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DNA甲基化研究方法的回顾与评价
　中国妇幼健康研究2006年第17卷第6期
个基因组范围内扫描的差异甲基化(DMH ) 杂交和用于检测某个位点的甲基化特异性的微阵列(MS O ) [24]。前者类似于mRNA 表达谱或c DNA 微阵列, 是CpG 岛微阵列; 后者类似于寡核苷酸微阵列, 是针对CpG 二核苷酸位点的甲基化特异性寡核苷酸微阵列[18]。
M S O 要求预先设计一对含有2个不相邻的GC (或AC ) 的探针, 用于识别甲基化和非甲基化的序列, 其中含GC 的探
) 识别甲基化序列, 含AC 的探针(5′针(5′2GC 2GC 23′2AC 2AC 2
) 识别非甲基化序列, 探针的5′3′端通过L inker 固定于玻璃板上。首先对待研究片段用重亚硫酸盐处理, 将非甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶, 甲基化的不变, 再行PCR 扩增, 产物的3′端用荧光素标记, 移至连有探针的玻璃板上进行杂交, 法一定要设立对照。测, 位点的信息, , 影响分析。
2. 2. 11报道了甲基化敏感性斑点分析(methylati on
sensitive dot bl ot assay,M S 2DBA ) 方法, 能够定量或半定量分析样本中的甲基化水平。这个方法的过程是:先用重亚硫酸盐处理待测DNA 片段, 随后以非CG 区的引物行PCR 扩增, 将扩增产物变性后转移到尼龙膜上, 用3′端D I G 标记的含有2个CG (或TG ) 的双核苷酸探针与DNA 杂交, 随后用带有荧光标记的抗D I G 抗体与之反应。与双CG 的探针获得杂交样本含有甲基化, 而与TG 探针杂交的样本则未被甲基化, 通过比较斑点上荧光的强度进行甲基化水平定量。
这种方法的优点是快速、简便、易于掌握, 一次检测多种样本, 包括石蜡包埋样本。缺点是:①检测序列不能过长; ②若探针错误杂交或重亚硫酸盐处理不完全, 则可能出现假阳性或假阴性结果。
2. 2. 12M S 2MLP A M S 2MLP A (methylati on 2s pecific multi p lex ligati on 2dependent
p r obe amp lificati on ) 是Nygren 等在MLP A 基础上改进后提出的用于检测特异位点甲基化的方法。MLP A 中探针设计要求:由两个寡核苷酸部分构成, 其中短的部分由合成产生, 长的部分来源于phage M13的衍生物, 后者中部含有一个靶基因标志的不同定长的核苷酸填充序列, 以利于辨别基因组中同时检测的不同靶基因。两个寡核苷酸探针的杂交序列要求与靶基因的CpG 位点互补, 两个寡核苷酸的末端分别连有5′端及3′端PCR 引物。不同于MLP A 的是M S 2MLP A 探针的杂交序列要包含一个甲基化敏感限制性内切酶(如Hha Ⅰ) 的识别位点。具体过程:先用探针与靶基因进行杂交, 然后降低反应体系温度, 向其中加入连接酶和Hha Ⅰ。若靶基因中Hha Ⅰ识别的位点为非甲基化的, 则两个寡核苷酸部分不能连接; 若含有的位点存在甲基化, 则Hha Ⅰ不切割, 探针顺利连接, 随后的PCR 照常进行。最后根据扩增片段明确定靶基因的甲基化情况。
这种方法的优点是:①需要样本的数量少, 由于探针具有非常短的识别序列, 因此MP LA 可以用于局部降解的DNA, 如石蜡包埋的DNA 样本; ②可用于分析大量混合样本, 可一次检测多个靶基因中CpG 位点的甲基化情况。缺点是探针连接位点受限制性内切酶位点识别的限制, 且要考虑到所用
Clement 等
酶的反应适宜温度。
2. 3甲基化新位点的寻找
随着甲基化研究水平的提高, 近年来, Hatada I 等(1991年) 、Costell o 等(2000年) 提出了以限制性标记基因组扫描(RLGS ) 为代表的一系列新兴的全基因组甲基化扫描分析的新技术, 另如, Huang 等(1997年) 的甲基化敏感的限制性指纹谱技术(methylati on 2sensitive restricti on finger p rinting technique, MS RF ) 、Frig ola 等(2002年) 的甲基化间区位点扩增(a mp lificati on of inter 2methylated sites, S ) 等新技术的出现是将甲基化敏
, 与Not (, 检测、扫描全基因组甲基化的情50%左右的CpG 岛; ②MS RF 用到限制性内切酶, 如:Mse Ⅰ、B st U Ⅰ, 并采用10碱基随机引物扩增差异甲基化片段, 几乎可以检测全基因组所有CpG 岛, 但此方法复杂、需要后续鉴定、技术难度高; ③A I M S 技术用甲基化敏感和甲基化不敏感同裂酶(is oschizo mer ) 裂解以及接头(adap t or ) 引物扩增甲基化间区序列, 此方法可通过接头引物控制扩增带的复杂程度, 且所得片段在200～2000bp 之间, 可以直接克隆到载体并测序。优点是简单方便, 可以作为全基因组差异印记基因筛选的有效工具。
