diagnosis of colon cancer were 65.96% and 85.00%, respectively, and the area under the receiver-operating characteristic curve (AUC) was 0.741 0. A positive correlation was observed between serum HOAIR and CA199 (P< 0.01, R2=0.147 1).
Conclusion The method for the detection of serum HOTAIR is successfully established, and the serum HOTAIR may serve asanovel noninvasive biomarker for the diagnosis of colon cancer.
Key words:
HOTAIR&&&&
colon cancer&&&&
biomarker&&&&
结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一[]。早期结肠癌患者5年生存率可达90%，但对于晚期结肠癌，患者生存率仅为10%～15%[]。因此，提高结肠癌早期诊断的效率是减少结肠癌患者死亡的关键环节。目前用于筛查结肠癌的分子标志物主要为糖链抗原(carbohydrate antigen,CA)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)等。尽管这些分子标志物能较好地诊断晚期结肠癌，但对于早期结肠癌的诊断，其敏感性和特异性均较低[]。
长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA) 是一类长度200~100 000 nt的单链RNA分子，不编码蛋白[]。近年来，大量的研究表明lncRNA的表达失调与肿瘤的复发、转移以及患者的预后密切相关[, , ]。一些研究也指出lncRNA可能作为一类新的诊断癌症的生物标志物，如HOTAIR[]、ncRuPAR[]。已有研究表明在结肠癌组织中上调的lncRNAs，如CCAT1[]、 HOTAIR[]、 H19[]。然而，少有文献报道血清中lncRNA的检测方法以及血清中lncRNA表达谱在结肠癌诊断中的应用[]。因此，本研究拟从已报道的结肠癌组织中高表达的lncRNA HOTAIR出发，分析结肠癌患者血清中HOTAIR的表达及其在结肠癌诊断中的应用价值。
1 资料与方法
1.1 临床资料
纳入标准：(1)年龄20～80岁，患者或家属同意；(2)活检或者手术证实为结肠癌(结肠癌组)；(3)经内镜、CT、病理等辅助检查确定志愿者无结肠癌及癌前病变，无任何恶性肿瘤、感染性疾病、高血压、高血脂、糖尿病等病史。排除标准：(1)接受结直肠癌手术治疗或者放化疗后的患者；(2)转移性结肠癌。样本取自2014年7月至2015年11月期间在第三军医大学新桥医院消化内科与普通外科住院的结肠癌患者及志愿者，在纳入排除标准下共收集到10对结肠癌及癌旁组织，47例结肠癌患者血清及40例正常健康志愿者血清。10例结肠癌组织标本中，男性7例，女性3例，平均年龄63.4(46～80)岁；47例结肠癌血清样本中，男性31例，女性16例，平均年龄58.98(33～80)岁；40例志愿者血清样本中，男性25例，女性15例，平均年龄59.07(26～77)岁。见表 1。对于组织样本，所取癌旁组织与癌组织边缘的距离>5 cm，将组织剪成小块后，立即冻存于液氮中。 对于血清样本，收集患者及志愿者5 mL全血，1 000 r/min离心15 min，吸取血清至1.5 mL无酶离心管中，12 000 r/min离心5 min，吸取血清至新的1.5 mL无酶离心管中，-80 ℃保存。本研究符合第三军医大学新桥医院伦理委员会要求。
各组研究对象的临床资料比较
组别总例数男(例)女(例)平均年龄(岁)CA199(例)分化类型(例)T分期(例)N分期(例)M分期(例)
& 37(U/mL)≥37(U/mL)高中低T1T2T3T4N0N1N2N3M0M1
结肠癌组织标本组107363.4550640235262073
