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大肠杆菌生长曲线的制作
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大肠杆菌生长曲线的制作
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3秒自动关闭窗口大肠杆菌中特异β-葡萄糖醛酸酶提取纯化的研究
&&&&天津科技大学 硕士学位论文 大肠杆菌中特异β-葡萄糖醛酸酶提取纯化的研究 姓名：白晓丽 申请学位级别：硕士 专业：食品科学 指导教师：曹小红
摘要本论文以对硝基酚．ｂ一葡萄糖醛酸苷为底物测定了大肠杆菌在不同培养 条件下的ｂ。葡萄糖醛酸酶（ｂ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ，简称ｂ—ｇ）活性，确定&&&&了ｂ．ｇ的最优培养条件，并对ｂ－ｇ进行了提取纯化和检测。 通过ｄ．ｇ活性的测定，发现对于提高０．ｇ活性而言，不冻融优于冻融，液体培养优于斜面培养，培养基配方２优于配方１优于配方３，６小时振荡培养优于８天振荡培养。０一ｇ的最优培养条件为：在配方２中振荡培养６小时。配方２的组成为：蛋白胨３％，甘油磷酸钠５％，ｐｈ６．８。通过硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析和磷酸钙吸附层析相结合的方法对 ０一ｇ进行纯化。ｂ—ｇ最终提纯倍数１５．３，回收率５．１％。 采用ｓｄｓ一聚丙烯酰胺凝胶电泳测定０一ｇ纯度及分子量，分离胶浓度 １２％。粗提ｂ—ｇ电泳凝胶经考马斯亮蓝染色后在７２ｋｄ和１９ｋｄ出现两条蛋 白带，碱性品红染色表明分子量为７２ｋｄ的亚基带具有糖链结构。纯化ｂ．ｇ在７２ｋｄ出现单一条带，为ｂ—ｇ经变性电泳裂解的亚基。关键词：大肠杆菌；ｂ一葡萄糖醛酸酶； 纯化 对硝基酚一ｂ一葡萄糖醛酸苷；提取ａｂｓｔｒａｃｔｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｂ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ｂ—ｇ１ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－ｂ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（ｐｎｐｇ）ｗａｓ ｕｓｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅ．ｃｏｌｉ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ．ｉｔａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ．ｂｅｓｔｂ—ｇ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｂ—ｇ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｎｄｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔ ｂ—ｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｏｔ—ｆｒｅｅｚｅ—ｔｈａｗｉｎｇｗａｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎ ｉｎｆｒｅｅｚｅ—ｔｈａｗｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ，ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎｓｌａｎｔ ｍｅｔｈｏｄ，ｓｈａｋｉｎｇｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ６ ｈｏｕｒｓ ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ８ ｄａｙｓ，ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｗｏ ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｈｒｅｅ．ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｃｏｔｉ ｔｗｏ ａｆｔｅｒｔｏｏｎｅｐｒｏｄｕｃｅ８一ｇ ｗａｓ：８－ｇ ｉｎ ｃｕｌｔｍ＇ｅｓｈａｋｉｎｇ ｆｏｒ６ ｈｏｕｒｓ．ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｗｏ ｗａｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｂｙ ｐｅｐｔｏｎｅ ３％．ｓｏｄｉｕｍｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５％，ｐｈ ６．８．ｂｙａｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｐｈａｔｅｆｒａｃｔｉｏｎ，ｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ１ａｎｄ ｃａ３（ｐ０４）２ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，８－ｇ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｂｏｕｔｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ５．３ｔｉｍｅｓａｎｄ ａｃｈｉｅｖｅｄｗｉｔｈａｎｏｆ５．１％．ｔｈｅｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆｂ—ｇ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｄｓ—ｐａｇｅｂａｓｉｃ ｓｔａｉｎｉｎｇ．ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｗａｓ １２％．ｓｄｓ－ｐａｇｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．