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临床蛋白电泳基本技术
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　　1.醋酸纤维素薄膜电泳　　醋酸纤维素是指纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维薄素薄膜。它具有电渗小、分离速度快、分离清晰、血清用量少及操作简便等优点，现已广泛用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白和同工酶等的分离和测定。　　2.凝胶电泳　　凝胶电泳根据支持介质的不同可分为淀粉胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。琼脂糖凝胶孔径较大，对蛋白质一般不起分子筛作用，适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等。聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛作用，有更高的分辨率，普遍用于分离蛋白质及小分子核酸。　　3.等电聚焦电泳（isoelectricfocusing,IEF）　　等电点是蛋白质的一个重要性质，测定等电点的方法是在不同pH条件下测量蛋白质的电泳迁移率，然后用迁移率对pH作图，对应于迁移率为零的pH就是蛋白质的等电点。按照蛋白质等电点不同而进行分离的电泳方法称为蛋白质等电聚焦电泳。由于其分辨率可达到0.01pH单位，故特别适用于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。　　4.毛细管电泳（capillaryelectrophoresis,CE）　　毛细管电泳是八十年代初发展起来的一类高效、快速分离分析方法。同其它技术相比，毛细管电泳具有分辨率高、塔板数高、选择性好、定量准确、所需样品少等特点。毛细管电泳将电泳载体移到毛细管中后，医学教|育网|收集整理克服了传统电泳的热扩散和试样扩散的难题，大大提高了分析的灵敏度。因而它是一种比传统电泳优越得多的分离分析技术。毛细管电泳可分为毛细管区带电泳、凝胶电泳、等速电泳、等电聚焦和胶束电动色谱等。　　在生命科学中广泛使用的是毛细管区带电泳（capillaryzoneelectrophoresis,CZE）。毛细管区带电泳是近年发展起来的一种高效、快速的液相分离分析技术，有分离选择性高、检测灵敏度高、分离快速、操作简便和易自动化等特点，现已开始在临床实验诊断中得到逐步地应用。
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　|　　|　　|　促进天麻等兰科药用植物种子萌发的真菌酯酶同工酶研究
同工酶是基因表达的产物,可作为遗传学上的一个生化指标。国内外利用酚酶同工酶谱,进行亲缘关系分析,杂种优势预测、植物雄性不育和基因定位等研究,展示了同工酶分析品种差异及遗传规律的可靠性〔‘·“〕。有关同兰科植物共生的真菌,迄今未见同工酶分析应用的报道。对促进兰科药用植物种子萌发有效,而目前尚难以形成子实体的真菌之间醋酶同工酶进行研究,建立各自的同工酶谱,了解其亲缘关系,作为生产应用上评价菌种优劣的参考依据,是非常必要的。材料和方法 l供试菌株 从天麻(GQ材rod记elata)种子萌发的原球茎中分离的02,03,04号菌株「3〕;自见血清(Li娜ris oervosa)及细叶石解(Deodro-biu阴hancockii)种子萌发的原球茎中分离的C3,G4号菌株;、以紫其小菇(M梦e。。050 undieola)为对照〔络3,确定以上菌株与对照的亲缘关系。这些真菌对天麻、石解、白及等兰科药用植物种子萌发均有较好的促进作用。 2样品...&
(本文共4页)
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兰科(Orehidaceae)的天麻(Gastro一材料与方法刁e。。zar。B一)、白菠〔Blet‘Ila striata 1.供试真菌来源、培养及处理:自天麻原 (Thunb.)Rehb.f.〕和石解属(Deod:o一球茎中分离的02(紫箕小菇)、02、03、o’、击iu,Sw·)的多种植物,均为常用中药材。05号菌株;自细叶石解和见血清原球茎中分离由于药用及出口的需要,使有些兰科药用植物的G3、G4号菌株。真菌培养及处理,采用常:过度采挖,资源日渐枯竭。为加速重要兰规方法:液体发酵~收集菌丝体~洗涤~烘干科药用植物快速繁殖,徐锦堂等t1j从天麻原球(8。℃以下)~研碎。茎中分离出12种真菌,并实验证明对天麻种子2.氨基酸测.定:样品水解后用835一50型,萌发有促进作用。其中较优良的紫箕小菇氨基酸自动分析仪测定含量川。 (M夕cena osmund‘cola Lange)已大面积3.蛋白质侧定:微量凯氏(Miero一Kje...&
(本文共4页)
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据文献报道,有些兰科植物的共生真菌,可产生多种糖类江’J、氨基酸类仁“」、核昔酸类等初生代谢产物,并证明是提供给兰科植物生长的营养物质。在某些真菌的次生代谢产物中,曾检测出含有植物激素及其它生理活性的物质萝3」它们对植物的生长发育有促进效果。其中由真菌产生的抗菌素类物质,如青霉素对高等植物种子。一淀粉酶等水解酶的形成〔峨,5],及促进叶绿体色素的合成‘6一”、叶的生长「5,9,、根的形成和生长亡’”,等方面均有显著效应,还可调节植物内源激素的代谢〔”〕。但在兰科植物种子共生真菌的次生代谢产物中,对抗生素的研究尚未见文献记载,作者从几种兰科药用植物种子发芽原球茎中分离的真菌,经试验对种子发芽有良好的促进作用仁‘“]。用壳斗科(Fagaeeae)植物树叶培养这些真菌的提取液,装入未经灭菌的三角瓶中,在室温下保存不易污染杂菌,而无菌树叶的提取液则与此相反,提示真菌的提取液中含有抗生素类物质,本文将这方面的初步研究结果报道如下。材料和方...&