结肠癌血清样本组47311658.98301710261127162213181243710
正常志愿者血清组40251559.07400-------------
1.2 RNA提取
采用TRIzol LS试剂(美国Invitrogen公司) 提取血清中的RNA。按照3 :1的比例加入750 μL TRIzol LS和250 μL 血清样品，加入10 μL 50 nmol/L的Cel-miR-39[]，充分混匀，加入200 μL氯仿，混匀，静置10 mim，12 000 r/min 离心15 min，吸取上清液于另一新的1.5 mL无酶离心管中，加入400 μL异丙醇，混匀，静置8 min，12 000 r/min 离心10 min，弃上清液，加入1 mL 75%乙醇洗涤，7 500 r/min离心5 min，弃上清液，重复离心，用10 μL 移液器汲出多余的乙醇，用20 μL
65 ℃无酶水溶解RNA，冻存于-80 ℃。采用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取组织中的RNA。先用液氮将组织碾碎，按照50~100 mg组织加入1 mL TRIzol的比例加入试剂，混匀，根据试剂说明书进行提取，用35 μL 65℃无酶水溶解RNA，冻存于-80℃。
1.3 qRT-PCR
采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂(大连TaKaRa公司)对总RNA进行逆转录，每20 μL体系逆转录1 μg RNA，逆转录反应试剂及步骤：加入7 μL 60 ng/μL RNA (血清中RNA含量较少，约60 ng/μL)、2 μL 5 × gDNA Eraser buffer、1 μL gDNA Eraser,混匀，45 ℃反应1 min，继续加入4 μL 5×PrimeScript Enzyme Buffer、1 μL PrimeScript Enzyme、1 μL PrimeScript RT Mix，4 μL Nuclease-free H2O，混匀，37 ℃反应15 min，获得cDNAs。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 试剂(大连TaKaRa公司)对合成的cDNA进行扩增，反应体系为10 μL，qPCR反应试剂及步骤：加入 5 μL 2 × SYBR& Premix Ex TaqTM、0.2 μL Primer
Forward (10 pmol/μL)、 0.2 μL Primer Reverse (10 pmol/μL)、 0.2 μL ROX Dye Ⅱ、2.4 μL Nuclease-free H2O，混匀，采用ABI step one进行扩增，反应条件为：95 ℃反应2 min，40个循环于95 ℃反应15 s、58 ℃ 反应30 s，在58 ℃时采集荧光；溶解温度，从58 ℃ 逐渐增加至95
℃，每增加0.5 ℃采集1次荧光。HOTAIR的5对不同区段的引物如下：P1上游引物 5′-CGCTTCGCAGTGGAATGGAA-3′,P1下游引物5′-CC-GTGGCA-TTTCTGGTCTTGT-3′; P2上游引物 5′-AAGACGGGCA-CTCACAGACA-3′,P2下游引物 5′- AGC-GTTCTCTGGGCGTTCAT-3′; P3上游引物 5′-ACAGAGTCCGTTCAGTGTCAGA-3′,P3下游引物 5′-ATT-GGGCTGG-GTCTACACAAGT-3′; P4上游引物 5′-TGC-TTCGTGCTGATTCCTAGAC-3′,P4下游引物 5′- TTGC-TCTGTGCTGCCAGTTAG-3′; P5上游引物 5′- GCCTGAACTTCCTCCTGCTATT-3′,P5下游引物 5′- ACAC-AAAGTGCATACCTACCCA-3′。GAPDH的引物如下：上游 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACG GATT-3′,下游 5′-CTCGCTCCTGGAAGATG GTGAT-3′。Cel-miR-39的逆转录引物及PCR引物均购于上海吉玛公司。
1.4 统计学处理