2. 3. 1限制性标记基因组扫描
限制性标记基因组扫描(restricti on land mark genom ic scanning, RLGS ) 联合使用了限制性内切酶及二维电泳, 是对整个基因组的甲基化状态进行分析以发现新甲基化位点的方法。其过程是:先用甲基化敏感的稀频限制性内切酶Not Ⅰ消化待测样本, 识别序列中甲基化位点被保留, 用32P 2dCTP 和32P 2dGTP 标记末端, 再用甲基化不敏感、切割频率稍高的EcoR Ⅴ消化, 产生Not Ⅰ2EcoR Ⅴ片段行一维电泳, 随后再用更高频的甲基化不敏感的内切酶H inf Ⅰ切割, 产生的Not Ⅰ2H inf Ⅰ行二维电泳。这样甲基化的部分被切割开并在电泳时显带, 得到RLGS 图谱与正常对照得出缺失条带即为甲基化的可能部位。
这种方法可一次得到多个CpG 岛甲基化的情况, 利于肿瘤组织基因组中新甲基化位点的寻找。缺点:①RLGS 图谱不能完全确认所缺失的片段是由于甲基化所致还是由于DNA 样本本身缺失所致; ②RLGS 对样本DNA 质量要求高; ③结果分析复杂, 不易解释。
2. 3. 2MBD 柱层法根据MBD 蛋白家族和MeCP2的特性提出
了MBD 柱层法(methyl 2CpG binding domain colu mn chr omat ography ) , 用于筛选和发现基因组中的甲基化位点, 并且将其与重亚硫酸盐基因组测序法比较后得出:用MBD 柱层法分析得出的甲基化片段均能被重亚硫酸盐测序法证实。
CpG 岛的甲基化在基因沉默中起着重要作用。B ird 等(1999年、2002年) 认为这种沉默并非是由于甲基基团阻碍了转录因子的结合, 而是由一些能与启动子甲基化位点特异性结合的蛋白发挥作用[28,29]而引起的。现已发现的能与CpG 甲基化位点特异性结合的蛋白有两种:一种是MeCP1, 它能够与对称性多甲基化CpG 位点相结合; 另一种是MeCP2, 不同于MeCP1的是它能够与单甲基化CpG 位点特异结合, 且不与半
Shiraishi 等
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DNA甲基化及其检测方法一、概念& 所谓DNA 甲基化是指在DNA 甲基转移酶( DNAmethyltransferase, Dnmt)的作用下，以S- 腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中5 位碳原子上。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达。多种基因的启动子区和第一外显子富含CpG，而CpG相对集中的区域称之为CpG 岛。生理情况下，CpG 岛多为非甲基化，大部分散在的CpG二核苷酸则为甲基化状态。细胞分裂复制的DNA子链必须进行适当地甲基化修饰，否则其遗传性不稳定、易变异，其染色体脆性增加、易断裂。通过对DNA 甲基化模式的研究，人们发现肿瘤细胞中存在异常的DNA 甲基化状态：基因组整体甲基化水平降低，导致遗传不稳定性增加；组织特异性基因的启动子区域出现从头甲基化；癌基因多为不充分甲基化，导致重新开放或异常表达；抑癌基因多为过度甲基化，从而表达受抑制。迄今为止，关于肿瘤抑癌基因的失活与该基因的启动子区域(CpG 岛)的过度甲基化的直接关系有大量的报道。许多与细胞生长增殖相关的基因，如与细胞周期相关的基因pRB、p16、p15、p14ARF 和p73，以及与DNA 损伤修复有关的基因，如O6-MGMT、BRCA1 和hMLH1 等，它们启动子区域的异常甲基化都与该基因的失活有关。二、功能DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。1、DNA 甲基化与细胞分化DNA& 甲基化在细胞分化中扮演了关键的角色,细胞分化的方向由组织特异性基因的特异表达决定,而这些组织特异性基因都携带有特殊的标记,即特定的基因甲基化。这些甲基化的基因控制基因的特异表达,使细胞向特定的方向分化,形成不同的组织器官,促进个体的生长发育。Hsieh 和Gage在对神经干细胞的命运的表观基因控制中发现,组蛋白H3 甲基化的位点不同可导致神经干细胞向不同方向分化。若在STAT 3 结合位点的H32K9 甲基化,则导致神经干细胞丧失分化功能; 若甲基化发生在H32K4 上, 则促使神经祖细胞向星形胶质细胞分化; 若H32K9 和H32K4 位点均去甲基化,则促使神经祖细胞向神经元分化。因此,不同位点的组蛋白H3甲基化介导不同位点的DNA 甲基化,从而影响细胞向不同的、特定的方向分化。