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去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位的表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定
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去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位的表达、纯化及其单链抗体
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利用噬菌体展示技术制备高致病性禽流感病毒（HPAIV）的单链抗体（ScFv）
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利用噬菌体展示技术制备高致病性禽流感病毒（HPAIV）的单
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(75459)(66776)(82567)(51288)(29239)(64020)(43223)(61276)(40159)(16920)(26596)(46170)(73903)(36741)(19158)(54035)(8807)(36336)(83147)(98258)(20039)(19824)(19289)(5330)(10692)(9331)(24642)(9342)(6246)
(30)(116)(37090)(146)(1751)(11362)(1259)(490)(163)(131)(428)(105)(661)(10638)(136)(497)(685)(393)(1002860)(14598)(276)(128)(291)(11957)(11872)(643)(583)(866)(116)(32152)
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(251)(3)(3)(52)(7)(2)(8)(5730)(16)(107)(26)(9)(42)(2)(1)(7)(3)(2180)(4)(1)(7)(10)(125)(15)(1)(2)(4)(1)(3)(2)
基本多文种平面
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多文种补充平面
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表意文字补充平面
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H9N2亚型AIV基因组序列分析及用反向遗传技术产生多个H9N2和H5重组流感病
扬州大学 博士学位论文 H9N2亚型AIV基因组序列分析及用反向遗传技术产生多个H9N2和 H5重组流感病毒 姓名：卢建红 申请学位级别：博士 专业：预防兽医学 指导教师：刘秀梵
卢建红：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及Ｈ９Ｎ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救ＪＨ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及用
反向遗传 技术产生多个Ｈ９Ｎ２和Ｈ５重组流感病毒博士研究生： 卢建红导师：刘秀梵教授摘要目前，Ｈ５Ｎ１和Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒（ＡＩＶ）在包括我国在内的东南亚及世界许多国家分布广泛，是流行主型，它们引起的禽流感对养禽业的严重危害性和公 共卫生意义都受到关注。由于ＡＩＶ亚型众多，宿主广泛，抗原易变，尤其是有野 生水禽作为病毒的大储存库，禽流感是难以消灭的，只有依靠严格的生物安全措施及疫苗预防和控制。对华南（主要是香港）活禽市场的监测表明这两个亚型的 病毒共存，内部基因进化活跃，这警示我们对人类流感大流行应有所准备。中国 大陆有必要加强对ＡＩＶ的分布、进化、致病性及新型疫苗等方面的研究。１９９９年 以后Ｎｅｕｍａｎｎ等、Ｈｏｆｆｍａｎｎ等建立了完全以质粒为基础的流感病毒反向遗传操作 系统，显示了对相关研究的良好应用前景。本研究选择１个中国大陆分离株Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｈａｎ曲ａｉ／Ｆ／９８（Ｈ９Ｎ２），对其进行全基因组序列测定和遗传进化分析，然后将其８个基因ｅＤＮＡ克隆入Ｈｏｆｆｍａｎｎ等构建的双向转录／表达载体ｐｌ｛ｗ２０００，与Ａ／ｗＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）的内部基因组合，用８质粒病毒拯救系统产生了多个ＨｇＮ２亚 型基因重排病毒，从而建立了流感病毒的反向遗传操作技术。应用此技术，通过 修饰ＨＡ基因，产生了致弱表型的Ｈ５Ｎ１和Ｈ５Ｎ２亚型基因重排病毒。１Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒基因组全长序列测定和各基因的遗传分析选择Ｈ９Ｎ２亚型分离株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／Ｆ／９８（Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８）．只ｊ鸡胚增殖、以蔗糖垫底高速离心纯化病毒。根据已发表的序列设计扩增８个基因的引物对，提取基因组ＲＮＡ，用反转录一聚合酶链反应（ＲＴ―ＰＣＲ）扩增８个片段并测序。为获得准确的５?和３ｔ端序列，在片段中设计特异引物、用改进的ｅＤＮＡ末端快速扩增法 （５＇／３?ＲＡＣＥ）扩增各个基因的两端并测序。将ＲＴ―ＰＣＲ和５＇１３’ＲＡＣＥ的序列比较、拼接出含５’和３１端非编码区的８个基因的全长序列。基因组全长为１３５９７ｎｔ，片段 ｌ（ＰＢ２基因）２３４Ｉｎｔ，编码７５９ ａａ的ＲＮＡ聚合酶２（ＰＢ２）：片段２（ＰＢｌ基因）２３４Ｉｎｔ，编码７５７ａａ的ＲＮＡ聚合酶１（ＰＢｌ）：片段３（ＰＡ基因）２２３３ｎｔ，编码７１６ａ，ａＩＩ扬州大学博士学位论文的ＲＮＡ聚合酶Ａ（ＰＡ）；片段４（ＨＡ基因）１７４２ｎｔ，编码５６０ａａ的血凝素（ＨＡ）；片段５（ＮＰ基因）１５６５ｎｔ，编码４９８ ａａ的核蛋白（ＮＰ）；片段６（ＮＡ基因）１４５８ｎｔ，编码４６６ａａ的神经氨酸酶（ＮＡ）：片段７（Ｍ基因）１０２７ｎｔ，编码２５２ａａ的基质蛋白（Ｍ１）和９７ａａ的离子通道（Ｍ２）；片段８（ＮＳ基因）８９０ｎｔ，编码２１７ａａ的非结构蛋白（ＮＳｌ）和１２１ａａ的出核转运蛋白（ＮＥＰ／ＮＳ２）。８个基因的序列己发表在ＧｅｎＢａｎｋ，登录号为ＡＹ２５０７５０一ＡＹ２５０７５６，ＡＦ４６１５３２。Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８成为在ＧｅｎＢａｎｋ中第一个登录序列完整的Ｈ９Ｎ２贬型流感病毒株，也是中国大陆第一个自主登录基因组全长序列的Ｈ９Ｎ２亚型毒株。从ＧｅｎＢａｎｋ中获取１１７４个发表序列长短不一的Ｈ９Ｎ２亚型毒株的基因序列，与Ｃ／Ｓ｝ｌ／王啊８的８个相应基因进行核苷酸和氨基酸序列比较，基因组序列及遗传进化分析结果如下：Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８完全不同于Ｑ／ＨＫ／Ｇ１／９７，与香港流感事件没有直接关系，ＨＡ、ＮＳｌ、ＰＢｌ等蛋白保持普通ｔｔ９Ｎ２亚型毒株的特性。Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８与Ｑ／ＨＫ／Ｇ１／９７比较，除Ｍ基因外的７个基因同源率均低，为８５．５％一９３．３％，具有型特异性的Ｍ基因同源 率为９６．Ｏ％。Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８的８个基因均不在Ｇ１．１ｉｋｅ进化分支上。ＨＡ裂解位点序列为ＰＡＲＳＳＲ ｌ Ｇ，是低致病性Ｈ９Ｎ２流感病毒的模式，ＨＡ的２２６位受体结合位点（对应Ｈ３亚型位置）的氨基酸为Ｇｉｎ，倾向于与动物细胞结合；ＮＳｌ长度为２１７个氨基酸；ｐＢｌ基因编码区７５７位为赖氨酸（Ｌｙｓ）。而Ｇ１一ｌｉｋｅ毒株ＨＡ为Ｌｅｕ－２２６， 倾向于与人类细胞结合：ＮＳｌ长度为２３０个氨基酸；ＰＢｌ多一个残基（７５８个），且Ｃ端倒数第二位为Ｇｌｙ．７５７。 Ｃ／ＳＨ／Ｆ１９８的ＨＡ、ＮＡ、Ｍ、ＮＳ基因是ＢＪ９４－１ｉｋｅ成员，与Ｃ／Ｂｅｉ／ｉ／９４（ＢＪ９４）同源率分别为９６．７％、９６．４％、９７．５％、９８．Ｏ％，其中，ＮＡ基因与Ｄ／ＨＫ／Ｙ２８０／９７的 同源率为９７．４％，而且它们的ＮＡ基因（ｅＤＮＡ）在２０５位后都缺失大多数毒株（包括ＢＪ９４）均具有的９个核苷酸。ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８的ＲＮＰ（ＰＢ２、ＰＢｌ、ＰＡ和ＮＰ）基因不属于１９９９年以前建立的已知三个稳定亚系，分别在相应的进化树上另成分支，推 测中国大陆存在这４个基因的分支。因此，Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８是两个或两个以上基因亚系 间发生自然重排的产物。引人注意的是，广东汕头活禽市场分离株Ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｔｏｕ／１６０５／０１与Ｃ／ＳＩ－Ｉ／Ｆ／９８之间除ＮＳ基因以外的７个基因同源，虽然Ｄ／ＳＴ／１６０５／０ｌ的ＨＡ和ＮＡ基因已发生变异，但ＨＡ仍保持鸡源病毒的特点，而区别于早期的鸭源病毒株。因此，ｃ／ＳＨ，Ｆ／９８是Ｄ／ＳＴ／１６０５／０１的前体，Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８的基因一直在循环并已回传给鸭，这支持“双卢建红：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及Ｈ９Ｎ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救ＩＩｌ向传播”的新观点。双向传播提高了整个生态系统中病毒基因型的多样性，并进 一步增加基因重排与种间传播的机会，我们应该重视Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ的自然进化和演变，加强对其基因组的分子流行病学监测。２通过产生多个Ｈ９Ｎ２亚型的基因重排流感病毒，建立了反向遗传操作技术平台设计带有ＢｓｍＢＩ、ＢｓａＩ或ＡａｒＩ酶切位点的引物扩增Ｃ／ＳＨ，Ｆ，９８的８个基因全 长片段，并在ＰＢ２、ＰＢｌ和ＮＡ基因中共引入了３个沉默突变标记。测定了双向转 录／表达载体ｐＨＷ２０００的全长序列。将Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８的８个片段克隆入ｐＨＷ２０００， 并进行了测序验证和错误位点的修正，从而构建了８个ｐｏｌ Ｉ―ｐｏｌ ＩＩ系统的转录／ 表达质粒，以期通过同一个载体、转染后利用细胞中的ｐｏｌ Ｉ和ｐｏｌ ＩＩ ＲＮＡ聚合酶、实现Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ ｖＲＮＡ和ｍＲＮＡ的转录和表达。用Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８的２个表面基因（ＨＡ和ＮＡ）或增加Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８的任意一个内部 基因，而其它内部基因来自Ａ／ｗＳＮ／３３，进行所有组合的基因重排，即１种２＋６和６种３＋５组合形式，将相应的转录／表达质粒组合，共转染ＣＯＳ一１细胞，均产生了预期组合、有感染性的Ｈ９Ｎ２亚型流感病毒，表明构建的８个转录／表达载体均能 工作，为进一步筛选和构建ＡＩＶ骨架病毒毒株打下基础。用Ａ／ＷＳＮ／３３的８个基因的质粒作对照，也产生了转染子病毒。在这个过程中，优化了共转染体系，在２４ 孔细胞培养板上即可产生足以直接用鸡胚增殖的子代病毒。