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利用醋酶同工酶研究农作物的起想、顶变和亲缘关系,国内外许多学者做了大量的研究。本文利用聚丙烯酸胺凝胶电泳法对国内外糜黍干种胚及胚乳的醋酶同工酶谱进行了分析,研究糜黍栽培种醋酶同工酶谱表型的地理分布与我国糜黍的起源和演变。比娜沁lC扰3C4C ︸翻口.︸一欲﹄︸﹃圈口口一X﹃︸﹄圈口︸﹃一Ix ︸﹄哪口碱︸一姻︸︸﹃脚﹃翻﹃一w ︸秘﹃﹃哪一讥口︸︺哪口翻︺一v一︸一翩目映︹一w ︸幽﹄︸一! ︸.己︸︸一, ︸翻口.﹃一· 材料与方法 (一)材料:栽培糜黍品种620份,其中我国糜黍583份,国外糜黍37份;野糜子12份,近缘植物种3份。 (二)样品制备及电泳:称取0.19种子,加101 o.oZM的Tris缓冲液,研碎,1200转/分离心10分钟,采用李继耕的垂直平板聚丙烯酞胺凝胶电泳的方法,分离胶7%,pHS.9。电极缓冲液为低离子强度pHS.3。 (三)染色方法(染两板用量):a.称取a一醋酸蔡酷和阶醋酸蔡醋各0.19,加入...&
(本文共3页)
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中国本兔(oryctola:u:cu,scol。,)切是世界现存的最古老品种之一,广泛分布在我国各地,具有繁殖力强,耐粗食,适应性和抗病力强,体型小等特点,常常作为实验动物用于生物医学研究。但目前对中国本兔与其他品种家兔的遗传关系,尚缺乏生化遗传学的系统研究。 醋酶(Estesase Ee.3.1.1.1)是催化脂类化合物水解的酶系,有人认为与机体的去毒作用有关,在生物物种内较为稳定,具有物种特异性田。迄今为止,有人对新西兰家兔的醋酶同工酶进行了大量研究,对其基因已精确地定位于染色体上叨,但未见对某一品系家兔的不同组织的醋酶同工酶谱进行比较研究的报道。 本研究试图通过对中国本兔不同组织器官醋酶同工酶的分析比较,以期弄清中国本兔醋酶同工酶活性在不同组织的表现,为进一步比较中国本兔与其他品系家兔间的遗传关系,开发中国本兔资源提供实验依据。 (一)材料和方法 1.实验动物中国木兔10只(雄、雌各5只),体重约1.,公斤,纯白,眼红,耳...&
(本文共3页)
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同工酶作为生化特性已被广泛应用于功物分类学研究。在199。年我们收集了农田中常见的JL种微蛛,在同条件下采用聚丙烯酞胺凝胶电泳技术,进行了醋酶同工酶的比较研究。材料和方法一蜘蛛的采集在武汉市农田采集了皿蛛科(Linyphiidae)的草间小黑蛛(E衍go耐d扭优g,a,inicola)、食虫沟瘤蛛(Umelia‘a’inseetieePs)、隆背微蛛(E:190”e Promi九ens)的幼、成蛛,饥饿48小时备用。1·2醉液的制备将饥饿的蜘蛛置于研钵中,根据样品体积的差异,分别加入等体积的电极缓冲液,研磨静置后离心(400Or/min X 15min)。取上清液作酶原,贮存在4℃冰箱内备用,点样时加入适量的0.1%澳酚蓝作电泳指示染料。1 .3葫醉同工酶的聚丙烯凝胶电泳分离、染色和记录基本方法参照邱琼华等(1987)的方法,对酶带进行了分析。2结果2.1同种同性别的不同个体酣酶同工酶的比较本实验用的三种微蛛,无论是幼体还是成蛛...&
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近年来,作为生物分类学研究的一个有川工具,同工酶技术已在直翅目〔‘]、半翅目同、鞘翅目〔3]、鳞翅目[‘〕、膜翅目l0,”〕、双翅目l’,。〕等目多种昆虫的分类学研究中应用。尤其在双翅目昆虫分类学研究中,同工酶技术的应用更为深入,已制定出一些类群的同工酶检索表汇”“;、田间应用也有了尝试I‘。“。 蚂蚁属膜翅目蚁科,是最高等的社会性昆虫,种类多,分布广,种内变异复杂,存在多型现象,因而形态分类常常困难。李绍文等研究表明,膜翅目蚁总科昆虫同其它总科昆虫的脂酶同工酶具有显著差异[6〕,Heinz和Buschinger的研究也发现细胸蚁属类群的醋酶同工酶种间表现出一些差异工“1,但目前未见对蚁科类群进行系统的同工酶比较研究。因此,作者对蚁科不同亚科、不同属、不同种之间的蚂蚁进行了醋酶同工酶比较。同时,还比较了同种蚂蚁个体之问的醋酶同工酶的差异(包括同种蚂蚁同型个体之间及同种蚂蚁不同型个体之间的醋酶同工酶的差异),以探讨利用1司工酶技术...&
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凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）
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凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后（如下图所示）。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
EBNA Extract
Unlabeled EBNA DNA
Unlabeled Oct-1 DNA
EMSA results using the EBNA
control system.
Biotin-labeled 60 bp duplex bearing the EBNA-1 binding sequence was incubated with an extract in which the EBNA-1 protein was overexpressed. The binding buffer was supplemented with 50 ng/ul poly(dI&dC), 10% glycerol and 0.05% NP-40. Exposure time was 30 seconds with X-ray film.
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DXY All Rights Reserved.电泳技术简介；电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在；电泳技术的基本原理和分类；在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带；可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与；电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支；自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、；影响电泳迁移率的因素；⒈电场强度电场强度是指单位长度（cm）的电位降，