2、 DNA 甲基化与胚胎发育在从精原细胞到精细胞发育过程中,精原细胞 (二倍体)将抹去DNA 水平上已存在的全部甲基化修饰,并重新进行特征性化学修饰,也就是基因印迹。这种特征性化学修饰会随减数分裂进入精细胞,它并不改变DNA 的一级结构,但它会影响特定基因的表达。同样,卵细胞也带有了卵细胞特征性化学修饰。DNA 甲基化在胚胎发育中经历了一系列动态变化: 在成熟的卵和精细胞中已有许多CpG 位点被甲基化;普遍的去甲基化发生在胚胎植入前期,非甲基化状态保持到16 细胞的桑椹期前;但着床后,有一个强烈的重新甲基化过程,除包含CpG 岛的看家基因外,其它基因都卷入这个过程。在继后的发育阶段,组织特异基因经历选择性的去甲基化,促进形成合子中特异表达的细胞类型。中科院生化细胞所的徐国良就是从事动物发育(包括胚胎与成体干细胞分化)过程中DNA甲基化及组蛋白修饰在基因表达调控中的作用及其分子机理的研究。3 、DNA 甲基化与遗传印迹遗传印迹见于哺乳动物发育、基因表达、X 染色体失活、单亲二体及某些疾病。DNA &甲基化是遗传印迹发生和维持的主要机制。遗传印迹形成的最可能机制是配子形成过程中染色体等位基因中的一个如父源性生甲基化,导致基因呈单等位表达。它于配子形成过程中建立 ,整个发育过程中维持,通常在发育早期发挥作用,是一种可逆的表遗传现象 ,但各个时期作用的确切机制尚不清楚。在基因组印迹中甲基化发生在配子发生至受精前。经历胚胎早期广泛的去甲基化和重新甲基化后, 在胚胎发育中继续保持双亲特异的甲基化模式。甲基化在基因组印迹中有两种形式:& ①一些基因如 H19、SNRPN 和XIST等在启动子区CpG 岛上有等位基因差异的甲基化; ②另一些基因如Igf2r在非启动子区甲基化, 并与其表达呈负相关。4、DNA 甲基化与肿瘤自1986年Baglin首次报道了人类肿瘤中出现CpG岛的高甲基化状态后，迄今已发现多个甲基化敏感的肿瘤相关基因，这些基因的异常甲基化在肿瘤的形成中起着重要的作用。不同的人体组织发现，肌肉或者肝脏中的同一种基因，其甲基化模式可以有非常明显的差异。这一研究结果证实了DNA甲基化在不同组织上具有不同模式，这为肿瘤的早期诊断提供了一定的依据。研究发现, 多种癌基因如 raf、c-myc、c-fos 等在肿瘤组织中普遍低甲基化, 高甲基化主要发生在正常情况下非甲基化的CpG 岛上, 如Rb、p16 等抑癌基因在多种肿瘤中 5′区的高甲基化而失活。Schmiemann等通过甲基化特异性定量PCR(methylation-specific real-time PCR，QMSP)检测发现肺癌患者中存在APC、p16(INK4a)、RASSF1A 等基因的甲基化状态异常。此外检测肿瘤DNA 的甲基化模式可用于前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌等肿瘤的早期诊断也有相当数量的报道。以上4类研究中，细胞分化和胚胎发育研究基本以定性观察为主，如FITC，我们主要的客户集中于遗传印迹和肿瘤研究。遗传印迹以检测基因表达为主，适合采用qPCR作为主要检测手段；肿瘤研究以检测基因表达和甲基化比例为主，适合采用qPCR和PyroSequencing作为主要检测手段。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。三、检测方法3．1基因组甲基化水平(Methylation Content)的分析:1. 高效液相色谱(High-performance Liquid Chromatography, HPLC)HPLC是一种比较传统的方法，是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增高。故而能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。该方法由Kuo等1980 年首次报道。过程是将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5 mC/(5mC+5C)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA甲基化水平的标准方法。2. 高效毛细管电泳法(High-performance Capillary Electrophoresis, HPCE)这是一种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。用HPCE方法处理DNA水解产物来确定5mC水平，简便，经济且敏感性高。在这两种方法的基础上，不断有新方法改进，包括，变性高效液相色谱(DHPLC)，逆向高效液相色谱(Reversed phase HPLC)以及HPLC与薄层色谱(Thin-layer Chromatography, TLC)相结合的HPLC-TLC方法。