ｇａｎｄ ｆｕｃｈｓｉｎａｎａｌｙｓｉｓ ｙｉｅｌｄｔｗｏ ｂａｎｄｓ ｏｆ ７２ｋｄａｎｄ１ ９ｋｄａｎｄｏｎｅｂａｎｄ ｏｆ７２ｋｄ ｉｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｂａｎｄ ｏｆ７２ｋｄｗａｓ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆｌ３ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅ．ｃｏｈ；ｂ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ；ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ—ｂ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ天津科投人学坝｝ｊ学位论文１前言食品安全一直是世界各国倍感困惑和棘手的重要问题。安会本意为没有 危险，不受威胁，不出事故。我们所巍的食品安全的概念为：食品应当无毒 无害，不能对人体造成任何危害。也就是说食品必须保证不致人患急慢性疾病或者具有潜在危害…。早在１９８３年，联合国粮食和农业组织（ｆａｏ）及世界ｐ生组织（ｗｈｏ）的食 品安全专家委员会在它的报告“食品安全对健康和发展的作用”中指出：污 染食物引起的疾病是对人类的健康最常见的威胁之～，也是经济生产力削弱的一个重要原因。防止食品污染、保证食品安全、维护消费者的健康和权益已成为各国的一件重要国策１２】。 尽管现代科技已发展到了相当水平，但食源性疾病不论在发达国家还是 发展中国家，都没有得到有效的控制，仍然严重地危害着人民的健康，成为 当今世界各国最关注的卫生问题之一［３ｊ。 造成食品安全的隐患极为广泛和复杂，主要有生物性污染和化学性污染， 其中生物性污染包括细菌性污染、真菌毒素污染、病毒性污染和寄生虫，化学性污染包括重金属污染、农药污染及其他化学污染［４】。 １．１国内外食品安全现状１．１．１国外食品安全现状 近年来不断发生与食品安全有关的食品污染事件，造成了人们对食品污 染的恐惧和对食品安全的担心。以下是近年来国外发生的影响较大的食品安 全恶性事件ｊ“。 （１）美国食品的李斯特菌污染问题１６ｊ 美国是世界上食品安全管理最严格的国家，有着各种法律法规控制着食 品的安全与卫生，且国民素质高，各种加工消毒技术完善，但食物中毒事件仍呈上升趋势。 １９９９年年底，美国发生了历史上因食用带有李斯特菌的食品而引发的最 严重的食物中毒事件。掘美国疾病控制中心的资料，在美凰密歇根州，有１４人因食用被该菌污染了的“热狗”和熟肉而死亡，在另外２２个州也有９７人因 此患病，６名妇女因此流产。 ｆ２）英国的“疯牛病”事件１９９６年发生的英国“疯牛病”事件是人类史上首次危及全球人类健康的 重大食品安全事件。一场英国“疯牛病”风波震撼全球，引起了全世界的恐慌，使许多消费者谈“牛”色变。 “疯牛病”属人畜共患传染病。该病是由一种尚不清楚的病毒引起的， 目前尚无有效的防治办法。１９８５年，英国阿什福德的一个农场首次发现“疯前高牛病”，１１年来英国已有１５万头牛患此病死亡。１９８９年，英国开始有人忠了与“疯午病”症状类似的克一雅氏病。这种病的潜伏期长达ｌｏ一１５年，发病前无法诊断，发病后又无法救治，死亡率几乎为１００％。由于此病潜伏期氏， 据估计本世纪将进入发病高峰期，死亡人数每年将至少有５０００人１７ｊ。 （３）比利时的“二一恶英污染食品”事件 １９９９年５月在比利时发生的“二恶英污染食品”事件是继英国“疯牛病”之后，发生在欧洲的又一起对人类健康造成威胁的恶性事件。１９９８年３月，比利时一些养鸡场出现鸡不生蛋、肉鸡生长异常等现象， 遂怀疑饲料有问题。经调查发现．这是由于比利时９家饲料公司生产的饲料中含有致癌物质二恶英所致。其中一家饲料厂的饲料用脂肪的二恶英含量超过允许限量２００倍以上。买走这批饲料的养殖场超过１５００家，包括比利时的 ４００多家养鸡厂、７０家养牛场和５００余家养猪场，这批饲料也已售往德国、 法国、荷兰等固蝉ｊ。 （４）日本的“０１５７”事件 １９９７年５月下旬以来，日本冈山、厂＋岛、爱知、福冈等县的几十所中学 和幼儿院相继发生６起集体食物中毒事件，中毒人数多达１６００人，导致３名 儿毒死亡，８０多人入院治疗。到７月底。累计中毒人数超过万人，死亡１１ 人，波及４４个都府县的暴发性食物中毒事件，引起全世界的极大关注归１。 据有关部门检测，引起食物中毒的是一种名为０１５７：ｈ７的病原性大肠 杆菌。０１５７：ｈ７是引起食物中毒的病原性大肠杆菌中最危险的一种，这种病 菌一般寄生在牛羊等动物的肠道内以及土壤和污水中，通过食物进入人体后 在肠壁上繁殖，并产生一种毒素。现在医学上通常使用的抗菌药物只能杀死０１５７：ｈ７病菌本身，但对它所产生的毒素无能为力。因此目前对其尚没有有效的治疗方法。食入带有这种病原性大肠杆菌的食物后，通常在５—７闩后发病，患者的主要特征是伴有出血性痢疾和剧烈腹病，并危及肝、ｌ婷。在小儿 中常导致溶血性尿毒综合症，血小板减少性紫癜等，严重者有生命危险【１０１。 事实上，０１５７：ｈ７引起的食物中毒在美国、英国、德国、加拿大、澳大 利亚等国家曾相继频繁发生…ｊ。 （５）全球范围的口蹄疫流行 口蹄疫是一种通过病毒传染的疾病，可通过空气和饲料等途径传播。口 蹄疫也是一种严重的人畜共患病，是目前全世界各个国家重点检疫的恶性传染病１１２】。１９９２年台湾发生猪口蹄疫事件，对台湾的养猪业造成沉重的打击。１９９９年２月口蹄疫分别在马来西亚、吉尔吉斯坦、以色列和阿尔及利亚被检出。整个亚洲地区的动物养殖业无不受到拖累。整个亚洲地区被宣布为口蹄疫区， 对这一地区的肉品及相关食品产业造成严重冲击。２０００年，家畜口蹄疫在韩无津科技人学倾卜学位论文国义呈爆发性流行。２０００年３月，韩国兽医捡疫人员已宰杀了数百头忠有ｒｊ 蹄疫的牛和猪［”１。１．１．２国内食品安全现状尽管我国的总体食品安全状况与过去相比有～定的提高，特别是１９９５年 食品卫生法实施以来，总的食品合格率不断上升，然而，随着市场经济的发 展和食物链中新的危害不断出现，存在着不少亟待解决的不安全因素以及潜在的食源性危害㈣。近年来，每年卫生部接到食物中毒报告１００．２００起，涉及数千人发病， 百余人死亡，见表ｌ－１。表ｉ—１分析了我国食物中毒的类别。由表１－１可见， 除意外事故外，大部分均是致病微生物引起的。如，２００１年在江苏、安徽等 地暴发的肠出血性５ｋｎ４ｔｎ ０１５７：ｈ７食物中毒，造成１７７人死亡，中毒人数超过２万人。表１—２总结了我国微生物性食物中毒的病因学。应该指出的 是，我国目前食物中毒的漏报率比较高，所掌握的数据仅为我国实际发生的 食源性疾病的“冰山一角”嗍。表ｌ一１我国食物中毒的病因学分析［ｔ６ｌ｛譬兽一：；——史重型坠一一生妻△垫！…互至夏要霾歪！二２３２１（０．