对２＋６组合的Ｈ９Ｎ２／ＷＳＮ、ＷＳＮ转染子代病毒及Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８（ｗｔ）的一些特性进 行了比较。经过鸡胚传代、ＥＩＤ５０测定和ＩｄＤＣＫ感染实验，Ｈ９ＮＥ／ＷＳＮ（２＋６）病毒能 在鸡胚中高滴度增殖，感染鸡胚的能力强，在不加胰酶的情况下不使ＭＤＣＫ产生病 变，这与提供表面基因的Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８（ｗｔ）相似，而且对鸡胚的毒力弱，这又与提 供６个内部基因的ＷＳＮ相似。经电镜观察，转染子病毒的形态与野生型流感病毒相似。反向遗传操作技术的建立，为进行禽流感病毒基因结构与功能、致病性和 疫苗候选株的构建等方面的研究提供了新的手段。 ３用反向遗传操作技术使Ｈ５亚型禽流感病毒的致病性从高到低的突变建立了反向遗传操作技术后，希望能应用于对ＨＰＡＩ的致病性研究和探索疫苗 候选株构建。切除Ｈ５Ｎ１亚型ＡＩＶ（Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｈｕａｄｏｎｇ／１／２０００）ＨＡ基因裂解位点的４ 个碱性氨基酸，使裂解模式由高致病性的ＰＱＲＥＲＲＲＫＫＲ Ｉ ＧＬ突变为低致病性的ＰＱＲＥＳＲ ｌ ＧＬ、将修饰的Ｉ｛Ａ基因克隆入ｐＨＷ２０００，同样构建了该毒株的ＮＡ基因的转录／表达载体，并测定了ｌ｛Ａ和ＮＡ基因的全长序列。将修饰的｝ｌＡ基因与未修饰的ＮＡ（ＮＩ）基因或Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８的ＮＡ（Ｎ２）基因组合、Ｉ≥ｌ Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）的６个Ｖ扬州大学博士学位论文的ＮＡ（Ｎ１）基因或Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８的ＮＡ（Ｎ２）基因组合、以Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）的６个内部基因为骨架，用相应的组合质粒分别共转染ＣＯＳ―ｌ细胞，产生了Ｈ５Ｎ１和Ｈ５Ｎ２两个亚型的致弱重排病毒，通过在鸡胚中的多次传代和适应，它们的毒价上升， 表达病毒保护性抗原的表面基因稳定，而对６周龄ＳＰＦ鸡均不表现致病性。与Ｈ５Ｎ１ 重组病毒相比，Ｈ５Ｎ２病毒仅有ＮＡ基因不同，对鸡胚的毒力却明显低于Ｈ５Ｎｌ病毒。 新基因型病毒的致弱表型主要由修饰的ＨＡ基因、配合内部基因的改变引起。 由于使用ＷＳＮ的内部基因、产生的病毒上升的效价还不够高等原因，子代病毒尚 不能作为疫苗候选株，但这种尝试为ＨＰＡＩ致病性研究和构建疫菌株以控制高致病 性Ｈ５亚型病毒的扩散和流行提供了思路和方法，也证明建立的反向遗传操作技术 已经成熟，将得到充分的应用。全文小结：（１）获得了Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８全基因组序列，由于Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８是较早期的分离株而且 其基因组具有特征性，所以不但为分子流行病学和疫茁等相关研究提供了科学依据，也使Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８将成为基因进化分析等的参照毒株。 （２）Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８完全不同于Ｑ／ＨＫ／ＧＩ／９７及相关毒株。（３）Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８是不同亚系间发生自然重排的产物，中国大陆还可能存在新的亚系分支。（４）Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８的基因一直在循环，并已回传给鸭，这支持“双向传播”的新观点。（５）构建了Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８用于８质粒病毒拯救系统的８个转录／表达载体，并且证明它们均可以工作。（６）用８质粒病毒拯救系统建立了反向遗传操作技术，这为进行禽流感病毒基 因结构与功能、致病性和疫苗候选株的构建等方面的研究提供了新的手段。 （７）修饰鹅源Ｈ５Ｎ１亚型ＡＩＶ的ＨＡ基因，构建了修饰ＨＡ基因和未修饰的ＮＡ基因转录／表达载体，并测定了ＨＡ和ＮＡ基因全长序列。 （８）应用建立的反向遗传操作技术产生了致弱的Ｈ５Ｎ１和Ｈ５Ｎ２亚型重组病毒， 这种尝试为新型疫苗候选株的构建提供了策略。关键词：禽流感病毒；Ｈ９Ｎ２亚型；ＨＳＮｌ亚型：进化；反向遗传操作技术；基因重排：致病性；疫苗卢建红：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及Ｈ９Ｎ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救ｖＧｅｎｏｍｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ ｏｆＨ９Ｎ２ Ｓｕｂｔｙｐｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ９Ｎ２ Ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔｓ ａｎｄ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｈ５ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｂｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＧｅｎｅｔｉｃｓＰｈ．Ｄ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ：Ｊｉａｎｈｏｎｇ Ｌｕ Ａｄｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．Ｘｉｕｆａｎ ＬｉｕＡｂｓｔｒａｅｔＨ５Ｎ１ ａｎｄ Ｈ９Ｎ２ａｒｅｔｗｏ ｍａｉｎ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｔｈａｔ ｃｉｒｃｕｌａｔｅ ｉｎＳｏｕｔｈｅａｓｔ Ａｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｈｉｎａ ａｎｄ ｍａｎｙ ｏｔｈｅｒ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（ＡＩ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、ｖｉｔｌｌ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｈａｓ ｒａｉｓｅｄ ｇｒｅａｔ ｃｏｎｃｅｍｓ ｆｏｒ ｉｔｓ ｅｃｏｎｏｍｉｃｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｔｏｐｏｕｌｔｒｙｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｒｅａｔ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ．Ｈｉｇｈｌｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（ＨＰＡＩ）ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｓｏｍｅ Ｈ５ＮＩ ｓｔｒｍｎｓ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ，ｗｈｅｒｅａｓ ｍｉｌｄｌｙｏｒＣａｎ ｌｅａｄｔｏｈｉｇｈｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ Ｈ９Ｎ２ｎｏｔｓｕｂｔｙｐｅ Ｃａｎ ａｌｓｏ ｉｎｄｕｃｅ ｓｅｒｉｏｕｓ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｄｕｓｔｒｙ．ＡＩ ｉｓａｌｌｅｒａｄｉｃａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ，ａｓ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ（ＡＩＶ）ｈａｓａａｌｏｔ ｏｆ ｓｕｂｔｙｐｅｓ，ｕｎｄｅｒｇｏｅｓｃｏｎｓｔａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｒｉｆｔ ａｎｄ ｓｈｉｆｔ，ａｎｄ Ｃａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｌｙ，ｔｈｅｒｅ ｉｓｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｌｙｉｎｇｏｎ ａｖａｒｉｅｔｙ ｏｆｂｉｒｄｓａｎｄ ｍａｍｍａｌｓ．Ｍｏｒｅｌａｒｇｅ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ｉｎ ｗｉｌｄ ａｑｕａｔｉｃ ｂｉｒｄｓ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｓｔｒｉｃｔ ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ ｐｒｅｃａｕｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｒｅａｌｉｓｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｏｎＴｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅｌｉｖｅ ｐｏｕｌｔｒｙ ｍａｒｋｅｔｓ ｉｎ ｓｏｕｔｈｅｍ Ｃｈｍａ（ｍａｉｎｌｙ，ＨｏｎｇＫｏｎｇ）ｈａｖｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔｔｈｉｓ ｒｅｍｉｎｄ ｏｆ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒｏｕｒｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｃｏｅｘｉｓｔａｎｄ ｅｖｏｌｖｅ ｒａｐｉｄｌｙ，ａｎｄｃａｓｅ，ｉｔｌａｃｋ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ ｆｏｒｈｕｍａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｐａｎｄｅｍｉｃ．Ｉｎ ｔｈｉｓｏｎｍａｉｎｌａｎｄ Ｃｈｉｎａ ｔｏ 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ＮＰ）ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ ｄｉｄ ｎｏｔ ｓｈｏｗａｎｙ ｃｌｏｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔＩｌ ｔｈｏｓｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｋｎｏｗｎ ｓｕｂｌｉｎｅａｇｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｅｆｏｒｅ１９９９．Ｔｈｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅｗａｓａｍｉｇｈｔ ｂｅｏｔｈｅｒ ｓｕｂｌｉｎｅａｇｅｓ ｔｏ ｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ＲＮＰｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｌｉｎｅａｇｅｓ． Ｉｔ ｗａｓ ｎｏｔｅｗｏｒｔｈｙ ｔｈａｔｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶｓｓｅｖｅｎｏｆ ｅｉｇｈｔ ｇｅｎｅｓ，ｅｘｃｅｐｔ ＮＳ，ｆｒｏｍａｍａｌｈｉａｎｄ Ｃｈｉｎａｉｓｏｌａｔｅ，Ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｔｏｕ／１６０５／０１，ｗｅｒｅｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｏｓｅ ｏｆ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８，ｗｈｉｌｅ ｉｔｓＨＡ ａｎｄ ＮＡ ｇｅｎｅｓ ｈａｄ ｕｎｄｅｒｇｏｎｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ、Ⅳｉｔｌｌ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ ｗａｓａＣ／ＳＨ／Ｆ／９８．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ．ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｗｈｏｓｅ ｇｅｎｅｓ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｒｅａｓｏｎａｂｌｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｂａｃｋ ｔｏｄｕｃｋｓ．Ｔｈｉｓｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｔｈｅ ｎｅｗ ｉｄｅａ ｏｆ ｔｗｏ―ｗａｙ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｂｙｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡＩＶｓ ｉｎ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｗｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅａｎｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｈａｖｅ∑坐ｇｒｅａｔｅｒ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｔｏ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ． ｂｅ ｒａｉｓｅｄｒｅａｓｓｏｒｔ堑型茎鲎竖主鲎堡笙塞ａｎｄｆｆａｎｓＩＩｌｉｔ ａｍｏｎｇ ｈｏｓｔ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｏｎｃｅｍｓ ｓｈｏｕｌｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶｓ，ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｏｒｎａｔｕｒａｌｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｆｏｒ ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ａｌｌ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶｓ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ２．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｈ９Ｎ２ ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔｓｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｂｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇａｓｅｒｉｅｓ ｏｆＥｉｇｈｔ ｆｕｌｌ―ｌｅｎｇｔｈ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ＢｓｍＢＩ，ＢｓａＩｏｒＡａｒＩ ａｔ ５＇－ｅｎｄｓ．Ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔａｇｓ ｏｆ ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ＰＢ２，ＰＢ Ｉ ａｎｄ ＮＡｇｅｎｅｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｅｉｇｈｔ ｃＤＮＡｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｐＨＷ２０００ｔＯｅｉｇｈｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｏｆｏｎｅｖＲＮＡｓ ａｎｄ ｍＲＮＡｓ ｂｙ ｐｏｌ Ｉ ａｎｄ ｐｏｌ ＩＩ ｆｒｏｍｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｓｕｃｈａｓｔｅｍｐｌａｔｅ ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏＣＯＳ一１．ｓｅｖｅｎＷｅ ｒｅｓｃｕｅｄａｔｏｔａｌ ｏｆＨ９Ｎ２ ｒｅａｓｓｏｒｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ，ｏｎｅ ２＋６ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔＷＯ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｅｎｅｓ ＨＡａｎｄ ＮＡ ｆｒｏｍ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ ａｎｄ ｓｉｘ ｉｎｔｅｒｎａｌｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍｏｎｅＡＪＷＳＮ／３３，ａｎｄ ｓｉｘ ３＋５ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅｓ（ＨＡ，ＮＡ ａｎｄ ａｎｙｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｍａｌｇｅｎｅｓ）ｆｒｏｍ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ ｗｈｉｌｅ ｏｔｈｅｒ ｆｉｖｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａ／ＷＳＮ／３３．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｅｉｇｈｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｏｆ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ ｃｏｕｌｄ ｗｏｒｋ．Ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ａ ｍａｓｔｅｒ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＡＩＶ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄｎｅｘｔ．Ａｓａｃｏｎｔｒｏｌ，ａｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ ｏｆｓｙｓｔｅｍＡ／ＷＳＮ／３３ｗａｓ ａｌｓｏｗａｓ ａｌｓｏ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ．Ｉｎ ｔｈｅＳＯｒｅｓｃｕｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｒｏｇｅｎｙ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｎｏｎｅｗｅｌｌｏｆ ａ ２４一ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ ｗａｓ ｅｎｏｕｇｈ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ ｅｇｇｓ， Ｓｏｍｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄＨ９Ｎ２／ＷＳＮ（２＋６）ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈｅｇｇ ｐａｓｓａｇｅ，ＥＩＤｓｏｔｈｅＷＳＮ ａｎｄ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙａｎｄ ＭＤＣＫｔＯｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ２＋６ ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｃｏｕｌｄ ｇｒｏｗ ｗｅｌｌ ｉｎ ｅｇｇｓａｈｉ曲ｔｉｔｅｒ，ａｎｄｗａｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｆｏｒ ｅｇｇｓａｎｄ ＭＤＣＫ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｒｅｓｃｕｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｅｒｅｉｎｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｗｉｌｄ―ｔｙｐｅ ｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ． Ｏｖｅｒａｌｌ，ｏｕｒｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｉｇｈｔ－ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍＡａｌｌｏｗｅｄ ｔｈｅ ｒａｐｉｄａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｓｓｏｒｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ，ａｎｄ卢建红：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及Ｈ９Ｎ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救ｔｈｕｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄＩＸａｎｅｗ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ＡＩＶ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｉｎｆｌｕｅｎｚａｐａｔｈｏｇｅｎｉｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ－ｔｙｐｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ．３．