除上述方法外，还有其他原理的检测方法，如单纯的TLC方法以及最佳近邻TLC(Nearest neighbour TLC)，基于抗5mC的免疫学技术(Anit-5mC immunological techniques), SssI 甲基转移酶法(SssI methyl Acceptance Assay)，在重亚硫酸盐处理的基础上而进行的氯乙醛反应法(Chloacetaldehyde reaction)和酶区甲基化分析(Enzymatic Regional methylation Assay, ERMA)。 必须指出，以上各种方法虽然能够明确检测出目的序列中所有CpG位点的甲基化状况，但并不能对甲基化位点进行定位。3．2 候选基因(Candidate Gene)甲基化分析:1. 甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法( methylation-sensitive restriction Endonuclease -PCR/Southern, MSRE-PCR/Southern)这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后，进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HpaⅡ-MspⅠ(CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。该方法较简便、成本低,可进行自动化和高通量基因检测,能通过内切酶的识别位点来反映甲基化的精确定位。但此法需要较多的样本,只能检测有限的含酶切位点的DNA 甲基化状态,且有可能因为酶切反应的不完全而产生假阳性；同时该方法无法对样品中甲基化的程度作出定量判断。2. 重亚硫酸盐测序法(Bisulphite& Sequencing)&该方法首先用重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化。此方法是精确度很高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵；同时该方法无法对样品中甲基化的程度作出定量判断。3. 甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)&该方法同样DNA先用重亚硫酸盐处理，随后行引物特异性的PCR。其设计两对引物，分别与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链。检测MS-PCR扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；反之亦然。MSP可检出多种甲基化作用且可用于石蜡包埋样品的分析。不足之处在于: (1) 引物的选择和设计非常关键, 否则易导致假阳性;(2) MSP 法是以引物中所有CpG 位点胞嘧啶均以完全甲基化为前提设计的,而事实上甲基化的CpG岛中却并非每个CpG位点都完全甲基化,所以,MSP 法常常存在目标片段难扩增, 或者特异性差等问题,不能反映整个CpG 岛甲基化状态；(3) 若待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡，则检测时较为复杂；(4)MSP法无法对样品中甲基化的程度作出定量判断。4. 甲基化荧光法(MethyLight)结合重亚硫酸盐处理待测DNA片段，设计一个能与待测位点区互补的探针，探针的5’端连接报告荧光，3’端连接淬灭荧光，随后行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA聚合酶5′到3′端的外切酶活性会将探针序列上5′端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平。Methylight 最大的优势在于其高通量和高敏感性。且无需在PCR 后电泳、杂交等操作,减少了污染和操作误差。但Methylight 无法得到像NaHSO3 测序法那样确定的甲基化信息,也不能似COBRA 确定单个CpG 的甲基化比例。5. 焦磷酸测序(Pyrosequencing)该方法，由4种酶催化同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就能将其加入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，其高度与核苷酸数目成正比。当用于甲基化检测时，经重亚硫酸盐处理的序列可以看作是C-T型的SNP改变。其操作简单，结果准确可靠，可以了解特异位点甲基化情况且不受内切酶的限制，可以行大规模分析，可以对样品中甲基化的程度作出定量判断。但是此方法对于DNA序列长度的要求较高，无法检测较长的序列。6. 