８１、 ————————————————————————————————————————————————————————————————二——————～微生物性食物中毒４１７５ ２５６３ 化学性食物中毒 １７５３ 有毒动植物中毒 ６９６ 其他 １ １４３ 原因不明 ９７ １９９９年合计 １０４２７ 总计１６０５９９一一——面丽豆ｉ广一～—～５３７（１．１４、 ９０７（４．２９、 ２２２（１．１２、 １５８（ｏ．５８１ｌ４７０３３２１ １２４ １９７５１２７２４４４９９９ ２８５２５００３（２．０６１表ｌ一２我国微生物性食物中毒的病因学分析１万而未宴婴磊＝一生查垫微生物性食物中毒 沙门氏菌 副溶血性弧菌 葡萄球菌 肉毒梭菌 变形杆菌 大肠杆菌 腊样芽孢杆菌 真菌毒素３７４６９７０～生查△塑～一垄至丕墅二！ｉ∑二 １５０６８７４耳西石一～—万矿而ｌｉ石丁——５３（０．１０） ２（０．０１） ５（０．０５） ８３（７．３０） ６（０．０３） ８（０．１０） ４（０．０４） ５７（２．５５）】１３０４７０ ４１５７３ ５６３１６７２０１１０８２１９７５２ ７９６３ １０８０９２２３７１６０２５４８６苎婪＝＿＿＿－：＝—翌—一兰！！１．２食品安全引发的问题１．２．１经济损失！！！业！１。美国每年有７６００万人（次）患食源性（感染或中毒）疾病，其中３２．５ 万人因此而住院，且每年有５０００ ｘｎｒｎ性感染病死亡。美国在１９９７年，前ｌ－仅由病原体引起的感染性食源病一项，所用的医药开支和造成劳动力丧失的 耗资为３５０亿美元…“。 英国自１９８６年公向发生疯牛病以后，１９８７年至１９９９年期间证实的疯牛 病病牛达１７万头之多，英国的养牛业、饲料业、屠宰业、牛肉加工业、奶制 品工业、肉类零售业无不受到严重打击。仅禁止进出口一项，英国每年就损失５２亿美元。比利时发生的二恶英污染事件不仅造成了比利时的动物性食品被禁ｊ｝上 市并被大量销毁，而目．导致世界各国禁止其动物性产品的进ｒ丁，据估计其经济损失达１３亿欧元【｜８１。１．２．２政治后果和贸易纠纷 食品安全问题的发生不仅使所在国在经济上受到严重损害，还可以影响 到消费者对政府的信任，乃至威胁社会稳定和国家安全。１９９９年二恶英风波 中比利时内阁全体倒台以及２００２年德国由于发生疯牛病而卫生、农、皿部长引咎辞职，是食品安全涉及政治领域的典型例子㈣。食品安全问题还会引起外贸交易的损失。据美国ｆｄａ食品、药品监督管 理局透露，２０００年８月至今年１月，美国ｆｄａ共扣留了６３４批中国进口食品。 其原因是：杂质、食品卫生差、农药残留、食品添加剂、色素问题、标签不 清、沙门氏菌、李斯特菌、黄曲霉毒素污染等。又如，２００２年初，ｆ＝ｉ本认定 我国的出口蔬菜农药残留超标并大大提高进口蔬菜的技术标准。仅此一项就 使山东数万农户大幅减收。日本甚至有媒体报道称中国的蔬菜近一半“有毒”［２０ｌ。总体上，出口食品被扣留或退货不仅使出口国蒙受巨大的经济损失，更 为重要的是使出口国食品在国际上丧失了良好的信誉。这就会使进口国对出 口国食品产生不信任，从而影响以后的贸易往来：或者会使这些国家转而向 其他国家寻求新的进口源；或者对出口国产品提出更为严格的要求；或者在 进口产品时加强各方面的检验（这会增加进口国的进口成本），使出口国在价格协定上更为不利。由于输入国家拒绝进口含无法接受的污染物的食品而引起的外贸交易的损失是许多国家面临的一个问题，特别是以农业为经济基础的发展中国家¨“。１．３食品安全问题解决措旖 １．３．１国外食品安全问题解决措旌 食品污染事件的频繁发生，已经引起有关国际组织机构以及各国政府的 高度重视，世界各国对食品安全的重视程度和管理普遍加强。２０００年，日内瓦召开的第５３届世界卫生大会首次通过了有关加强食品安全的决议，将食品安全列为世界卫生组织的工作重点和最优先解决的领域。欧盟委员也于２０００ 年发表了长达６０页的《食品安全白皮书》，推出了一个庞大的食品安全计划，４灭津科技犬学坝｝。学位论文特别强调加强国际联系与合作。同时国际粮农组织（ｆａｏ）和世界ｍ生组织 ｆｗｈｏ）ｎ在起草标准，由１６０多个成员国的政府官员、科学家、技术工作者和食品企业、消费者共同参与制订【２ｚｊ。以下为ｗｔｏ对食品安全的建议及策略吲：（１）把食品安全作为公共卫生的基本职能之一，并提供足够的资源以建立和加强其食品安全规划； （２）制定和实施系统的和持久的预防措施，以显著减少食源性疾病的发生； （３）建立和维护国家或区域水平的食源性疾病调查以及食品中有关微生物和化 学物的监测和控制手段，强化食品加工者、生产者和销售者在食品安全方面应负的关键责任，提高实验室能力，尤其是在发展中国家；（４）为防止微生物抗药性的发展，应将综合措旖纳入到食品安全策略中； （５）支持与食品危险因素评估科学的发展，其中包括与食源性疾病相关危险因素的分析：（６）把食品安全问题纳入消费者卫生和营养教育与资讯网络，尤其是在小学和 中学的课程中，并开展针对食品操作人员、消费者、农场主、加工人员及农 产品加工人员进行的符合文化特点的卫生和营养教育规划； （７）从消费者角度建立包括个体从业人员（尤其是在城市食品市场）在内的食品 安全改善规划，并通过与食品企业合作，以探索提高他们对良好的农业少产、 卫生和生产规范的认识方法； （８）协调国家级食品安全相关部门的食品安全活动，尤其是与食源性疾病危险性评估相关的活动：（９）积极参与食品法典委员会及其工作委员会的工作，包括对新出现的食品安 全风险的分析活动。１．３．２国内食品安全问题解决措施 我国的食品安全标准研究和制定工作起步较晚，２０世纪７０年代，卫生部组织各有关单位，通过调查和研究，先后制定出粮、油、肉、蛋、水产、乳 等８６种食品卫生标准和２２项卫生管理办法，同时制定了统一的食品卫生检验方法。２０世纪８０一９０年代，在进一步调查研究的基础上，对上述食品卫生 标准进行了修订，并增加了数十种新的食品卫生国家标准，同时补充了食品 卫生检验方法和卫生管理办法，现有食品卫生国家标准和多种食品卫生行业 标准各１００多种，并且有１００多种食品卫生标准检验方法，为我国食品安全 体系的建立和管理工作走上法制化轨道起到了重要作用。但是，我国国家标准只有４０％左右等同采用或等效采用了国标标准，覆盖面远远不够，标准化 工作差距很大。随着我国加入ｗｔｏ，需要尽快与国际市场接轨，为此，尽快 地建立起我国食品安全评价与检测体系，建立国际共同关注的食品污染物贱留快速检测方法和监控体系以及食品安全工作网络，制订与国际接轨的各项前者标准，是目前我国食品安全工作的当务之急【２…。 为了提高我国食品安全水平，需加强以下关键措施［２５１： （１）加强政府对食品安全监管力度 国家应成立诸如美国ｆｄａ的“国家食品安全管理局”，各省应有相应的 食品安全工作委员会，组织有关高等院校、科研院所、技术监督、检验检疫、 农业、果ｑｋ、环保等单位相关研究人员，加强与国际组织合作，必要时可聘 请外籍专家，研究解决农业生产及食品安全生产中的重大、急需、疑难技术问题，对基层进行教育培训及技术指导，为政府决策提供咨询服务。