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｈ５Ｎ１ ａｎｄ Ｈ５Ｎ２ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｂｙｇｅｎｅｔｉｃｓＩｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆｓｅｖｅｒｅｒｅｖｅｒｓｅｅｐｉｄｅｍｉｃｓ ｏｆ ＨＰＡＩＶ ｏｆ Ｈ５ ｓｕｂｔｙｐｅｔｏａｎｄ ｌａｃｋｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｍｉｌｄｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂｕｔ ａｎｔｉｇｅｎｉｃａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｈｅｒｅｖｅｒｓｅｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ．ｇｅｎｅｔｉｃｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄｔｏｆｉａｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙ．ＡｎＨ５Ｎ１ｖｉｒｕｓ，Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｈｕａｄｏｎ【∥１／２０００，ＷａＳ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｔｈｅ ｈｉｇｈｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｌｉｎｋｅｄｔｏｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｂａＳｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ＨＡｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ，ｔｈｅ ＨＡ ｒｅｇｉｏｎ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇｗａｓ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｗｉｔｈｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＱＲＥ㈣ＩａｔＧＬ）ＰＱＲＥＳＲ ｌ ＧＬ．Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄＨＡ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｂｅｉｎｓｅｒｔｅｄＮＡ叫１）ｇｅｎｅｃＤＮＡｓｗｅｒｅｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．ＴｗｏｐＨＷ２０００ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ，Ｈ５Ｎ １／ＷＳＮ ａｎｄ Ｈ５Ｎ２／ＷＳＮ，ｗｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｂｏｔｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＨＡ ｇｅｎｅ，ｅｉｔｈｅｒ Ｎ １ ｇｅｎｅ Ｎ２ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ ａｎｄ ｓｉｘ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａ／ＷＳＮ／３３ Ａｆｔｅｒ１５ｆｒｏｍ Ｈ５Ｎ１ ｖｉｒｕｓ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｖｉｒｕｓｏｒｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｐａＳｓａｇｅｓａｎｄ ａｄａｐｔｉｎｇ ｉｎ ｅｇｇｓ，ｂｏｔｈｎｏｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｇｒｅｗ ｆｒｏｍ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｔｏ ｈｉｇｈ ＨＡ―ｔｉｔｅｒｓ ｏｆ ｌ：５ １ ２．Ｗｅ ｄｉｄ ｃｈａｎｇｅａｔｄｅｔｅｃｔ ａｎｙｔｈｅ １２ｔｈ ｐａｓｓａｇｅ ｉｎ ｎｕｃｔｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆＨＡａｎｄ ＮＡｒ／ｏｇｅｎｅｓ ｋｎｏｗｎ ｔｏｅｎｃｏｄｅ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈａｎｇｉｎｇｖｉｒｕｓｅｓ．Ｔｈｏｕ【曲ｏｎｌｙｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｉｎ ｃａｒｒｙｉｎｇ ＮＡ ｇｅｎｅ，ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ Ｈ５Ｎ２ ｖｉｒｕｓ Ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｌｅｓｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｏｒ ｅｇｇｓ Ｂｏｔｈ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｅｒｅ ａｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｏｒ ｓｉｘ―ｗｅｅｋ―ｏｌｄ ｃｈｉｃｋｅｎｓ．ｔｈａｎ ｔｈｅ Ｈ５Ｎ １ ｖｉｒｕｓ．Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ｔｈａｔ ｍａｉｎｌｙ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＨＡ ｇｅｎｅ，ｆｉｔｔｅｄ ｂｙＷＳＮ ｉｎｔｅｍａｌｇｅｎｅｓａｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｃｕｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｂｅｃａｕｓｅ ｔｈｅｙｎａｔｕｒｅｄｉｄ ｎｏｔ ｇｒｏｗ ｔｏ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ｔｉｔｅｒｓ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅａｏｆ ｔｈｅ ｍａｓｔｅｒ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＷＳＮ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｉｓ ｔｒｉａｌ ｐｒｏｖｉｄｅｄｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅａｓｕｒｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ＨＰＡＩ ｖｉｒｕｓｅｓ，ａｎｄ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｂｅｔｔｅｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ＷａｓＸ扬州大学博士学位论文Ｉｎ ｓｕｍｍａｒｙ，ｗｅ ｄｒａｗ ｔＩｌｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：１）Ｗｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｄａｔａ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｓｕｃｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｈｉｓ ｃｏｕｌｄ ａｌｓｏａｓｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃ／Ｓ１４ＪＦ／９８ｔｈａｔ ｗｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｔｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｔ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｆｏｒ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ｍａｋｅｂｅｃｏｍｅａｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ Ｈ９Ｎ２ ｖｉｒｕｓ．２）Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ｗａｓ ｅｎｔｉｒｅｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍａＱ／ＨＫ／ＧＩ／９７ ａｎｄ Ｇ１?ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ．３１ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ ＷａＳｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｕｂｌｉｎｅａｇｅｓ，ｗｈｉｌｅ ｎｅｗｓｕｂｌｉｎｅａｇｅ（ｓ）ｍｉｇｈｔ ｆｏｒｍ ｉｎ ＡＩＶｇｅｎｅ ｐｏｏｌｏｆｍａｉｎｌａｎｄ Ｃｈｉｎａｔｏ４、Ｔｈｅ ｆａｃｔ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｂａｃｋｄｕｃｋｓ ｓｕｐｐｏｓｅｄ ｔｈｅ ｎｅｗ ｉｄｅａｏｆｔｗｏ―ｗａｙｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．ｃＤＮＡｓ ｆｒｏｍ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８５）Ｅｉｇｈｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｅｄｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄ ｅａｃｈ ｃｏｕｌｄ ｗｏｒｋ．ａ６）Ａｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｄｔＯｎｅｗ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌＣａＵＳｅ７）Ｔｗｏ ｐｌａｓｍｉｄｓ，ｗｉｔｈ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ＨＡ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄｄｉｓｅａｓｅｏｒａｂｏｌｉｓｈ ｉｔｓ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏｕｎａｌｔｅｒｅｄ ＮＡ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍＡ／Ｇｏｏｓｅ／Ｈｕａｄｏｎ∥１／２０００（Ｈ５Ｎ１）ｖｉｒｕｓ．ｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，Ｔｈｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆｔｈｅ ｔｗｏ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．