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfiterestriction analysis, COBRA)这种方法对标本DNA行重亚硫酸盐处理及PCR扩增，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶对转化后PCR产物切割的特性以识别原标本DNA的甲基化状况。该方法相对简单，不需预先知道CpG位点及样本序列。本法能定量检测微量DNA 样品特定基因位点的甲基化状态,但其定量信息的准确性取决于亚硫酸盐处理DNA 样品是否完全,且甲基化分析也受限于种类不多的限制性内切酶的酶切位点。检测结果为阴性并不完全排除样品DNA 中发生甲基化的可能性。7．甲基化敏感性单核苷酸引物延伸（methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE）Ms-SNuPE 的原理为: 样本DNA 经亚硫酸氢钠修饰,PCR 扩增目的片段,产物电泳分离后作为Ms-SNuPE 模板。分别针对所检测的CpG 位点设计上游引物,使引物3′紧邻C。然后将模板、引物、Taq 酶及32P 标记的dNTP 混合,进行单核苷酸延伸反应。若所检测的CpG 位点发生甲基化,则32P 标记的C 掺入到PCR 产物中; 反之, 未甲基化掺入的则为T。再电泳分离产物,成像。根据某一CpG 位点的CPT 信号强度比,可定量其甲基化程度。也可不经电泳,PCR 产物直接转移到尼龙膜上,成像后即可得到所测多个CpG 位点的平均甲基化程度。Ms-SNuPE 可快速定量多个CpG 位点的甲基化程度,但它不能对较长的序列进行全面的考察,且检测多个CpG 位点时,需设计较多的引物，操作步骤较多，需要电泳等步骤；同时存在放射性污染的问题。8．甲基化敏感性单链构象分析（methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）甲基化敏感性单链构象分析（ MS-SSCA ） 又称重亚硫酸盐甲基化-PCR-SSCP（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）（BiPS）。方法是：先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG 二核苷酸区设计引物进行PCR扩增，扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳，由于DNA 电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA 的空间构象，而后者又由DNA 碱基的序列决定。因此，经处理后变性的单链DNA 将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，这样甲基化与非甲基化的就被分离开，随后行单链构象多态性分析加以明确。这种方法的优点是：1.能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析；2.能够对甲基化的等位基因进行半定量；3.可以提示甲基化状态分布的不均匀性；缺点是：1.只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开，而较低水平的则不易分开，有时会因甲基化的CpG 位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象，故敏感性及准确性略低；2.检测片段不宜过长。9．甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳（methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis，MS-DGGE）变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种能够将具有单碱基差别的DNA 分离的方法。其原理是：当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA 变性温度对应一致的位置时，DNA部分解链（解链区域的长度大小不等）。因此，很小的变化（如单碱基变化）也会引起DNA 片段Tm值的改变。DGGE系统中，DNA 片段在变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳时，由于凝胶中变性剂浓度自上而下呈梯度递增，因此，当DNA 片段到达与该区域的Tm值相当的某一浓度位置时，DNA 解链变为分枝状，其移动减慢，停留在凝胶的的某一位置，这样不同的DNA 片段就被分离。这种方法的优点是：DGGE 可以用来检测出除最高温度解链区域以外的所有发生甲基化的DNA 片段，需样品量少，能较直观的显示出甲基化情况。