Mann-Whitney test用于比较结肠癌患者和正常志愿者血清中HOTAIR的表达；配对t检验用于比较结肠癌和癌旁组织中HOTAIR的表达；工作特征曲线(receiver-operating characteristic,ROC)用于分析血清中HOTAIR的表达值在结肠癌诊断中的意义；约登指数用于分析最佳切点值；Pearson相关性分析获得HOTAIR 的表达值与CA199值的相关性；所有统计在GraphPad Prism 6.0 (Graphpad Software Inc,Caligornia)软件上进行。
2.1 LncRNA HOTAIR片段在血清中的表达检测
由于HOTAIR的长度较长(2 370 bp)，可能以片段形式存在于外周血中，所以我们设计了5对引物检测HOTAIR在血清中的表达，这5对引物分别针对HOTAIR的不同区段进行检测(图 1A)。采用这5对引物分别检测5例正常志愿者和5例结肠癌患者血清中HOTAIR的表达，发现Primer 1,4,5均能检测到HOTAIR在血清中的表达，且结肠癌患者血清中HOTAIR的表达显著高于正常志愿者(P<0.05,P<0.01,P<0.01)而Primer 2,3未能检测到HOTAIR的表达(图 1B)。因为Primer 5所检测到的HOTAIR表达差异有统计学意义，所以我们采用这对引物进行后续的研究。
A: 针对HOTAIR全长(2 370 bp)设计5对引物，扩增血清中HOTAIR不同区段的表达；B:引物1，3，5均能检出结肠癌患者及正常志愿者血清中HOTAIR片段的表达，且两者差异有统计学意义；a: P & 0.05, b: P & 0.01,与正常志愿者比较
LncRNA HOTAIR不同区段的引物设计及验证
LncRNA HOTAIR片段在结肠癌患者血清中高表达
为明确采用Primer 5检测的HOTAIR在结肠癌组织及患者血清中的表达，我们收集了10例结肠癌和癌旁组织样本，以及47例结肠癌患者血清和40例正常志愿者血清样本。结果显示，10例组织样本中，8例结肠癌组织中HOTAIR呈显著高表达(P<0.05，图 2A)，且结肠癌患者血清中HOTAIR的表达显著高于正常志愿者(P<0.01，图 2B)。进一步采用工作特征曲线分析，发现血清中HOTAIR的表达值大于13.30时诊断结肠癌的敏感性为65.96%，特异性为85.00%，曲线下面积为0.7410 (图 2C)，提示血清中HOTAIR的表达值可能用于检测结肠癌。
A: 结肠癌组织中HOTAIR的表达 a: P<0.05，与癌旁组织比较；B: 结肠癌患者血清中HOTAIR的表达 b: P<0.01，与正常志愿者血清比较；C: 结肠癌患者血清样本中敏感性和特异性的相关性分析
结肠癌患者血清中LncRNA HOTAIR的表达
血清中lncRNA HOTAIR的表达与结肠癌TNM分期，淋巴结转移及CA-199值相关
为进一步明确血清中HOTAIR的表达在诊断结肠癌中的意义，我们分析了其与患者临床资料的相关性，发现TNM Ⅰ/Ⅱ期与结肠癌患者血清中HOTAIR的表达差异无统计学意义(P=0.106 1)，而Ⅲ/Ⅳ期患者显著高于正常志愿者(P=0.000 2),且Ⅲ/Ⅳ期显著高于Ⅰ/Ⅱ期 (P<0.05，图 3A)。同时，淋巴结转移及非转 移的结肠癌患者血清中HOTAIR的表达显著高于正常志愿者(P<0.01,P<0.000 1)，且淋巴结转移患者显著高于非转移患者(P<0.05，图 3B)。进一步分析血清中HOTAIR的表达与CA199值的相关性，发现二者呈显著正相关(P<0.01,R2=0.147 1，图 3C)。
A:结肠癌患者血清HOTAIR的表达 a: P<0.05,与Ⅰ/Ⅱ期比较; b: P<0.01，与正常志愿者比较；B: 淋巴结转移及非转移的结肠癌患者血清中HOTAIR的表达 a: P<0.05,与非淋巴结转移比较; b: P<0.01，与正常志愿者比较；C: 结肠癌患者血清中CA199与HOTAIR表达值的相关性分析
结肠癌患者血清中LncRNA HOTAIR的表达与临床指标的相关性分析
2.4 血清中lncRNA HOTAIR的表达较稳定
为明确Primer 5检测片段稳定存在于血清中，我们分别行室温放置数天和反复冻融数次后观察HOTAIR片段的稳定性，结果发现，采用Primer 5检测的HOTAIR片段稳定地存在于结肠癌患者血清中(图 4A、B)。