（２）化学危害因子安全检测方法的建立和规范化 根据安全因素分析和ｈａｃｃｐ中的危害分析和关键控制点，建立各主要 危害因素，如农药残留、兽药残留、环境污染物、重金属，食品添加剂（包括 防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、色素、发色剂、甜味剂等），动植物生产调节剂 等检测方法，并达到灵敏快速、经济、实用和规范化。 （３）生物危害因子安全检测方法的建立和规范化 在生物安全因素调研分析的基础上，建立各主要和常见病原微生物及寄 生虫的灵敏、快速的检验方法，并使之规范化。建立主要病原微生物的先进 检测技术，达到先进、灵敏、特异、快速，并使之规范化。 （４）安全监控体系的建立和制度化 为保障从土地到餐桌的全程安全监控，要建立起省、地、县三级监控体 系，配置设备，培养人才，形成检测网络，实现全方位检测信息的及时传递 和互通，及时指导生产环节，并使之制度化。 在大型重点食品企业推行ｉｓ０９０００认证，ｇｍｐ生产和ｈａｃｃｐ监管和质 量保证体系。 （５）安全评价方法的建立和标准化 对于一些安全性不确定因素，一些新的危害因素，新的污染物（包括新的农药化肥、促生长调节剂、新的工艺污染源等），应进行严格的毒理学安全性评价，即进行急性毒性、亚慢性毒性、慢性毒性、致癌、致畸、致突变以及 一些特殊毒性，如生殖毒性、免疫抑制作用，迟发神经毒作用等全面评价， 建立良好的实验室条件（ｇｌｐ）和严格规范实验动物及实验方法，使各项评价环 节标准化。 ｆ６１安全限量的制订和标准化 安全限量的制订是一项深入、细致、复杂的工作，以安全评价为基础， 结合社会发展程度，人民生活水平和被评价物在食物中的分布特点、人体吸 收和人群摄人情７ｅ（食物结构）综合考虑，标准的制订既要参照ｆａｏ、ｗｈｏ、 ｃｏｅ、ｆｄａ标准，又要结合中国国情，既要考虑出口贸易需要，又要考虑国 内消费，制订安全、合理的限量标准，并随着社会发展和科技水平的提高不天津科拙人学砸１．学位论文澎ｆ修订。（７）食品安全法规制定和保障体系的建立食品安全标准制订后，为保证安全标准的执行与实施，一要制定明确的相 应法规，二要有相关的执法保障体系。１．４常见致病微生物检测技术的发展食物的综合性评价总结出微生物是人类疾病的首要重点。微生物广泛分 知于地球的生物圈内，可以说它无处不在，其代谢又十分旺盛，生命力极强， 生长繁殖速度极快，因此微生物对食品的污染极为普遍１２…。１．４．１常见致病微生物（１）大肠杆菌（ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）大肠杆菌的检测是食品是否符合卫生质量要求的重要衡量指标之一。正常情况下，少量污染大肠杆菌不致病，但当机体抵抗力下降或一定量的大肠 杆菌侵入肠外组织或器官时，可为条件致病菌而引起多种类型感染性疾病。 临床上常见的感染类型包括胃肠道感染、尿道感染、脑膜炎、伤口感染、溶 血尿毒综合症等。食品中大肠杆菌的检出率越高，传播肠道传染病的危险性也 越大，严重地影响着产品的质量与消费者的身体健康【２”。 （２）沙门氏菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．ｓｐｐ） 沙门氏菌在人和动物中有广泛的宿主，所以在家畜屠宰前后都很容易受沙门氏菌的污染，所以它是人畜共患肠道病原菌和细菌性食物中毒的重要病原菌。经测定，猪携带沙门氏菌高达７０％一８０％左右，它的污染程度直接影响 着人们的身体健康。所以在禽畜生肉的检测中，必须予以足够的熏视ｆ２８１。 （３）空肠弯曲菌（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ） 空肠弯曲菌是１９３１年酋次被发现，但直到１９７７年以后，世界各地关于空肠弯曲菌的报道才日益增多。由国内外大量流行病学调查资剩证实，空肠弯曲菌广泛存在于自然界及家禽、家畜的肠道内。据有关实验表明，家禽、 家畜空肠弯曲菌带菌率高，且与人类关系密切，是该菌贮存宿主和人类弯曲菌肠炎的主要传染源。弯曲菌是经口传播的，主要是通过污染的食物传染给消费者，尤其生肉是最主要的传染源。它不仅是重要的人畜共患病原菌，而 且也是引起食源性肠炎爆发的病原菌。我国于１９７８．１９８０年首次从腹泻患者 的粪便中分离出了弯曲菌。自１９８０年起，世界卫生组织（ｗｈｏ）已将该菌 列为最常见的传染病菌之一［２９１。（４）产气荚膜梭菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ） 产气荚膜梭菌是人类和家畜重要的厌氧性病原菌，产生肠毒素的ｃｐ是人类食物中毒病原菌。据报道，ｆ｜本动物性食品中该菌的污染率为４０％，该菌 所引起的食物中毒占细菌性食物中毒的第四位，美国占第二位，英国近两年 也上升为第二位。我国动物性食品ｃｐ污染的情况相当严重，有的食品污染率删ｉ达到４０％以上…。ｆ５）李斯特菌（ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｌｉｓｔｅｒｉａ）李斯特菌是通过生肉及乳品等食品污染人类的病原菌。据ｒ本一卫生研 究所曾做过分析，有１０％．３０％的生肉被李斯特菌污染后，可引起脊髓炎、败血症等，甚至死亡，其中尤以单核细胞增生性李斯特菌病原性最强。该菌的对食品的污染已引起世界各国食品卫生界的高度重视川。１．４．２致病微生物检测技术的发展传统的微生物分离、培养与鉴定需时较长，难以适应快速检测的需要。 计算机和新仪器设备的应用，食品微生物在采用新的快速检测方法方面目前已取得长足的发展。９０年代开始陆续出现了商业化快速检测产品，特别是近 几年来美国发展迅速【３２】。我国在微生物快速检测方面几乎为空白，国内很多企业迫切需求微生物 快速检测技术，而目前只有几种国外产品，产品品种有限且价格高，由于是一次性使用，国内很多大型企业也难以接受。面对巨大的市场需求，食品ｆ＿＝ 作者抓紧机遇，迅速适应发展，研究建立先进快速的检测方法、设备，以保证食品安全并促进我国食品工业的健康发展。 以下是近年来较为先进的致病菌检测方法； （１）免疫学方法ａ．检测原理ｉｊ‘”ｌ免疫学技术依赖于抗体的形成。单克隆抗体直接针对病原菌特异性抗原部分或它们的毒性部分。因而，其发展导致各种的免疫技术应用于食品微生物领域。其中，应用最广泛的是酶联免疫吸附法（ｅｎｚｙｍｅ．１ｉｎｋｅｄ 反应中颜色的变化进行检测。 ｂ．检测对象 利用这种方法可检测沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌０１５７等。ｌｅｅ等利ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ｅｌｉｓａ），其简单的机理是抗原被包被于两抗体之间，然后根据其显色用单克隆抗体检测伤寒沙门氏菌，结果准确可靠，最低检测量可达５×１０２个， 仅需２２ｈ，比常规方法缩短了３．