８）Ｔｈｅｒｅｖｅｒｓｅａｐｐｒｏａｃｈ ｔｈａｔ ａＲｅｎｕａｔｅｄ Ｈ５Ｎ １ ａｎｄ Ｈ５Ｎ２ ｒｅｃｏｍｂｉｒｍｎｔｓ ｗｅｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙａｇｅｎｅｔｉｃｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ。ｔｙｐｅ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ；Ｈ９Ｎ２ ｓｕｂｔｙｐｅ；Ｈ５Ｎ１ ｓｕｂｔｙｐｅ；ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ；ｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｓ；ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ；ｐａｔｂｏｇｅｎｉｓｉｓ；ｖａｃｃｉｎｅ卢建红：ＨｇＮ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及Ｈ９Ｎ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救符号说明符号∞ＮＫ嗵＼ Ａｒ Ａｒｇ，Ｒ Ｂａ Ｂｍ ＢＪ９４ ｂ口 ＣＤＮＡ ｃＲＮＡ ＣＡＴ ＣＯＳ．１ ＣＰＥ ＣＴＬ Ｃ／ＳＨ／Ｆ／９８ ＤＥｐＣ外文全称或说明Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ＡａｒＩ Ａｒｇｉｎｉｎｅ ＢｓａＩ ＢｓｍＢＩ中文说明Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂ面ｉ１１∥１／９４（Ｈ９Ｎ２）ｂａｓｅ ｐａｉｒ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＲＮＡ禽流感病毒 禽成髓细胞瘤病毒 一种ＩＩ型限制性内切酶 精氨酸 一种ＩＩ型限制性内切酶 一种ＩＩ型限制性内切酶 流感病毒毒株名称 碱基对与ＲＮＡ互补的ＤＮＡＣｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ＡｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＡｆｒｉｃａ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ与负链ＲＮＡ互补的正链ＲＮＡ 氯霉素乙酰转移酶 非洲绿猴肾细胞系 细胞病变细胞毒性Ｔ淋巴细胞 流感病毒毒株名称 焦碳酸二乙酯Ａ／ＣｈｉｃｋｅｒｇＳｈａｎｇｈａｉ／Ｆ／９８（Ｈ９Ｎ２）Ｄｉｅｆｌｙｌ ｐｙｒｏｅａｒｂｏｎａｔｅ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ‘Ｓ ｍｅｄｉｍｕｍ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｃｉｄ Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄＤＭＥＭＤＮＡ Ｅ，Ｇｌｕ ＥＬＩＳＡｅｇｇｓ用于细胞的一种培养基 脱氧核糖核酸 谷氨酸 酶联免疫吸附试验 鸡胚 半数鸡胚感染剂量 人胚胎肾细胞系 乙二胺四乙酸 流感病毒毒株名称 血凝素 高致病性禽流感小时Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ Ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｇｇｓ ５０％ｅｇｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅＨｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏＥＤ５０２９３Ｔ ＥＤＴＡ Ｇ１ ＨＡ ＨＰＡＩ ｈｋｉｄｎｅｙＥｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄＡ／Ｑｕａｉｌ／Ｉ－Ｉｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｏｌ／９７（Ｈ９Ｎ２） Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｈｉｇｈｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｈｏｕｒ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｌｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｍ巧ＮＩｇＡ血凝抑制 干扰素Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＡＬｙｓｉｎｅＫ，ＬｙＳ ＭｌＮ１２ＭａｔｒｉｘｌＩｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ免疫球蛋白Ａ 赖氨酸 基质蛋白 离子通道２扬州大学博士学位论文 Ｍａｓｓａｇｅ ＲＮＡｍＲＮＡ ＭＨＣＭＤＣＫＭａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｅｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘＭａｄｉｌｌ．Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ Ｍｉｌｄｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｍｉｎｕｔｅ ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒＭ队Ｉｍｍ ｍＬＮＡＮｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ １ Ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｏｆｆｉｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓ Ｅｐｉｚｏｏｔｉｅｓ，ｔｈｅＮＰ ＮＳｌ ＮＥＰ，ＮＳ２ｎｔ信使ＲＮＡ 主要组织相容性复合物 犬肾细胞系 低致病性禽流感 分钟 毫升 神经氨酸酶 核蛋白非结构蛋白出核转运蛋白 核苷酸 光密度 国际兽疫局， 世界动物卫生组织 酸性聚合酶 碱性聚合酶１ 碱性聚合酶２ 流感病毒毒株名称０ＤＯ正Ｗｏｒｌｄ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ ＨｅａｌｔｈＰＡＰＢｌＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ＰＢ２ ＰＲ８ ＰＣＲ ｐｏｌ ＩＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｇｌｕｔａｎｉｎｅ Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅＤＮＡ ｅｎｄｓ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ＲＮＡａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｃｏｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ聚合酶链反应ＲＮＡ聚合酶Ｉ ＲＮＡ聚合酶ＩＩ 谷氨酰胺ＩＩＩｐｏｌＩＩＱ，ＧｉｎＲＡＣＥ ＲＮＡ ＩｔＮａｓｉｌｌＲＮＰＳｃＤＮＡ末端快速扩增法 核糖核酸 ＲＮＡ酶抑制剂 核糖核蛋白复合物反转录 秒ＲＴＳｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＳＰＦ Ｔｒｉｓ Ｕｕ１无特定病原Ｔｆｉ一（ｈｙｄｒｏｒｙｍｅｔｈｙ）－ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅＵｎｉｔ三羟甲基氨基烷 单位微升ＭｉｃｒｏｌｉｔｅｒＡｆｒｉｃａ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ ＶｉｒａｌＲＮＡＶｅｒ０ ＶＲＮＡｋｉｄｎｅｙ非洲绿猴肾细胞系病毒ｌｉＮＡＷＳＮｗｔＡ，ＷＳＮ／３３（ＨｌＮｌ）流感病毒毒株名称野生型Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ卢建红：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及Ｈ９Ｎ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救３综述一Ａ型流感病毒的反向遗传操作技术摘要： Ａ型流感病毒是感染人类、多种哺乳动物和广泛禽类的病原体。反向遗传操作技术是随着分子生物学技术发展起来的新方法，与经典遗传技术的研究思路相反．它采用由基因型到 表型的研究策略。Ａ型流感病毒的基因组分为８个片段，其反向遗传操作技术（或称病毒拯救 技术）的建立难度较大，因为要同时在细胞内形成８个功能性核糖核蛋白复合物（ＲＮＰｓ），而 且与大多数其它负义ＲＮＡ病毒不同，流感病毒基因组在细胞核内复制，因此流感病毒拯救技术 的发展落后于其它负义ＲＮＡ病毒，但经过１０多年的历程，已经达到可以完全从克隆的ｅＤＮＡ（即 以质粒为基础）产生病毒的水平。新操作系统包括１７／１２质粒和８质粒系统，拯救效率在目前 所有负义ＲＮＡ病毒中已达到最高，允许对流感病毒的复制和致病性、产生基因修饰的疫苗候选 株、表达外源基因等方面进行更方便的研究。可以预见，反向遗传操作技术会在未来的生物医 学领域被演绎成一项先进的应用技术。 关键词：Ａ型流感病毒；反向遗传操作技术；病毒拯救：发展：质粒基础的操作系统；应用反向遗传操作技术（Ｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｓ）是与经典遗传学研究思路相反的一个概念，是指采用由基因型到表型的研究策略，通过在克隆化基因引入定点突变或利 用遗传重组技术等研究基因修饰对表型的影响，也有人翻译为“反向遗传学”，“反 义遗传学”。尽管相关研究开始于十多年前，但近几年随着分子生物学技术的快速 发展，这些研究也得到发展，才形成“Ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ”的概念。由于它更趋向 于方法及其应用，是一项新技术，而未成为一门学科，所以本文中使用“反向遗传 操作技术”这一概念。“病毒拯救（ｒｅｓｃｕｅｏｆｖｉｒｕｓ）”是目前反向遗传操作技术应用于病毒研究的热点，指利用病毒核酸的适当形式在一定条件下转染细胞，产生 有感染性的病毒粒子，对于ＲＮＡ病毒如流感病毒来说，由于ＲＮＡ本身的结构特点和 不稳定性，基因操作比较困难，只能在ｃＤＮＡ水平上进行，因此又称“ｃＤＮＡ的感染 性克隆”。相对于经典遗传学研究方法，反向遗传研究具有方便筒捷、定位可控等 优点，已广泛应用于转基因和基因敲除动植物的构建、致病基因克隆和微生物学研 究等领域。病毒拯救技术为病毒的功能基因组研究提供了强有力的手段，可以用来 研究病毒在生命周期中基因复制与表达调控的机理、ＲＮＡ编辑和重组及病毒聚集、 功能蛋白与病毒致病作用、病毒与宿主细胞及免疫应答的相互作用等，也对寻找新 型疫苗进行病毒病的防制和基因治疗等方面的研究带来深远的影响ｌｌ。１ａ病毒的反向遗传操作技术是在了解病毒复制的特点等的基础上利用分子生物 学技术而建立和完善起来的。因此，本文将从流感病毒及其基因组特征、复制特点扬州大学博士学位论文综述一开始，介绍病毒反向遗传操作技术体系的建立；从克隆的ｃＤＮＡ产生负义ＲＮＡ病毒 的概况，重点叙述流感病毒反向遗传操作技术的发展与应用前景。ｌＡ型流感病毒及其基因组特征 流感病毒是正粘病毒科的成员，是有囊膜、多形态的ＲＮＡ病毒，根据其内部核蛋白（ＮＰ）和基质蛋白（Ｍ）的抗原性不同，可分为Ａ、Ｂ、Ｃ三型，其中Ａ型在 温血动物（禽类和哺乳动物）中广泛存在，也是目前致人类和各种动物流感疾病的 主型ｐ“１。因此对流感病毒的研究也基本上来源于Ａ型流感病毒，本文中“流感病毒’， 多指“Ａ型流感病毒”。图１Ｆｉｇ．