缺点是：解链温度和DGGE的变性浓度梯度需要摸索；同时该方法无法对样品中甲基化的程度作出定量判断。10．甲基化敏感性解链曲线分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA）MS-MCA 是将DNA 经重亚硫酸盐处理与Lightcycle 联用检测DNA 序列甲基化的方法。荧光素标记双链DNA。这种方法根据检测到的荧光度对应的解链温度，判断分析研究序列中甲基化的情况。在Lightcycle 过程中，随着温度升高，逐渐达到DNA 双链各解链区域的解链温度Tm，DNA 呈区域性逐渐解链，一般说来，序列中CG 含量越高，对应的解链温度越高。由于非甲基化的胞嘧啶经重亚硫酸盐处理后变为尿嘧啶、PCR 后变为胸腺嘧啶，故其所在序列中的CG 含量降低，热稳定性降低，解链温度降低。而甲基化的由于其CG 含量高，故其解链温度高。所作结果与标准曲线对照，根据这种特性就可以明确研究序列中CpG 的分布区及甲基化程度。这是一种能对甲基化分布不均匀的DNA 样本进行半定量分析的方法。缺点是：1. 它不能够精确检测甲基化的具体位点；2.研究序列的长度不宜过长；3. 该法对低水平的DNA 甲基化敏感性低。11．甲基化敏感性斑点分析（methylation-sensitive dot blot assay，MS-DBA）这个方法的过程是：先用重亚硫酸盐处理待测DNA 片段，随后以非CG 区的引物行PCR扩增，将扩增产物变性后转移到尼龙膜上，用3'端DIG 标记的含有2 个CG（或TG）的双核苷酸探针与DNA 杂交，随后用带有荧光标记的抗DIG 抗体与之反应。与双CG 的探针获得杂交的标本含有甲基化，而与TG 探针杂交的标本未被甲基化。通过比较斑点上荧光的强度测定甲基化水平。这种方法的优点是快速、简便、易于掌握，可一次检测多种样本，包括石蜡包埋样本。缺点是：1. 检测序列不能过长；2. 若探针错误杂交或重亚硫酸盐处理不完全，则可能出现假阳性或假阴性结果；同时该方法无法对样品中甲基化的程度作出定量判断。12．甲基化CpG 岛扩增子代表性差异分析（MCA-RDA）MCA 通过扩增2 个相邻Sma I 位点(CCCGGG) 间的DNA 来富集甲基化的CpG 岛。约70 %～80 %的CpG 岛至少含有2 个相邻的( &1 kb) SmaI 位点,且只有短片段的DNA 才能为MCA 扩增,从而保证MCA 扩增子高度代表CpG 岛。首先甲基化敏感的SmaI, 切割非甲基化的SmaI 位点,产生平端;继以甲基化不敏感的SmaI 同裂酶XmaⅠ消化,切割SmaI-SmaI片段中甲基化的SmaI 位点,产生CCGG 黏端,再连上接头,PCR 扩增,得到甲基化的MCA 扩增子。对照组和样本组MCA 扩增子进一步做斑点杂交和代表性差异分析(RDA)。斑点杂交可同时检测多个已知CpG 岛甲基化;RDA 则可发现新的CpG 岛甲基化基因。MCA 可快速检测多样本、多基因的CpG 岛甲基化,且联合RDA 可发现新的甲基化基因。但不能检测石蜡包埋组织;且对于不含相邻SmaI 位点的CpG 岛无法检测；同时该方法无法对样品中甲基化的程度作出定量判断。3．3 基因组范围的DNA甲基化模式(Methylation　pattern)与甲基化谱(Methylation Profiling)分析: 1. 限制性标记基因组扫描(Restriction Landmark Genomic Scanning, RLGS)RLGS是最早适用于基因组范围DNA甲基化分析的方法之一。该方法先用甲基化敏感的稀频限制性内切酶NotⅠ消化基因组DNA，甲基化位点保留，标记末端、切割、行一维电泳，随后再用更高频的甲基化不敏感的内切酶切割，行二维电泳，这样甲基化的部分被切割开并在电泳时显带，得到RLGS图谱与正常对照得出缺失条带即为甲基化的可能部位。RLGS 可一次得到数以千计的CpG 岛的甲基化定量信息。但RLGS 对DNA 质量要求较高，只能利用新鲜组织，且RLGS 不能快速的分析多个样本；同时该方法无法对样品中甲基化的程度作出定量判断。2. 甲基化间区位点扩增(amplification of inter-methylated sites, AIMS)&AIMS是基于任意引物PCR(Arbitrary Primed PCR)的一种方法，由于任意引物PCR使用寡核苷酸连接子(linker) 进行连接，不需要依赖任何序列的先验信息。在该方法中，用来进行扩增的模板序列首先通过甲基化敏感的限制性内切酶进行消化而富集，其特异性由该酶酶切片断一端的特定序列结合连接子来保证。随后，由内切酶进行第二次消化，再次连接，提纯进行PCR扩增，最后电泳，提取目的序列进行测序。AIMS法简单方便，可以作为全基因组差异印记基因筛选的有效工具。该方法的缺点是受到限制性内切酶的限制，操作步骤复杂，需要反复进行消化连接，同时需要电泳等步骤，最终仍需要测序确定甲基化结果。