４天，并且与葡萄球菌，大肠杆菌无交叉反应。ｔｏｒｅｍｓａ通过磁性免疫融合法将提取的单克隆抗体与磁性颗粒结合，应用 ｅｌｉｓａ检测李斯特菌的存在。ｂｅｍａｌ等用纤维素脂微孔滤膜浓缩大肠杆菌，然后进行了ｅｌｉｓａ检测。ｆ２）酶一底物法１３５］ａ．检测原理酶．底物法是一种快速检测的方法，它是根据微生物在其生长繁殖过程巾 可合成和释放某些特异性的酶，按照酶的特性，选用相应的底物和指示剂，根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测天津科投人学顺十学位论文定结果有助于微生物的快速检测。这种技术将传统的微生物分离与生化反应 有机的结合起来，并使检测结果直观，正成为今后微生物检测的一个主要发展方向。ｂ检测对象 表１—３致病菌快速检测用的特异性酶【３６ｊ致病菌沙门菌特异性酶辛酸酯酶 酚氧化酶 ｒ酸酯酶 降解辅酶ｉ新型隐球菌 卡他莫拉菌霍乱毒素 克柔念珠菌热带念珠菌 ａ族链球菌 斯氏葡萄球菌 白色念珠菌 加德纳菌 难辨梭菌 产单核李斯特菌 大肠杆菌 脑膜炎奈瑟菌 肠球菌 红斑丹毒丝菌 会黄色葡萄球菌 淋病奈瑟菌 （３）ｐｃｒ技术ａ．检测原理【３７】酸性磷酸酶 吡咯磷酸酶 吡咯芳胺酶 ０一半乳糖苷酶 脯氨酸氨肽酶 ａ葡萄糖苷酶 谷氨酸脱氢酶 丙氨酸氨肽酶 １３．葡萄糖醛酸酶 ｙ一谷氨酰转肽酶 ｐｙｒ、亮氨酸氨肽酶 ｎ一乙酰葡萄糖醛酸酶 ０．ｎ一乙酰葡萄糖胺酶 羟脯氨肽酶ｐｃｒ聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ｐｃｒ）也称无细胞分子克 隆体系，是１９８５年由美国的ｋａｒｙ ｍｕｌｌｉｓ等人提出并由美国ｇｅｙｕｓ公司丌发 的一项专利。其基本原理为根据已知的待扩增的ｄｎａ片段序列、人工合成与 该ｄｎａ序列两条链末段互补的两段寡核菅酸引物，在体外将待测ｄｎａ序列 （模板）在酶促作用下进行扩增，这种方法就是ｐｃｒ技术。此反应的全过程 可分为ｄｎａ模板变性、退火、延伸三个连续的步骤。首先高温作用使模板 ｄｎａ变性解链，然后降低温度使人工合成的两个寡核苷酸引物与模板ｄｎａ 链发生退火，再在特定聚合酶的作用下，当有一定的底物存在时，引物链将 沿着一定方向延伸与模板互补为新链，新链则可作为ｆ一次反应的模板，由 于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。 ｂ．检测对象［３８】ｐｃｒ法可检测大肠杆菌、李斯特菌、空肠弯曲菌、产气荚膜梭菌等。以日ｕ日李斯特菌为例，ｐｃｒ法检测单核细胞增生性李斯特菌不受污染杂菌的影响，而且生肉样品直接ｐｃｒ扩增法大大缩短了试验时间，只需９ｈ即可完成实验。 如果先将李斯特菌增殖，再进行ｐｃｒ法扩增，可在３天内出结果，这比常规 方法（需要７天以上）缩短了３－４天时间。因此，ｐｃｒ扩增技术为单增李斯 特菌引起的食物中毒和该致病菌的爆发流行提供了敏感、特异的快速诊断方 法。【４）ｄｎａ探针法 ａ．检测原理【３９，４０１ｄｎａ探针技术检测微生物的依据是核酸杂交。其原理是两条碱基互补的ｄｎａ链在适当的条件下可以按碱基配对原则，形成杂交的ｄｎａ分子。如果 将某一种微生物的特征基因ｄｎａ双链中的一条进行标记，由于ｄｎａ分子杂 交时严格遵守碱基配对原则，通过考查待测样品与标记性ｄｎａ探针能否形成 杂交分子，即可判断样品中是否含有此种微生物。ｂ．检测对象随着生物技术的发展，目前已可以应用ｄｎａ探针检测大肠杆菌、沙门氏 菌、志贺氏菌、耶希氏菌、李斯特菌等。ｃｌｅｕｚｉａｔ等用大肠杆菌中编码该酶的 基因序列作为目标ｄｎａ，并制成ｄｎａ探针，用来检测大肠杆菌。而且对不 同种类的大肠杆菌，包括大肠杆菌０１５７可使用其产肠毒素基因序列作为目标 ｄｎａ，构造出相应的ｄｎａ探针，用来检测大肠杆菌０１５７。用此方法检测 样品中的致病微生物，每毫升增菌生肉汤中其检测敏感性为１０６个微生物，从 分析开始后４６．５３ｈ便可以出结果。ｆ５１基因芯片技术ａ．检测原理ｍ４２】基因芯片是９０年代兴起的一项前沿生物技术，是在传统的ｄｎａ杂交、测序等技术上的重大创新和飞跃，是继单克隆抗体和ｐｃｒ技术之后生命科学 领域的又一次具有深远意义的技术革命。基因芯片是基于核酸分子杂交原理，利用光导原位化学合成或液相合成自动化点样技术，将大量的寡核菅酸探针 固定于玻片、硅片、尼龙膜等固相支持物上，与荧光或同位素标记的样品核酸杂交，通过计算机系统检测与分析，获得有关生物信息。基因芯片技术主要包括ｄｎａ微阵列的构建、样品的制备、靶分子和探针间的杂交、杂交信号 的检测与分析。目前，该技术广泛用于生物学遗传、医学、农业和环境检测等领域。 ｂ．检测对象一驯基因芯片技术作为一种新技术，具有快速、准确、灵敏等优点，在以后 的这些病原微生物的检测中将会得到广泛的应用。现在，国外已经开始研制 受细菌污染食品的芯片。而在国内，该领域还是一片空白。其主要的原因是，１０灭捋科技大学坝ｊ。学位论文制备芯片的成本高，芯片的使用率较低，浪费严重等缺点。但随着芯片技术 的发展和不断完善，该领域具有不可估量的应用前景。 ｆ６）自动分析系统 随着科技的不断发展，微量化、系列化、自动化的病原微生物鉴定技术逐渐被开发应用，开辟了微生物检测与鉴定的新领域【４…。ａ．全自动荧光免疫分析仪ｖｉｄａｓ是生物梅里埃公司应用酶联免疫技术制造的全自动免疫分析仪， 是用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以 带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高，速度快，可以在４８ｈ的时间内快速鉴定大肠杆菌０１５７。ｂ．ａｍｓａｍｓ为美国ｖｉｔｅｋ厂产品，应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质。将一定浓度的菌悬液接种到小卡 上，将其放入具有读数功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器自动检测培养基 的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的生物编码，最后由计算机判定，打印出鉴定结果，检测所需时间最长不超过２０ｈ。 ｃ．缩微芯片 生物芯片发展的目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统或称缩微芯片装置。１９９８年６月，ｎａｎｏｇｅｎ公司首次报道了用芯片装置所实现的从样品制备到反应结果显示的全部分析过 程。他们用这个装置从混有大肠杆菌的血液中成功地分离出了细菌，在高压 脉冲破胞之后用蛋白酶ｋ脱蛋白，制得纯化的ｄｎａ，最后用另一块电子增强的ｄｎａ杂交芯片分析证实提取物是大肠杆菌的ｄｎａ。