１Ａ型流感病毒模式图（引自Ｈａｔｔａ，２００２）Ｓｃｈｅｍａｔｉｅ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ（Ｈａｔｔａ，２００２）图ｌ是Ａ型流感病毒的一个模式图。流感病毒的基因组由单股、负义ＲＮＡ片 段缎成，Ａ型和Ｂ型分为８个片段（ｃ型分７个片段），编码１１种功能蛋白，片段 ｌ、２、３分别编码三个聚合酶蛋白ＰＢ２、ＰＢｌ和ＰＡ；片段４编码血凝素ＨＡ；片段５ 编码核蛋白ＮＰ：片段６编码神经氨酸酶ＮＡ：片段７编码基质蛋白Ｍ１和离子通道 Ｍ２；片段８编码非结构蛋白ＮＳｌ和ＮＳ２；还有新发现的、由片段２的＋Ｉ阅读框编 码的ＰＢｌ一Ｆ２蛋白【８】ｏ病毒粒子外的脂质囊膜伸出许多微粒，其中血凝素（ＨＡ）和 神经氨酸酶（ＮＡ）是２种主要的糖蛋白，也是病毒表面抗原，根据Ｈ和Ｎ的不同， Ａ型流感病毒又可区分为不同亚型，如Ｈ１Ｎ１和Ｈ９Ｎ２，目前已鉴定１５种ＨＡ和９种 ＮＡ亚型［４－６．９，ｔ０１。这些功能蛋白在病毒的复制和致病中各司其职，相互协同作用（见 “综述二”）。ＰＢｌ、ＰＢ２、ＰＡ和ＮＰ是与ｖＲＮＡ结合形成核糖核蛋白复合物（ＲＮＰｓ）卢建红：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及Ｈ９Ｎ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救５的中心蛋白（见下文），Ｍ２的离子通道活性使病毒子内的ｐＨ值改变，进而使Ｍ１蛋 白与ＲＮＰｓ脱离。ＮＳ２的氨基酸末端区包含经典的核转运信号，并且可以与细胞的核转运因子ＣＲＭｌ作用㈣，从而介导病毒蛋白从核内（翻译位点）运输到胞浆，故ＮＳ２又称出核转运蛋白（ｎｕｃｌｅａｒｅｘｐｏｒｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＥＰ）。表１是两个不同亚型（Ｈ１Ｎ１和Ｈ９Ｎ２）的毒株各片段长度情况，这两个病毒只 有ＨＡ和ＮＡ两个片段长度有差别，其它各片段长度完全一致。流感病毒各基因片表１两个不同亚型毒株各片段基因组情况Ｔａｂｌｅ ｌ Ａ ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆ ｔｗｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ｝Ａ／ＰＲ／８／３４（ＨＩＮＤ?｝｝ＭＣｈｉｃｋｅｎ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／Ｆ／９８（Ｈ９Ｎ２）㈣段的序列有一些共同的特点：所有片段（ＲＮＡ）５’末端的前１３个核苷酸都相同， 序列为ＧＧＡＡＣＡＡＡＧＡＵＧＡｐｐｐ５ ７； ３’末端的１２个核苷酸高度保守，序列为３’ＨＯ―ＵＣＧｕ／ＣｕＵｕＣＧＵＣＣ一，靠近３’末端的第４个碱基，有些毒株为Ｕ，有些毒株为Ｃ。 各个片段两端又有一些保守序列，由于３’末端和５ ７末端的部分序列反向互补， ３’末端第１０一１５个核苷酸与５’末端第ｌｌ一１６个核苷酸通过碱基配对形成锅柄状 的二级结构，组成ｖＲＮＡ的启动子成分，对病毒的复制、核酸内切酶和ｍＲＮＡ的多 聚腺苷酸化是必需的【１３，１４］。在每一片段靠近５’末端１５―２１个核苷酸处有一保守区， 其序列为ｐｏｌｙ（Ｕ），这一保守区在病毒ｍＲＮＡ合成时产生ｐｏｌｙ（Ａ）的终止信号ＩＩ”， 而ｃＲＮＡ却没有ｐｏｌｙ（Ｕ），这也是区分ｖＲＮＡ和ｃＲＮＡ的标志。２流感病毒的复制 由于流感病毒基因组是负义的ＲＮＡ，其基因组不具有感染性，各个ＲＮＡ片段必６扬州大学博士学位论文综述须与聚合酶蛋白（ＰＢ２、ＰＢｌ、ＰＡ）及核蛋白（ＮＰ）结合在一起形成核糖核蛋白复 合物即ＲＮＰｓ才有活性（如图１）。病毒感染的第一步是，与宿主细胞表面的特异性 ｆ｛Ａ受体结合，通过融膜进入细胞后，释放出ＲＮＰｓ，ＲＮＰｓ进入细胞核才开始病毒基图２流感病毒复制图解（引自Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，２００１）Ｆｉｇ．２ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒ＇ｌｌＳ（Ｊｕｌｋｕｎｅｎ。２００１）Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｖｉａ ｔｈｅ ＨＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｅｒｓ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｂｙ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏＩｌｏｗｅｄ ｂｙ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆｖｉｒａｌ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．ＶｉｍＩ “ｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｓ）ａｒｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｖｉｍｌ ｍＲＮＡｓ ａｒｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｗｈｅｒｅ ｖｉｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓａｒｅ ａｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ．Ｎｅｗｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，ＮＰ，ＮＳｌ，ａｎｄ ＮＳ２ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ（ｖＲＮＡｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｌａｒｙ ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）ａｎｄ ｖＲＮＡ ｉｓ ｔａｋｉｎｇ ｐｌａｃｅ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｖＲＮＡｓａｒｅ ａｌ＇ｅｂｙ ｖｉｒａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｔｏ ｖｉｒａｌ ｍＲＮＡｓ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｉｎ ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｖｉｒａｌ ｎｕｃｌｅｏｅａｐｓｉｄｓｎｕｃｌｅｕｓ，ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｗｈｅｒｅ ｂｕｄｄｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔａｋｅ ｐｌａｃｅ．卢建红：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及Ｈ９Ｎ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救７因维的复制和转录，每个ＲＮＡ片段单独组成一个转录单位，转录出ｍＲＮＡ和互补ＲＮＡ （ｃＲＮＡ），ｍＲＮＡ翻译合成病毒蛋白，ｃＲＮＡ复制生成病毒负链子代ＲＮＡ，进而在细胞 浆中组装成完整的病毒粒子［１６ｌ。图２是流感病毒复制的模式图【ｍ。流感病毒复制 的各个步骤分述如下。 ２．１吸附、穿膜和脱壳 病毒粒子队突起识别和结合宿主细胞表面含唾液酸的特异性受体，使病毒与 宿主细胞接触，然后被吞入饮胞，饮胞与溶酶体融合使胞内ｐＨ值降到５．０左右， 病毒粒子ＨＡ蛋白构型改变使位于轻链ＨＡ２ Ｎ端的融合序列暴露，引起病毒囊膜与 细胞膜融合，病毒粒子内部的核衣壳释放到胞浆内【１８．１９１。 ２．２基因组的转录与复制 初始ｍＲＮＡ的转录：病毒脱去囊膜后其核酸片段进入宿主细胞核。首先病毒ＲＮＡ 聚合酶结合到宿主ｍＲＮＡ的５’端，由于ＰＢ２的内核酶活性，切下１０一１３个核苷酸，这 一序列带有帽状结构，可直接作为引物［ｇｏ，２ｔ］。引物加上后，ＰＢｌ以病毒ＲＮＡ为模板 催化合成链的起始和延伸。加上去的第一个核苷酸是Ｇ，它与病毒ＲＮＡ聚合酶的３７端第二个核苷酸互补，可见，病毒转录酶不转录３’端的第一个核营酸（ｕ）。当链 延伸到１１－１５个核苷酸长度时，引物被释放下来，但３ ７端的Ａ仍保留在ｍＲＮＡ上，因 此病毒ｍＲＮＡ的５’端仍为ＡＧＣ。当链延伸到近５’端的ｐｏｌｙ（ｕ），以此为模板合成ｐｏｌｙ（Ａ）尾后终止链的延伸。因此，病毒ｍＲＮＡ是病毒ＲＮＡ的不完全转录物［２２啪Ｊ。ｍＲＮＡ在核内合成后，很快转移到细胞浆翻译病毒蛋白。 互补ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）的合成和子代病毒基因组的复制：ｃＲＮＡ是ｖＲＮＡ的完全转录物， ５’末端为ｐｐｐＡ，３’末端没有ｐｏｌｙ（Ａ）。上述的ｍＲＮＡ合成不需要病毒蛋白即可进 行，而ｃＲＮＡ必须在有功能性病毒蛋白合成后才能进行，因此其合成的时间ＬｇｍＲＮＡ 晚。ｃＲＮＡ合成所需的酶是聚合酶复合物，但病毒的某些蛋白如ＮＳＩ、ＮＳ２和Ｍ２也参 与这一过程。这一过程不需要帽子结构和引物参与【２６∞Ｉ。因为流感病毒基因组８ 个片段的末端序列都相同，所以转录酶识别每个片段的机会是均等的，这样每个 片段转录ｃＲＮＡ的速率都相同。ｃＲＮＡ合成后可作为模板，在转录酶复合物的催化下 忠实地合成子代病毒ｖＲＮＡ。 ２．３病毒蛋白的合成 以新生成的ｖＲＮＡ作为模板，在ＲＮＰｓ参与下，合成次级ｍＲＮＡ。ｍＲＮＡ在核内合 成后转移到细胞浆在核糖体上翻译病毒蛋白【２８】。早期ＮＰ和ＮＳｌ合成占优势，而后 ＮＳｌ合成下降，Ｍ１、ＨＡ和ＮＡ蛋白合成上升，而ＰＢ２、ＰＢｌ和ＰＡ在整个感染过程中 一直不断地合成，但合成速度很慢。Ｍ２的合成过程不太清楚。晚期，ＮＳｌ调节Ｍ扬州大学博士学位论文综述一和ＮＳ ｍＲＮＡ的剪接使之分别形成Ｍ２和ＮＳ２ ｍＲＮＡ。ＰＢｌ、ＰＢ２、ＰＡ和ＮＰ又回到细胞核以形成ＲＮＰｓ。ｉｌ和ＮＳ２也转运到核内，并与ＲＮＰｓ相互作用，调节新合成的ＲＮＰｓ 从核内转运到胞浆中【１６】。 ２．４病毒粒子的装配 首先ＨＡ和ＮＡ插入到细胞膜，然后Ｍ１移向细胞浆膜的内侧面，非连续地贴补 使之增厚。ＮＰ在细胞浆合成后首先以游离状态存在，但很快进入细胞核与新合成的ｖＲＮＡ结合形成核农壳。核衣壳又从细胞核运出到Ｍ１所在的位置，准备出芽㈣。２．５病毒的出芽和释放 这个过程可持续数小时而不溶解被感染的细胞，机理尚不清楚。Ｍｌ合成后到 达细胞膜并与ＨＡ、ＮＡ或Ｍ２的胞浆域之间相互作用可能是出芽的信号。ＮＡ去除病 毒囊膜上的唾液酸，避免子代病毒在细胞膜上的吸附聚集从而促进病毒粒子的释 放。病毒成熟的最后一步是靠宿主的蛋白酶将ＨＡ裂解为ＨＡｌ和ＨＡ２，使病毒粒子 具有感染性进入新一轮的复制，这个裂解过程可能在胞外完成【“。３病毒反向遗传操作技术体系的建立 病毒拯救技术经过发展，现在指的就是使用以质粒为基础的系统即从克隆的 ｅＤＮＡ产生病毒的过程ｉｊ…。建立体系主要包括ｅＤＮＡ的合成、基因组全长片段的克隆 和序列测定、转录／表达载体的构建和序列验证、共转染拯救出病毒粒子、根据目 的病毒应具有的特性如血凝性和预先引入的突变基因验证新生病毒等内容。图３ 是不分节段负义ＲＮＡ病毒拯救的一个模式图ｐ“，它的策略是，用含有病毒全长 ｅＤＮＡ的质粒与表达核蛋白Ｎ、磷蛋白Ｐ、ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶Ｌ的质粒共转 染细胞，所有质粒的表达都是在Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶的启动子控制下，因此细胞需要先 转染编码Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶的重组痘病毒，ｖＲＮＡ才能合成并启动病毒复制圈。 基因组全长片段的克隆与转录／表达载体的构建是反向遗传操作技术的关键步 骤。