3. 甲基化CpG岛扩增(Methylated& CpG-island amplification, MCA)MCA也是基于任意引物PCR的方法，该方法使用两种对甲基化具有不同敏感度的限制性内切酶(如SmaI和XmaI)先后进行消化，然后对甲基化敏感的限制性酶切片断进行接头(Adaptor)连接，行PCR，那些富含CpG的序列就会被选择性的扩增。MCA 可快速检测多样本、多基因的CpG 岛甲基化,且联合RDA 可发现新的甲基化基因。但不能检测石蜡包埋组织;且对于不含相邻SmaI 位点的CpG 岛无法检测；同时该方法无法对样品中甲基化的程度作出定量判断。4. 差异甲基化杂交(Differential Methylation Hybridization,DMH)DMH属于一种芯片技术，在该技术中，包括扩增子(Amplicon)生成和CGI文库筛选两个重要组成部分。在扩增子生成中，首先用MseI来酶切DNA样本，然后接上连接子，并去除重复序列，这时的样本一分为二，其一直接进行PCR扩增，生成仅由MseI处理过的扩增子，而另一半则用甲基化敏感的酶BstUI进行消化,然后进行PCR扩增，生成由MseI/BstUI共同处理过的扩增子。CGI文库通过筛查出重复序列，然后进行PCR，选出含有BstUI位点的克隆，最后这些克隆一式两份点到芯片上，制备成CGI芯片。然后把两种不同的扩增子分别杂交到相应的CGI克隆点上，最后通过差异性对比检测出那些未甲基化位点。DMH应用高密度DNA 阵列杂交,大通量,易于自动化。但对于不含BstU I 酶切位点的序列将给出正常与样本中均甲基化的假阳性结果,需进一步证实；同时该方法无法对样品中甲基化的程度作出定量判断。5. 由连接子介导PCR出的HpaII小片断富集分析(HpaII tiny fragement Enrichment by Ligation-mediated PCR, HELP)该方法用HpaII与其对甲基化敏感同裂酶MspI对同一基因组序列进行消化，产生不同的代表性序列，然后对此序列进行连接子介导的PCR，瑞和进行电泳等比较分析或将此DNA样本共杂交到基因组芯片上进行分析。这种方法已经揭示了大量的组织特异性，差异甲基化区域，并用于正常细胞和癌症细胞的基因组比较分析。6. 甲基化DNA免疫沉淀法(Methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP)这是一种高效富集甲基化DNA的方法。在该方法中，可与5mC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA片段中，从而使甲基化的基因组片断免疫沉淀，形成富集。通过与已有DNA微芯片技术相结合，从而进行大规模DNA甲基化分析。该方法简便，特异性高，适合DNA甲基化组学(DNA Methylome)的分析。不过这种方法需要精密的仪器。 7．甲基化特异性微阵列（MSO）该方法利用亚硫酸氢盐处理的方法，结合PCR技术将基因组DNA中的未甲基化的C全部转变为T，而甲基化的C保持不变。根据这种变化，设计甲基化与非甲基化探针来检测CpG位点的甲基化状态。然后，将经SssⅠ甲基化酶处理的阳性样本与未处理的阴性样本按不同比例混合后与MSO微阵列杂交，以此作为DNA甲基化定量分析的标准曲线。根据标准曲线来确定多个CpG岛的甲基化改变，以此实现初步定量。该方法为DNA甲基化的快速，低成本，高通量的检测奠定了基础。但该方法无法确定所研究的CpG岛的甲基化模式，存在假阳性问题；同时该方法无法对序列的甲基化程度作出准确定量。以上方法中，对于甲基化位置未知的序列或需要扫描甲基化位置的序列，一般常用重亚硫酸盐测序法(Bisulphite& Sequencing)&和甲基化特异性微阵列（MSO），其中重亚硫酸盐测序法需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵；甲基化特异性微阵通量较高，但是存在假阳性问题。对于已知甲基化位置的序列，目前较为常用的是甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)&和焦磷酸测序(Pyrosequencing)，其中MSP法引物必须与甲基化位置互补，设计难度加大，同时无法对序列的甲基化程度作出准确定量；焦磷酸测序操作简单，结果准确可靠，可以对样品中甲基化的程度作出定量判断。& & & & 四、PyroMark Q24 Advancecd实时定量焦磷酸序列分析仪在DNA 甲基化检测的优势：通常一段序列中DNA甲基化位点不止一个，当存在多个甲基化位点时，PyroMark可以同时对多个位点甲基化进行检测的优势就体现出来了，而且PyroMark不仅可以分析是否有甲基化位点地存在，同时可以定量检测甲基化的比例。
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