这是向缩微装置迈进的一个成功的突破。ｌ。ｓ大肠杆菌与ｂ．葡萄糖醛酸酶１．５．１大肠杆菌简介 人们通常泛称的“大肠杆菌”，实际上就是埃希氏大肠杆菌（ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ ｃｏｌｉ，简称ｅ．ｃｏｌｉ），是肠杆菌科细菌的模式菌，为革兰氏染色阴性杆菌，是 原核生物界中的单细胞微生物，其主要结构包括细胞壁、胞浆膜、细胞浆、 核质及荚膜、鞭毛、菌毛等。以周生鞭毛运动或无动力，兼性厌氧。最适生 长温度为３７ ６ｃ，最适ｐｆｉ～殷为７．４。ｅ．ｃｏｔｉ在营养琼脂中生长较好，并能 在３７℃，１２—１６ｈ内形成光滑、低凸起、湿润、灰白色、表面有光泽、边缘整齐的菌落１４５】。早在１８８５年，ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ氏证实了ｅ．ｃｏｌｉ是入和动物肠道中的主要细菌， 这一论点为其后以ｅ．ｃｏｉｌ作为环境被粪便污染的指示菌奠定了基础。１８９２叫ｉ年，ｓｃｈａｒｇｉｎｇｅｒ首先指出以ｅ．ｃｏｌｉ作为水源中微生物指示菌的建议。１ ８９３年ｔｈｅｏｂａｌｄ ｓｍｉｔｈ指出，大肠菌群因普遍存在于人和动物的肠道内，所以若在肠道外的环境中发现，就可以认为是被人和动物的粪便所污染。从此便开始 应用ｅ．ｃｏｉｌ作为水源被粪便污染的指示菌。由此算来，ｅ．ｃｏｌｉ作为粪便污 染的指示菌已愈百年，因为它是温血动物肠道中特有的而且是其它大肠类细 菌中数量最多、检出率最高的菌种（每克粪便中约含有１０９个ｅ．ｃｏｌｉ），随粪 便排出后，广泛分布于自然界，一旦水、牛乳、食品及其它被检物检出ｅ．ｃｏｌｉ， 就意味着这些被检物直接或间接的被致病菌污染，故在卫生学上被作为卫生 监督的指示菌，在药品、食品、污水、饮水中常将ｅ．ｃｏｌｉ作为检测对象［４５】。 正常情况下，少量污染ｅ．ｃｏｌｉ不致病，但当机体抵抗力下降或一定量的ｅ．ｃｏｌｉ侵入肠外组织或器官时，可为条件致病菌而引起多种类型感染性疾病。食品中ｅ．ｃｏｌｉ的检出率越高，其卫生质量越差，传播肠道传染病的危险性也越大。 为保障人体健康，一些国家在药品、食品、饮水中都规定必须检查是否污染 ｅ．ｃｏｌｉ，我国及英、美药典都规定药品中不得检出ｅ．ｃｏｌｉ。但法定方法需从自然污染混合菌中分离，用生化实验鉴定ｅ．ｃｏｌｉ，一次实验需５天，方法繁 琐，不经济。快速鉴定ｅ．ｃｏｌｉ的方法虽有报道，由于方法的特异性不强或试剂靠进口，难以推广应用。１．５．２ｅ．ｃｏｌｉ与ｂ．葡萄糖醛酸酶在１９５１年，ｂｕｅｈｌｅｒ等人就发现ｅ．ｃｏｌｉ会产生一种特别的酶一ｂ一葡萄糖醛酸酶（ｂ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ，简称０一ｇ）。ｂ．ｇ是一种酸性水解酶，特异地富含 于ｅ．ｃｏｂ中。国外在八十年代初开始将ｂ．ｇ的检出用于判断ｅ．ｃｏｌｉ的存在， 浚法较传统的多管发酵法具有快速、特异性强、价格低廉、灵敏度高等优点。不仅用于ｅ．ｃｏｌｉ的快速定性检测，还可达到定量检测，在饮用水及食品等行业检测中有非常广阔的应用前景｝４６１。 ａ．ｂ．ｏ的酶学特性及其化学分析ｈ ７】 ｐ—ｇ分类名ｂ．葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸苷水解酶（ｐ—ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅｇｌｕｃｕｃｕｒｎｏｓｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ），别名ｂ．葡萄糖醛酸苷酶，ｂ一葡萄糖苷酸酶，酶学编号ｅｃ３．１．１．３ｌ，作用为催化糖昔键水解，反应式为ｂ一葡萄糖醛酸苷＋ｈ２０＝乙醇＋葡萄糖醛酸。是由相同亚单位组成的四价糖蛋白，分子量２８０ｋｄ，十分 稳定，抗多种去垢剂，在环境条件变化较大的情况下仍然具有活性，如在巯 醇类还原剂ｂ．巯基乙醇或二硫苏糖醇存在时表现出极高的活性。它不需要辅 酶因子和阳离子，一些二价重金属离子如ｃｕ”、ｚｎ”、ｈｇ”、ａｇ”，能够抑 制其活性，但少量的螯合剂ｅｄｔａ存在下可维持其活性，并可进行分析。口 ．ｇ的适宜ｐｈ为５．２＿８．０，最适ｐｈ值７．０，ｐｈ４．３和ｐｈ８．５时其活性丧失５０％。ｂ．ｆ～ｃｏｌｉ产生ｂ．ｇ的原因ｅ．ｃｏｌｉ的ｄｎａ上，含有编码１３一ｇ的ｕｉｄａ基因。当样品含有ｅｃｏｌｉ时，天津科技大学顾４１－：学位论文它在培养过程中由于ｕｉｄ ａ基因的转录，会引起１３一ｇ在培养液中积聚【４８１。ｃ．１３一ｇ的特异性ｒｉｃｅｅｗ等曾检测了４６０例人粪、１０５头牛粪、５５匹马粪中所分离出的ｅ．ｃｏｌｉ，其中日一ｇ检出的阳性率高达９７％，而人畜粪便中的其它细菌用底物加以测试几乎均呈阴性反应。故ｂ—ｇ对ｅ．ｃｏｌｉ具有高度特异性。 １．５．３测定ｆ３一ｇ活性常用底物以下为国内外常用于测定ｅ．ｃｏｌｉｐ－ｇ活性的物质。 表１－４国内外常用测定０一ｇ活性的物质ｆ４９１．５．４本论文的研究目的及意义 国外对量ｃｄ，』ｐ—ｇ的研究较多，而翻内对ｅ．ｃｏｌｉｂ．ｇ性质的研究极少，且未见有对０－ｇ提取纯化的研究。本论文利用ｅ．ｃｏｌｉ特异性的含有ｐ－ｇ的性质，以对硝基酚一８．葡萄糖醛酸苷为底物测定ｂ－ｇ活性，确定ｅ．ｃｏｌｉ产ｂ—ｇ的最佳培养条件，存此基础 上提取纯化ｂ—ｇ，并对ｂ－ｇ提取物进行了检测。 下一步的工作是应用免疫学技术将纯化的ｂ—ｇ注入实验动物体内，获得 ｂ—ｇ的抗体，最终目的是利用ｅ ｃｏｉｉｌ３一ｇ抗体完成刑‘ｅ ｃｏｌｉ快速榆测，并 将产品制成试剂盒的形式。 利用ｂ－ｇ抗体检测ｂ－ｇ具有如下优点【５０】： （１）特异性强 抗原抗体反应是特异性最强的反应之一； （２）敏感度高 现代免疫化学采用各种有效方法最大限度的保存待检物质的抗原性，保 证检出超微量的抗原成分；（３）方法步骤统一若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。２材料与方法２．１材料２．１．１菌种ｅ ｃｏｌｉ ａｒｃｃ ２５９２２２．１．２试剂ｈ２ｓ０４ ｎａｏｈ ｋｃｌ ｈｃｌ ｎａｃｌｃａｃｌ２ ｎａ３ｐ０４天津化学试剂三厂天津化学试剂三厂 天津市天大化工实验厂 天津市天大化工实验厂天津开发区海光化学制药厂 天津市天达净化材料精细化工厂 天津市化学试剂三厂天津市化学试剂六厂ｋｈ２ｐ０４ ｎａ２ｈｐ０４ ｎａｈ２ｐ０４ ｎａｈｓ０３天津市化学试剂六ｊ一天津市化学试剂六厂 天津市天大化工实验厂 天津市天大化工实验厂ｂｉｏｍｏｌ公司ｐｈａｒｍａｃｉａ（ｎｈ４）２ｓ０４ｍｈ４）ｚｓ２０８ｓｅｐｈａｄｅｘ ｇ２００甲醇北京化工厂乙醇乙酸 甘油 蛋白胨 琼脂条 琼脂粉 甘氨酸 溴酚蓝天津市天大化工实验ｊ¨ 北京化工厂 天津市天大化工实验厂 天津市珠江卫生材料厂北京化学试剂公司同本进口分装ａｍｒｅｓｃｏ天津市医药工业技术研究所 天津恒生化工厂ｂｉｂ分装 天津市珠江卫生材料厂ｃａｎａｌａｂ高碘酸溶菌酶牛肉浸膏 丙烯酰胺 碱性品红聚乙二醇 ２一巯基乙醇北京化工厂 日本进口分装ａｉｒｌｒｅｓｃｏ４灭津科技大学硕上学位论文甘＋油磷酸钠曲拉通ｘ一１００ 牛血清白蛋白上海化学试剂采购供应站ｂｉｏｍ０１分装ｂ．