电泳技术简介 电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。
电泳技术的基本原理和分类
在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。F＝QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην
可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。 自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。本节仅对常用的几种区带电泳分别加以叙述。
影响电泳迁移率的因素
⒈电场强度 电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那么电场强度为200V/20cm＝10V/cm。当电压在500V以下，电场强度在2-10v/cm时为常压电泳。电压在500V以上，电场强度在20-200V/cm时为高压电泳。电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。
⒉溶液的pH值 溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。例如蛋白质分子，它是既有酸性基团（-COOH），又有碱性基团（-NH2）的两性电解质，在某一溶液中所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，蛋白质在电场中不再移动，溶液的这一pH值为该蛋白质的等电点（isoelctric point，pI）。若溶液pH处于等电点酸侧，即pH＜pl，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。若溶液pH处于等电点碱侧，即pH＞pl，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。
⒊溶液的离子强度 电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其周围，形成一个与运动质点符合相反的离子氛（ionic atmosphere），离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。然而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关。可用离子强度I表示。 ⒋电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。
电泳分析常用方法
（一）醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。
醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。
⒈材料与试剂 醋酸纤维素膜一般使用市售商品，常用的电泳缓冲液为pH8.6的巴比妥缓冲液，浓度在0.05-0.09mol/L。
⒉操作要点
⑴膜的预处理：必须于电泳前将膜片浸泡于缓冲液，浸透后，取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干。
⑵加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白质的常规电泳分析，每cm加样线不超过1μl，相当于60-80μg的蛋白质。
⑶电泳：可在室温下进行。电压为25V/cm，电流为0.4-0.6mA/cm宽。
⑷染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红，糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。 ⑸脱色与透明：对水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5％醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋酸：无水乙醇＝30:70（V/V）的透明液中。
（二）凝胶电泳
以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用于分离蛋白质较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广，介绍如下：
⒈琼脂糖凝胶电泳的原理概述 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的检测。
⒉琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术 在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。
⑴设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE（0.08mol/L Tris?HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/L EDTA）和THE（0.04mol/L Tris?HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸钠，0.0018mol/L EDTA）。 三亿文库包含各类专业文献、高等教育、各类资格考试、幼儿教育、小学教育、行业资料、应用写作文书、电泳技术简介67等内容。　
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聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶
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