A:不同时间检测结肠癌患者血清中HOTAIR的表达；B: 不同冻融次数检测结肠癌患者血清中HOTAIR的表达
结肠癌患者血清中LncRNA HOTAIR的稳定性分析
近年来，研究表明HOTAIR在消化系统肿瘤中高表达，但少有文献分析HOTAIR在结肠癌组织及患者血清中的表达情况[, , , , ]。Svoboda等[]研究发现HOTAIR在结肠癌患者外周血中呈高表达且与患者不良预后密切相关，但其指出HOTAIR在外周血中的表达尽管差异有统计学意义，但不显著。最近的研究表明，因为lncRNA的长度较长，导致其容易断裂或不稳定，所以可能主要以片段的形式存在于外周血中，而Wang等[]的研究采用多对引物对lncRNA进行扩增后，发现lncRNA的部分片段呈高表达且稳定地存在于外周血中。因此，本研究设计了5对针对HOTAIR不同区段的引物，结果发现Primer 5的扩增效果最为明显，而Primer 2,3都未能检测出HOTAIR在血清中的表达，提示HOTAIR在血清中可能以片段形式存在。
采用Primer 5检测HOTAIR在组织中的表达，发现大部分组织中HOTAIR呈高表达，与其在其他消化系统肿瘤中的表达情况一致，但Svoboda等[]研究表明HOTAIR的表达在结肠癌组织与结肠正常黏膜之间差异没有统计学意义，可能与其采用的结肠正常黏膜组织或扩增引物有关，也可能和我们采用的结肠癌组织样本较少有关。进一步采用较大样本检测发现HOTAIR 在结肠癌患者血清中呈显著高表达，这与Svoboda等[]的研究结果一致，不同的是本研究中HOTAIR的表达在评估结肠癌诊断中有较高敏感性和特异性，提示血清中HOTAIR的高表达可能是诊断结肠癌潜在生物标志，而得出这样的结论可能与不同人群的样本，以及采用不同的PCR引物有关。
本研究进一步分析发现血清中HOTAIR的表达与结肠癌TNM分期，淋巴结转移及CA199值密切相关。Wu等[]研究发现HOTAIR在结肠癌组织中显著高表达，且与淋巴结转移，患者不良生存率等密切相关，并指出HOTAIR的表达影响结肠癌细胞的表皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。这些结论均支持我们的观点，即HOTAIR的表达与结肠癌转移密切相关。不同的是，我们分析结肠癌患者血清中HOTAIR的表达，其意义在于可以通过非侵袭性方式获得HOTAIR的表达值，进而对结肠癌诊断进行评估。本研究还发现血清中HOTAIR的表达与CA199值存在显著的正相关，提示血清中HOTAIR的表达值可能与CA199对结肠癌进行联合诊断，进而提高诊断准确率。
通过对血清中HOTAIR的稳定性分析发现，不管是在室温放置数天或者反复冻融数次的情况下，HOTAIR的表达均比较稳定，表明采用HOTAIR Primer 5 能够稳定地检测HOTAIR在血清中的表达。由于本研究采用的患者样本数量较少，以及收集的样本时间较短，所以其他的临床指标未能分析，以及血清中HOTAIR的表达与患者生存率的相关性未能分析。因此，在下一步研究中，我们将扩大样本量，进一步分析血清中HOTAIR的表达值在诊断结肠癌或患者预后判断中的意义。
综上所述，本研究建立了稳定检测血清中HOTAIR 表达的方法，检测发现结肠癌患者血清中HOTAIR的表达显著高于正常志愿者，且与结肠癌TNM分期，淋巴结转移及CA199值密切相关，提示血清中HOTAIR的表达值可能作为生物标志诊断结肠癌。
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杨歆，黎伯胜，胡长江，邓西尹，游扬，常杏，杨仕明，凌贤龙
Yang Xin, Li Bosheng, Hu Changjiang, Deng Xiyin, You Yang, Chang Xin, Yang Shiming, Ling Xianlong
血清中lncRNA HOTAIR检测方法的建立及其在结肠癌诊断中的应用价值
Establishment of detection method of serum lncRNA HOTAIR level and its significance in diagnosis of colon cancer