ｍ．公司ａｍｒｅｓｃｏ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｓａｎｌａｎｄ十．烷基磺酸钠中分子量标准蛋白三羟甲基氨基甲烷考马斯亮蓝ｒ．２５０ 考马斯亮蓝ｇ一２５０ａｍｒｅｓｃｏ公司 ａｍｒｅｓｃｏ公司ａ／ｎｒｅｓｃｏｎ．ｎ．ｎ’，ｎ、一四甲基乙二胺 ｎ．ｎ’一甲叉双丙烯酰胺 对硝基酚．ｂ—ｄ一葡萄糖醛酸苷ｂｉｂ分装天津市医药科学研究所ｓｊｍｅｎｓ２．１．３仪器及设备冰箱干燥箱 透析袋微量进样器 冷冻离心机 蒸汽消毒器上海市实验仪器厂 德宇生物技术有限公司ｓｏｏｏｒｅｘ ｋｅｎｄｒｏ山东新华医疗器械厂 北京市宣武区天平厂上海天平仪器厂架盘药物天平ｙｐ型电子天平７５２分光光度计分析天平ｔｇ３２８ａ上海光谱仪器有限公司上海天平仪器厂 上海司乐仪器厂９５—１磁力搅拌器ｈｚｓ—ｈ水浴振荡器ｌｓｙ电热恒温水浴锅 ｂｓ一自动部分收集器 ｂｔｏｏ一３００ｍ流量调节器生化培养箱ｌｒｈ－－２５０一ａ哈尔滨市东联电子科技有限公司北京医疗设备，‘上海沪西分析仪厂 保定兰格恒流泵有限公司 广东省医疗器械厂 北京六一仪器厂ｄｙｙ－－ｉ］１２８ａ型垂直电泳槽 ｐｈｓｊ一４ａ型实验室ｐｈ酸度计ｄｙｙ—ｉｉｌｌ２ｂ型三恒多用电泳仪美国奥立龙公司北京六一仪器厂２．１．４培养基配制配方１：蛋白胨ｌ％，牛肉膏ｏ．３％，ｎａｃｌ０．５％，甘油磷酸钠３％，ｐｈ６．８㈦ 配方２：蛋白胨３％，甘油磷酸钠５％，ｐｈ６．８跚； 配方３：蛋白胨１％，牛肉膏ｏ．５％，ｎａｃｉ ｏ．５％，ｐｈ６．８川。２．１．５溶液配制２剌料与方法（１）底物溶液的配制（１９／ｌ）［５４１０．１ｇ对硝基酚。ｔ：３－葡萄糖醛酸苷，用ｏ．０５ｍｏｌ／ｌｐｈ ７．０ｐｂｓ溶液定容至１００ｍｌ的棕色容量瓶，４℃存放待用。 （２）对硝基酚贮备液的配ｎｉ－｜（１ｍｍｏｌ／ｌ）［５５１１．３９１ｌｇ对硝基酚，用ｏ．０５ｍｏｌ／ｌ ｐｈ７．０ｐｂｓ溶液定容至１００ｍｌ，再吸取ｌｍｌ上述溶液用ｏ．０５ｍｏｌ／ｌｐｈ ７．０ｐｂｓ定容至１００ｍｉ。（３）反应终止液的配ｎ（０．１ｍｏｌ／ｌ ｎａｏｈ）０．４９ｎａｏｈ用蒸馏水定容至１００ｍｌ。（４）磷酸盐缓冲液（ｐｂｓ）的配制１５６１ａ．０．０５ｍｏｌ／ｌ ｐｂｓ，ｎａａｈｐ０４ １．７９９，ｋｈｅｐ０４ｏ．６８９，用ｈｃｌ调ｐｈ至７．０，定容至１００ｍｌ：ｂ ０．０５ｍｏｌ／ｌ ｐｂｓ，ｎａ：ｈｐ０４ １７．９１９，ｋｈｚｐ０４６．８０９，用ｈｃｌ调ｐｈ至８．０．定容 ｏ．９１９，用ｈｃｉ调ｐｈ至８．０，定容至１０００ｍｌ：ｃ．１／１５ｍｏｌ／ｌ ｐｂｓ，ｎａ２ｈｐ０４ ２．３９９，ｋｈ２ｐ０４至ｌｏｏｍｌ。（５）饱和硫酸铵溶液的配制（４℃）［５７１ 称取２５９．４９硫酸铵溶解于５００ｍｌ蒸馏水中。 （６）考马斯亮蓝ｇ．２５０蛋白试剂的配制‘５８１称取１００ｍｇ考马斯亮蓝ｇ，２５０，溶于５０ｍ１９０％乙醇中，加入８５％『ｆ磷酸１００ｍｌ，最后加蒸馏水至１０００ｍｌ。（７）蛋白质贮备液的配制 称敬１００ｍｇ牛血清白蛋白，溶于１００ｍｌ蒸馏水中，制成１０００ｕ ｇ／ｍｌ贮备液。（８）菌体水解缓冲液的配制【５９ｌｏ．２ｍｏｉ／ｌ ｎａ２ｈｐ０４ ２５ｍｌ；ｏ．２ｍｏｌ／ｌ ｎａｈ２ｐ０４ ２５ｍｉ；ｓｕｃｒｏｓｅ ８９：ｅｄｔａ ｏ．９３９；ｔｒｉｔｏｎ ｘ一１００ ５０“ｌ；ｈ２０ ５０ｍｌ；ｐｈ ７．０。（９）ｓｄｓ一聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制［６ａ．单体贮液的配制０１称取１５９丙烯酰胺和０．４９亚甲双丙烯酰胺，用双蒸水溶解后，定容到 ５０ｍｌ，过滤后，装入棕色试剂瓶，于４℃冰箱中贮存。ｂ．ｔｒｉｓ—ｈｃｆｓｄｓ，ｐｈ８，８，４ｘ的配制称取９．１９ｔｒｉｓ碱（１．５ｍｏｌ／ｌ），用３０ｍｌ双蒸水溶解，用４ｍｏｌ／ｌｈｃｌ调校至ｐｈ８．８，再定容至５０ｍｌ，用０．４５ｕｍ滤膜过滤溶液，再加入ｏ．２９ｓｄｓ，于４℃ 冰箱中贮存。 ｃ．ｔｒｉｓ—ｈｃｉ／ｓｄｓ，ｐｈ６，８，８ｘ的配制称取３．０２５９ｔｒｉｓ碱（０．５ｍｏｌ／ｌ），用３０ｍｌ双蒸水溶解，用４ｍｏｌ／ｌｈｃｌ调校１６天津科技人学顺十：学位论文至ｐｈ６．８，再定容至５０ｍｌ，用ｏ．４５ｕｍ滤膜过滤溶液，再加入０．２９ｓｄｓ，于４ ℃冰箱中贮存。 ｄ．样品缓冲液的配制２５ｍｌ ｔｒｉｓ—ｈｃｉ／ｓｄｓ ｐｈ６．８，４ｘ；２０ｍｌ甘油：４９ ｓｄｓ：２ｍｌ ２－ｍｅ；ｌｍｇ溴酚蓝，加双蒸水至１００ｍｌ，混匀，等量分装成ｌｍｌ，于－－２０℃贮存。ｅ．ｓｄｓ电极缓冲液１．０２９ｔｒｉｓ碱，１４．４９甘氨酸，ｌｇ ｓｄｓ，加双蒸水至１０００ｍｌ。ｆ．固定液的配制 ５０％甲醇，１０％乙酸，４０％ｈ２０。ｇ．染色液的配制 ａ．考马斯亮蓝染色液的配制 ５０％甲醇，０．０５％考马斯亮蓝ｒ一２５０，１０％乙酸，４０％ｈ２０；用双蒸水配制， 在加乙酸和水之前应将考马斯亮蓝ｒ．２５０溶于甲醇。 ｂ．糖蛋白染色液的配制 碱性品红２００ｍｇ溶于１２０ｍｌ双蒸水中，加入２０ｍｌ ｉ％ｎａｈｓ０３然后加水 至２００ｍｌ，同时加入０．０３９活性碳过滤后使用。 ｈ脱色液的配制５％甲醇，７％乙酸，８８％ｈ，ｏ。２．２方法２．２．１菌种的培养 ２．２．１．１种子培养挑取斜面保存的ｅ．ｃｏｌｉ接种于液体种子培养基中，３７ ６ｃ静置培养１２ｈ。 ２．２．１．２扩大培养 ｆ１）１１ｈ振荡培养菌液 吸取种子培养液ｉｍｌ，转接至装有９ｍｌ液体培养基的１００ｍｌ三角瓶内， 振荡（３７℃，１１０ｒｐｍ）培养，每１ｈ取样一次。 （２）８天振荡培养菌液吸取种子培养液ｌｍｌ，转接至装有９ｍｌ液体培养基的１００ｍｌ三角瓶内，８天振荡（３７。ｃ，１１０ｒｐｍ）培养，每２４ｈ取样一次。２．２．２菌种性能的测定２．２．２．１菌数与ｏｉｌ值的关系曲线的测定ｆ６１１（１）将ｅ，ｃｏｌｉ种子培养液继续振荡培养６ｈ； （２）将振荡培养后的菌液按１、ｌ／２、１／４、１／１０、１／１００稀释度稀释，测出不同 稀释度菌悬液在６５０ｎｍ波长处的ｏｄ值： （３）将上述稀释液分别按１ ０倍倍比稀释，做活菌计数： （４）以ｏｄ值为横坐标，对应菌数为纵坐标绘制菌数与ｏｄ值的关系曲线。２．２．２．２ｅｃｏｌｉ生长曲线的测定［６２ｉｆ１１培养ｅ ｃｏｔｉ种子液；（２）吸取种子培养液１ｍ１，转接至装有９ｍｌ液体培养基的１００ｍｌ三角瓶内，放入恒温水浴摇床上振荡（３７。ｃ，１１０ｒｐｍ）培养：（３）将接入ｌｍｌ种子液尚未振荡的培养液倒入比色皿中．