近年来，随着高保真聚合酶的使用和长链ＲＴ―ＰＣＲ技术的发展，使得一次性扩 增出病毒基因组全长ｅＤＮＡ成为可能。尽管这样，也可能会遇到ｃＤＮＡ合成时的错配。 长序列还容易具有对转化菌株的毒性序列，这可通过使用更低拷贝菌株（如Ｅ．ｃｏｌｉ Ａｂｌｅ飞）［３２１、质粒扩大培养时用２８＂Ｃ而不是常用的３７＇（２［３３１或将ｅＤＮＡ序列分段克 隆到不同质粒，在体外转录时再连成全长ｅＤＮＡ口４】等办法解决。对于不分节段的病 毒，大多数研究者均采取重叠ＰＣＲ技术和“分段克隆”的策略，然后将基因组各片 段依次克隆到复制严谨性较高的低拷贝载体上口¨”。流感病毒的基医组分片段， 最长的片段（ＰＢｌ和ＰＢ２基因）为２．３ｋｂ，可以一次扩增各片段ｐ“。在构建ｃＤＮＡ卢建红：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及ＨｇＮ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救９图３不分节段的负义ＲＮＡ病毒拯救模式图（引自Ｎｅｕｍａｎｎ等，２００２）Ｆｉｇ．３ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ－ｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｎｅｕｍａｎｎ，２００２）Ｃｅｌｌｓａｒｅｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎ．Ｐ ａｎｄ Ｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｗｉｔｈａａｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｆｕ［１－ｌｅｎｇｔｈ ｖｉｒａｌ ｃＤＮＡ，ａｌｌ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆｔｈｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｖＲＮＡ ｉｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅ ｉｓ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ．克隆时，一般均在一处或几处合适的位置上进行沉默突变（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）， 这样便于鉴定拯救出的病毒［３，３７，３叫１１。基因组３’端和５’端对病毒基因转录与表达 有非常重要的调控作用１１３，１４】，其准确性会直接影响拯救效率，克隆可采用ｃＤＮＡ末 端快速扩增法（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡｅｎｄｓ，ＲＡＣＥ）。有的转录载体中使用丁肝核酶序列，就是为了利用核酶的自我剪切功能产生准确的３’端。 在建立病毒拯救系统过程中，大多还要先尝试构建亚基因组或微型基因组或叫 微型复制子系统（ｍｉｎｉｒｅｐｌｉｃｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）１３”。感染性亚基因组只包含部分基因组 片段，包装进病毒粒子后，在病毒ＲＮＰｓ提供所需酶的作用下进行繁殖。因其片段 较小，易于复制，可竞争性干扰全长ＲＮＡ的复制，故叫缺陷干扰粒子（ＤＩ）。内部 缺失型的ＤＩ具有３’端引导区和５’尾随区及中间的顺反子（功能ＤＮＡ），因此能转 录和复制。研究功能性ＲＮＰｓ的组装常用小的ＤＩ ＲＮＰｓ。在Ｔ７启动子下游插入报告 基因或较短的病毒基因组片段，两边为病毒ＲＮＡ复制所必需的病毒前导序列和尾随 序列等调控序列，即构成ｃＤＮＡ来源的微型基因组，与Ｔ７启动子控制的蛋白表达基扬州大学博士学位论文综述一因的质粒共转染，微型基因组在细胞内复制和转录，可通过鉴定报告基因的表达来 初步衡量所建立的拯救系统Ｈ２’４引。Ｐａｔｔｎａｉｋ和Ｗｅｒｔｚ［删通过构建水泡性口炎病毒 所有病毒蛋白的表达载体，第一个建立了完全使用质粒的微型复制子系统。利用微 型基因组的研究，阐明了各种病毒复制形成功能性ＲＮＰｓ需要的蛋白组成，例如，Ｌ、Ｎ、Ｐ为弹状病毒和副粘病毒复制所必需眦４３１４５”１：对于马尔堡病毒，Ｌ、ＮＰ和ＶＰ３５（相当于Ｐ）蛋白可组成最小的复制单位【５”，而与其很相近的埃波拉病毒还需要ＶＰ３０蛋 白的参与”“。对布尼亚病毒和沙粒样病毒来说，ＮＰ和Ｌ蛋白则足以使其微型基因组有效转录和复制Ｈ。”Ｊ，流感病毒复制所必需的蛋白是核蛋白（ＮＰ）和３个聚合酶 死单位ＰＢｌ、ＰＢ２、ＰＡ蛋白ｐ““Ｊ。此外，选择转染用的真核细胞，其转染效率和目的病毒在细胞上的复制与生长能力是要考虑的重要因素，还要根据使用的转录／表达操作系统来选择细胞，ＣＯＳ一１（猴肾细胞）、ＣＯＳ一７、２９３Ｔ（人胚肾细胞）、Ｖｅｒｏ（非洲绿猴肾细胞）、ＭＤＣＫ （犬肾细胞）和ＭＤＢＫ（牛ｌ肾细胞）是流感病毒拯救中常用于转染与病毒增殖的细胞系。４从克隆的ｅＤＮＡ产生负义ＲＮＡ病毒的概况 最早建立的反向遗传操作系统是针对正义ＲＮＡ病毒的口８’５９ｌ，用病毒全长ＲＮＡ 转染真核细胞即可使蛋白获得表达，从而使病毒复制。与正义ＲＮＡ病毒相比，负 义ＲＮＡ病毒的拯救比较困难，因其基因组没有感染性，病毒复制和转录除了需要 ｖＲＮＡ以外，还需要病毒聚合酶复合物的共表达，更重要的是，基因组必须与核衣 壳蛋白形成复合物。 从克隆的ｃＤＮＡ产生负链的ＲＮＡ病毒，要求形成功能性的ＲＮＰｓ，这个过程对于 基因组不分节段的病毒来说显得相对容易，Ｓｃｈｎｅｌｌ等（１９９４）【６０１首次报道了完全 以质粒为基础的狂犬病病毒拯救，载体启动子为Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶，用编码全长基因 组以及核蛋白和聚合酶的质粒共转染预先己感染表达Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶的痘苗病毒的细胞，Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶启动全长基因组的转录，基因组在病毒聚合酶和核蛋白的作用下复制和转录．从而启动病毒的复制圈。这个系统成功的关键因素是从克隆ｃＤＮＡ转录合成的是正义的反基因组ＲＮＡ，它与负义的基因组刚Ａ比较，不会与Ｌ、Ｐ、ＮＰ的ｍＲＮＡ杂交，因此不会干扰病毒的产生。但在Ｓｃｈｎｅｌｌ等的报道中，拯救效率不高，每１０７个转染细胞产生１个感染性子病毒。此后，其它一些不分节段的病毒拯救获得成功ｏ”。７“。８１ Ｊ。完全以质粒为基础的负义ＲＮＡ病毒（包括流感病毒）拯救的 概况见表２。卢建红：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及Ｈ９Ｎ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救１通过删除、插入和置换等突变进行病毒拯救，更清楚地了解负义ｖＲＮＡ３７端在病毒复制与转录中作为启动子的元素【８””】。在对副粘病毒科的一些成员的研究 中还发现了“６碱基原则（ｒｕｌｅｏｆｓｉｘ）”，基因组核苷酸总数为６的倍数时，病毒能更有效地转录、复制和包装。新城疫病毒、猿副粘病毒５型、仙台病毒、人副粘 病毒３型、人副流感病毒２型和麻疹病毒等都遵循６碱基原则１３３，４９，６１，７７，９㈣６１，但严 格性不同，肺病毒属的呼吸道合胞体病毒和弹状病毒科的水疱性口炎病毒不遵循这 个原Ⅲ１ｊ［９７，９８１。５流感病毒反向遗传操作技术的历史与发展 分节段的负链ＲＮＡ病毒拯救工作则相对滞后，因为要在细胞内形成多个功能 性ＲＮＰｓ。Ｂｒｉｄｇｅｎ等（１９９６）ｍＩ首次报道了由ｅＤＮＡ产生布尼安病毒（基因组分３ 个片段），流感病毒基因组分为８个片段（ｃ型为７个片段），其拯救工作无疑是个 挑战，而且，与其它负链ＲＮＡ病毒不同，流感病毒基因组在细胞核内复制，因此 必须在细胞核内同时含有８种功能性的ＲＮＰｓ。 ５．１用于流感病毒复制与转录研究的系统 一个感染循环的启动需要完整的核衣壳结构的存在，ＲＮＡ只有以核衣壳结构的 方式存在才能作为病毒ＲＮＡ聚合酶的功能模板。把重组ＲＮＡ引入到负链ＲＮＡ病毒 的基因组的技术首先在流感病毒中得到了描述。产生流感病毒的第一步是要重建 功能性的ＲＮＰｓ，早期并不知道流感病毒ＲＮＰｓ中心蛋白的组成，通过用去污剂处理 病毒或其它方法分离、纯化ＮＰ和聚合酶蛋白重建ＲＮＰ复合物（ＲＮＰｓ）”７，９９１，证实 ＲＮＰｓ与短的或全长ｖＲＮＡ结合形成了功能完全的ＲＮＰｓ［㈣１０“。这些方法自然不适应 于完全以克隆的ｃＤＮＡ质粒为基础的病毒拯救，其意义在于证实了流感病毒ＲＮＡ复 制和转录形成ＲＮＰ最小单位的中心蛋白是３个聚合酶（Ｐ）蛋白和核蛋白（ＮＰ）。 也就是有上述研究结果作指导，研究者们进一步建立了能稳定表达这４种蛋白的 系统（如痘苗病毒、ＳＶ４０）［１０２，１０３１或细胞系【Ⅲ１，把体外转录的裸露ｖＲＮＡ转染预先 感染这种痘苗病毒或ＳＶ４０的细胞，可启动ｖＲＮＡ的复制和转录【ｌ”－１”】，裸露的ｖＲＮＡ 被聚合酶和ＮＰ识别，从而得到衣壳化和扩增。这些细胞培养体系可以允许对ｖＲＮＰ 非编码区进行修饰以鉴定其重要的启动与调节信号作用，也允许对聚合酶和ＮＰ蛋 白的诱变以研究它们在病毒复制和转录中的功能１１０６ｌ。这种系统的缺点是无法掌握 Ｐ蛋白和ＮＰ蛋白的比例使之尽量与自然感染细胞中的一致，这样就可能影响到病 毒的复制与转录。但是，这种系统的建立，显示出已经能在细胞内产生人工的ｖＲＮＰｓ。』Ｌ―――一Ｔａｂｌｅ ２ Ｖａｍｉｌｙ Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ Ｇｅｎｕｓ Ｖｅｓｉｅｕｌｏｖｉｒｕｓ塑丛盔兰犍主堂垡堡壅表２从克隆的ｅＤＮＡ产生负义ＲＮＡ病毒Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｅＤＮＡ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖ／ｒｕｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ簦堕二［６２］Ｌａｗｓｏｎ ｅｌ以ｆ１９９５１ ｆ６４］Ｗｈｅｌａｎ『６０］Ｓｃｈｎｅｌｌｅｌ ａ１．（１９９５）Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ ＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅＲａｂｉｅｓ ｖ―ｕｓｅｔ ｅｔａ１．ｆ１９９４） ａ１．（１９９５）ＭｏｒｂｉＨｉｖｉｒｕｓＭｅａｓｌｅｓ ｖｗＷ【６３］Ｒａｄｅｃｋｅｆ６４］Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｌａＬ（１９９７） 【６５］Ｔａｋｅｄａ ｅｔａ／．（２０００）Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ Ｃａｎｉｎｅｖｉｒｕｓ［６８］Ｂａｒｏｎ＆Ｂａｒｒｅｔｔ（１９９７） ［３６］Ｇａｓｓｅｎ 【６１］Ｇａｒｃｉｎ ［６７］Ｋａｔｏｅｔｄｉｓｔｅｍｐｅｒｅｌ ａｆ．（２０００）ＲｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓＳｅｎｄａｉ ｖｉｒＩｕｅｔａ１．（１９９５）ａ１．（１９９６）Ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｉｕｅｎｚａ ｖｗｕｓｔｙｐｅ ３ｆ６９］Ｄｕｒｂｉｎ ｅｌ矗（１ ９９７） 【７０］Ｈｏｆｆｍａｎ＆Ｂａｎｅｒｊｅｅ（１９９７）Ｂｏｖｉｎｅｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ［７１］Ｈａｉｌｅｒ ｆ７６］Ｈｅｅｌｅｔａ１．（２０００）ｖｉｒｕｓｔｙｐｅ ３Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ａ１．（１９９７）ｅｔＭｕｍｐｓｖｉｒｕｓｖｉｒｕｓ［７４］Ｃｌａｒｋｅａ１．（２０００）ＨｔａｎａｎｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａＯｐＰ ２［７７］Ｋａｗａｎｏ ｅｌａＬ（２００１）Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ［３７】Ｐｅｅｔｅｒｓ（１９９９）ｅｔａ１．（Ｉ ９９９）ｅｔ【７８］Ｒｏｍｅｒ?Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ ［７９］Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ盯ａ／，（２０００）ａｌＰｎｅｌｕｎｏｖｉｒ∞Ｈｕｍａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ［８０］Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａ１．（１９９５）ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ［７３］Ｂｕｅｈｈｏｌｚ ｅｌ ａ１．（１９９９） 【７５］Ｖｏｌｃｈｋｏｖ“ａ／．（２００１） 【８１】Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔａｌ．（２００２） ［８２］Ｂｒｉｄｇｅｎ＆Ｅｌｌｉｏｔｔ（１９９６） 【８３ｉＮｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａ１．（１９９９） 【８４］Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａＬ（１９９９）ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ Ｆｉｉｏｖｉｒｉｄａｅ Ｅｂｏｌａ－ｌｉｋｅ Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓＶｌｍＳｅＳＢｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ ＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅＢｕｎｙａｖｉｒｕｓＢｕｎｙａｍｗｅｒａ ｖｉｒｕｓ ＡＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ聊ａｅｎｚａＡｖ打ｗ堡２９２１１：塑！堡塑塑！！丝ｆ墅ｊ！！罂！！！！生ｆ！！！！！卢建红：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及ＨｇＮ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救１３５．２以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统 这又是在认识到如上所述的功能ｖＲＮＰｓ能够重建并导入细胞的基础上发展起 来的。研究者们进一步希望能使人工产生的ｖＲＮＰｓ导入病毒粒子。ｃＤＮＡ（可操作 基因）转录合成的ｖＲＮＰ与Ｐ蛋白和ＮＰ形成ｖＲＮＰｓ，再与辅助病毒提供的其它ｖＲＮＰｓ 混合在一起产生有感染性的病毒。辅助病毒就是其它流感病毒（有供筛选的某些 特性），不仅提供进一步ＲＮＡ合成所需的蛋白质，基于基因组的分节段特性，也允 许合成的基因组片段包装进后代病毒中，报告（或目的）基因的活性也在组织培 养物中得到传递。以下描述两种可达到这种目的的策略，图４是这两种策略的综 合模式图。 ５．２．１核糖核蛋白转染法 Ｌｕｙｔｊｅｓ等（１９８９）【１０７ｌ首次报道产生的流感病毒其ｖＲＮＡ是由克隆的ｃＤＮＡ产 生的，在ＮＳ基因编码区位置（不改变非编码区，即启动成分不变）插入氯霉素乙 酰转移酶（ＣＡＴ）基因，在Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶启动子控制之下，这种质粒在体外转录 后与从病毒纯化的Ｐ＋ＮＰ结合成ＲＮＰｓ，再转染已用辅助流感病毒感染的真核细胞， 产生了含ＣＡＴ ＲＮＡ和其它８片段的子代病毒。但经过在细胞传３代，含ＣＡＴ的片 段即不能稳定地保持在病毒中。Ｅｎａｍｉ等口０８】则首次引入突变产生了病毒子。 这种方法需要在含大量辅助病毒的背景中筛选目的（含突变或报告基因）病 毒子。因此必须有强大的筛选系统，例如，可用具有温度敏感性、宿主范围限制、药物抗性等的辅助病毒。此后有一些研究者报道了改进的ＲＮＰ转染方法ｌ””ｌ。５．２．２ＲＮＡ聚合酶Ｉ方法Ｎｅｕｍａｎｎ等（１９９４）１１１３１从与Ｌｕｙｔｉｅｓ等‘１０７１不同的路线建立了可供修饰病毒基 因的系统即ＲＮＡ聚合酶（ｐ０１）Ｉ系统，这一系统不需要体外装配ｖＲＮＰｓ后转染细 胞，不用Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶及其表达系统，而是利用细胞核内的酶ｐｏｌ Ｉ转录出核糖 体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ），ｒＲＮＡ与流感ｖＲＮＡ一样不含５ ７帽子和３７ｐｏｌｙ（Ａ）结构，利用细胞中的ｐｏｌ Ｉ定位于流感病毒复制的地点一细胞核。将ＣＡＴ编码基因的ｃＤＮＡ代 替流感病毒基因的编码区（非编码区不变），然后反向插入ｐｏｌ ｌ的启动子与终止 序列之间，只需将这样克隆的ｅＤＮＡ质粒导入感染了流感病毒即提供ＲＮＰｓ的辅助 病毒的细胞中，就可产生并筛选含目的片段的病毒子。 与ＲＮＰｓ转染法比较，ｐｏｌ Ｉ法虽然也需要辅助病毒，但不需要进行体外ＲＮＡ 转录、蛋白质纯化、体外ＲＮＰ合成和ＲＮＰ转染。依赖辅助病毒的系统病毒拯救效 率低，对筛选困难的基因片段的操作受到限制，需要大量的筛选工作以及体外构 建ｖＲＮＰｓ并转染入细胞的工作，因此都不如只用质粒操作起来简便，但在应用于４扬州大学博士学位论文综述一毒 ｊ｜釜ｌ里帅ｉ图４以辅助病毒为基础的反向遗传操作系统（引￡ＩＮｅｕｍａｎｎ等，１９９９）ＦＩＧ．４ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆｒｅｖｅｍｅ－ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂａｓｅｄ （ｆｒｏｍＮｅｕｍａｒｍｅｔ ａｌ，１９９９）． Ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＰ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＲＮＰｓｏｎｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓｍｅｔｈｏｄ“），ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＮＰａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａ∞ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｉｎｔｏｗ汕ｔｈｅｕｓｅｏｆｉｎ ｖｉｔｒｏ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｖＲＮＡ．Ｃｅｌｌｓ ａ∞ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＲＮＰｓ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｍｓｅ Ｉ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ａ ｅＤＮＡ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ａｍ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏｍｅｔｈｏｄ（两，ａｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ＲＮＡｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅｖＲＮＡ ｔｏ ｂｅ ｒｅｓｃｕｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ ｂｙ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ ｙｉｅｌｄｓｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ呦ｓｃｒｉｐ６０ｎｓｙｎｔｈｅｔｉｃｖＲＮＡ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｐａｃｋａｇｅｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｇｅｎｙ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｕｐｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ．Ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ（ｉ．ｅ．，ｔｈｏｓｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｅＤＮＡ）ａｌ＇ｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．流感病毒的非编码区启动成分分析‘１００，１１０，１１４．’１１ ６】、流感病毒各功能蛋白的作用…７￣１２川卢建红：Ｈ９Ｎ２亚型ＡＩＶ基因组序列分析及Ｈ９Ｎ２和Ｈ５重组流感病毒的拯救１５以及某些特殊毒株如Ａ／ＷＳＮ／３３的特殊表型（如不加胰酶即使ＭＤＢＫ产生病变和快 速生长型）的研究【１２¨中发挥了重要作用。 ５．３能对流感病毒任何片段进行突变的一个特殊系统 Ｅｎａｍｉ等（１９９７）【ｌ”】将纯化的ＲＮＰｓ与一定的ｅＤＮＡ一起孵育，ｅＤＮＡ可以与目 的基因片段进行杂交，再用ＲＮＡ酶Ｈ消化，形成ＲＮＡ―ＤＮＡ杂交体，使由此产生的 ＲＮＰ中不含有鼠的ｖＲＮＡ，把这种ＲＮＰ再与人工产生的含兴趣基因的ｖＲＮＰｓ混合，可得到所需病毒子。Ｅｎａｍｉ等（２００１）【ｌ玎ｌ用这个系统产生了重组流感病毒，预先对其ＮＳｌ蛋白的Ｎ端或Ｃ端区进行了删除，结果ＮＳｌ经过人工操作的病毒均致弱， 删除ＮＳｌ Ｎ末端的病毒所有蛋白的合成水平均降低；而删除ＮＳｌ Ｃ末端的病毒其 Ｍ１合成水平下降，ＮＰ的表达则没有影响．这一研究结果说明ＮＳｌ具有刺激Ｍｌ翻 译的功能。 ５．４完全以克隆的ｅＤＮＡ为基础的反向遗传操作系统 流感病毒的反向遗传操作技术经过１０年的探索历程，终于取得了突破性进展。 Ｎｅｕｍａｎｎ等（１９９９）１８３］及Ｆｏｄｏｒ等（１９９９）Ⅲ】建立了能完全从克隆的ｃＤＮＡ产生流 感病毒的新技术，这也是流感病毒的反向遗传操作技术发展史上的一次转折。５．４．１ＲＮＡ聚合酶Ｉ系统：１７质粒或１２质粒系统Ｎｅｕｍａｎｎ等【８３Ｊ把编码Ａ／ＷＳＮ／３３ ８个ｖＲＮＡ片段的ｃＤＮＡ克隆至人ＲＮＡ聚合酶 （ｐ０１）Ｉ启动子和鼠ｐｏｌ Ｉ终止子之间，转染２９３Ｔ细胞，可由细胞的ｐｏｌ Ｉ启动 合成ｖＲＮＡ，这样，８个基因片段的转录质粒与表达所有病毒结构蛋白（ＰＢｌ、ＰＢ２、 ＰＡ、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、￣１２和ＮＳ２）的９个质粒构成１７质粒系统，共转染细胞，上 清中产生了８×１０７个／ｍｌ的感染性病毒子。与以前的几种方法相比，这种方法应用 简便，只需要ＤＮＡ克隆纯化和转染技术，这在任何分子生物学和病毒学实验室都 可以推广。由于不再需要辅助病毒，也就免去了大量烦琐的筛选工作。在蛋白表 达载体中也可以只使用表达３种聚合酶和ＮＰ的４种质粒即构成１２质粒系统（见 图５）。在１７和１２质粒系统中，虽然共转染的质粒数目很多，但转染上清中均产 生了１０７个／ｍｌ以上的感染性病毒子，这样的效率在所有负链ＲＮＡ病毒的拯救中都 是最高的，其中重要的原因之一是使用的２９３Ｔ细胞具有很高的转染效率并且细胞 内具有所有启动病毒复制的成分，尤其是细胞中具有足够的ＲＮＡ聚合酶Ｉ，并且 能随着细胞增殖保证ｐｏｌ Ｉ的供给。 Ｆｏｄｏｒ等【叫报道的与Ｎｅｕｍａｎｎ等的系统类似，系统