以未接菌的液体培养基调零，６５０ｎｍ测定ｏｄ值，即为ｅ．ｃｏｔｉ生长曲线的零点值；（４）在培养过程中，每１ｈ取样’次，ｏｄ值测定方法同（３）： （５）将测得的ｏｄ值用菌数与ｏｄ值关系曲线换算为ｌｇ菌数，以培养时间为横 坐标，１９菌数为纵坐标作图，绘制ｅ．ｃｏｌｉ生长曲线。 ２．２．２＿３活菌计数 （１）吸取待检菌液ｌｍｌ，注入装有９ｍｌ无菌水的试管中，制成１０。稀释液：（２）反复吹吸１０“的稀释液，使其混合均匀后吸取ｌｍｌ，注入装有９ｍｌ无菌水的试管中，制成１０。２的稀释液； （３）按ｉ述程序操作，制备ｌｏ倍递增稀释液； （４）选择适宜浓度的稀释液，移ｌｍｌ入平皿，然后将１５ｍ１ ４６。ｃ左右的肉汤培 养基注入平皿，转动平皿使菌液与培养基混合均匀，每个稀释度做２．３个平行样；（５）待培养基凝固后，翻转平皿，在３７。ｃ恒温培养箱内倒置培养２４—４８ｈ，取出，计数。２．２．３１３一ｇ活性测定２．２．３．１对硝基酚标准曲线的测定【”ｌ （１）对硝基酚标准液的配制 将对硝基酚贮备液用０．０５ｍｏｊ／ｌｐｈ ７．０ｐｔ３ｓ梯度稀释为１０—４８０“ｍｏｌ／ｌ对硝基酚标准液（每１０ｕ ｍｏｌ／ｌ增加一个稀释度）： （２）对硝基酚标准曲线的绘制 分别吸取以上各浓度的对硝基酚标准液２ｍｌ于试管中，各加入ｏ．０５ｍｏｌ／ｌｐｈ ７．０ ｐｂｓ ２ｍｌ，０．１ｍｏｌ／ｌｎａｏｈ ０．４ｍｌ，振荡混匀，２ｍｉｎ后，在４０５ｎｍ波长测ｏｄ值。空白以ｏ．０５ｍｏｌ／ｌｐｈ２．２．３．２７．０ｐｂｓ代替对硝基酚标准液，其他操作同上。１３．ｇ活性测定步骤【删（１）将培养到一定时间的菌液取出； （２）吸取一定量菌液用无菌水调为适当稀释度后，校正ｐｈ至７．０； （３）吸取２ｍｌ稀释菌液，加入２ｍｌ底物溶液，作为样品液，３７。ｃ保温１ｈ； （４）吸取２ｍｌ稀释菌液，加入２ｍｌｐｂｓ缓冲溶液，作为空白，３７。ｃ保温１ｈ；（５）保温结束后，取出，分别向样品液和空白加入０．４ｍ１０．１ｍｏｌ／ｌ的ｎａｏｈ，终止反应，离心，取其上清液； （６）在４０５ｎｍ波长下用空白校正零点后测定样品液ｏｄ值；天津科技人学硕士学位论文ｒ７１培养过程中ｐｈ值的测定 ａ＿哿培养到一定时削的菌液取出；ｂ．用ｐｈ计测定菌液ｐｈ值。２．２．３．３ｂ—ｇ活性的测定内容ｆ１１冻融破壁前后酶活测定 ｆ２）不同培养条件下酶活的测定ａ．不同培养基形式酶活ｂ．不同培养时间酶活ａ不同培养基配方１ １ｈ振荡培养酶活ｂ．不同培养基配方８天振荡培养酶活＜３、提取纯化过程中§．ｇ活性的测定２．２．４ｂ．ｇ的提取纯化及检测２．２．４．１不同方法破壁的实验步骤（ｉ）冻融破壁【６５］ ａ爿哿ｅ ｃｏｌｉ培养至稳定期； ｂ一哿菌液置于－－７０℃低温冰箱过夜： ｃ．次日取出放入３７℃水浴中融化： ｄ．放入８４℃水浴中约１０ｍｉｎ；ｅ．一７０。ｃ低温冰箱再次过夜；ｆ次ｆ＿ｉ｛取出放入３７℃水浴中融化： ｇ．加细胞致溶剂ｔｒｉｔｏｎ。 （２）酶溶破壁【５９】 ａ．将ｅ．ｃｏｌｉ培养至稳定期，离心，弃上清； ｂ．ｊ哿菌体悬浮于菌体水解缓冲液中：ｃ加入ｌ ５０ｕｌ溶菌酶（１０ｍｇ／ｍ１）：ｄ。室温放置２０ｍｉｎ。使菌体分解。ｆ３）液氮破壁㈣ａ．将ｅ．ｃｏｉｌ培养至稳定期，离心，弃上清； ｂ．振荡细胞沉淀，使其形成粘稠的细胞糊； ｃ．拔出注射器的活塞，用塞子塞住底部，加入细胞糊： ｄ．向烧杯中加入液氮，将注射器悬浮于液氮之上，除去底部的塞子，插入活 塞，将细胞糊推入液氮中：ｅ小心将液氮连同细胞糊倒入混和杯中：ｆ高速连续搅拌３次，每次２ｍｉｎ。２．２．４．２１３．ｇ的提取酬将ｅ ｃｏｌｆ培养至酶活高峰，停止培养，按下面工艺路线进行提取。９２利科与方法细胞培养液一离。ｌ ｅ清液￡清液一加饱和硫酸铵一离心［沉淀一溶解一离心ｉ一沉淀上清液上清液上清液一加硫酸铵一离心１沉淀一纯化 图２—１２．２．４．３ｐ．ｇ提取工艺流程图ｂ．ｇ的纯化采用凝胶过滤联合吸附层析法对ｂ．ｇ进行纯化。 （１）凝胶过滤法纯化ｂ—ｇ【６７ｊａ．将色谱柱垂直固定，下端接出口内径为ｉｍｍ的塑料管，调节塑料管出口与凝胶床液丽阔的距离，从而保持适宜的流速； ｂ．凝胶床支持物采用玻璃纤维，加入洗脱液，降低塑料管出口，让液体流出， 以排出气体，提高塑料管出口： ｃ一哿洗好的凝胶悬液加到管内，待胶粒沉降，降低塑料管出口，保持所需柱 头压力，让洗脱液流出；ｄ．色谱柱接蠕动泵调节好流速，使３倍体积沈脱液流过凝胶柱：ｅ．选择一定的加样量，控ｉｉｉ－‘定的流速。（２１磷酸钙凝胶法纯化ｐ．ｇ【６８１ａ．将色谱柱垂直固定，下端接出口内径为ｉｍｍ的塑料管，调节塑料管出口与凝胶床液面间的距离，从而保持适宜的流速；ｂ．７疑胶床支持物采用玻璃纤维，加入洗脱液，降低塑料管出口，让液体流出， 以排出气体，提高塑料管出口； ｃ．将洗好的凝胶悬液加到管内，待胶粒沉降，降低塑料管出口，保持所需柱 头压力，让洗脱液流出； ｄ．色谱柱接蠕动泵调节好流速，使３倍体积洗脱液流过凝胶柱； ｅ．选择一定的加样量，控制一定的流速。２．２．４．４ｉｉ．ｇ提取纯化回收率与提纯倍数的计算（１）蛋白的测定ｆ６９ｉ蛋白的测定采用考马斯亮蓝ｇ一２５０法。 ａ．蛋白标准液的配制天津科挫人学硕｛＿学位论殳表２－１ ２００—１０００ｔ－ｔｇ／ｍｌ蛋白标准液的配制ｂ．标准曲线的测定 ａ．１００—１０００“ｇ／ｍｌ标准蛋白曲线：吸取含有２００、４００、６００、８００、ｌ ０００ ｕｇ的牛血清蛋白标准液０．１ｍｌ，分别放入１０ｍｌ试管中，加入５．０ｍｌ考马斯亮篮ｇ一２５０蛋白试剂，混匀＋２ｍｉｎ后在５９５ｎｍ测吸光度值，空白以蒸馏水代替扔：准液，以吸光度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，作标准曲线；ｂ．０—１００ｕｇ／ｍｌ标准蛋白曲线：吸取含有２０、４０、６０、８０、１００“ｇ的牛血清蛋白标准液ｏ．５ｍｌ，分别放入１０ｍｌ试管中，加入５．０ｍｌ考马斯亮蓝ｇ一２５０蛋 白试剂，其操作同上，以吸光度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，作标准曲线：ｃ．样品蛋白质浓度的测定：样品中蛋白质浓度的测定除加入标准液为样品液外，其余操作完全相同。通过标准曲线即可查得每毫升溶液中蛋白质的含量。位）ｂ—ｇ回收率与提纯倍数的计算２．２．４．５提取及纯化物成分的检测 采用ｓｄｓ一聚丙烯酰股电泳（ｓｄｓ—ｐａｇｅ）检测样品的纯度和分予量。 （１）电泳浓缩胶与分离胶的配制【７０】浓缩胶和分离胶的配制方法见表２－３ 表２－３电泳浓缩胶与分离胶的配方（２）电泳实验步骤［７０１ ａ．两块干净的玻璃平板和组装电泳装置的玻璃平板央层，固定在灌胶支架上 并用琼脂糖密封；ｂ按上表配制分离胶，然后加入１０％过硫酸铵和ｔｅｍｅｄ，轻轻搅拌均匀； ｃ．立即用滴管沿玻璃夹层加入分离胶，然后缓馒加入蒸馏水封液面。让凝胶在室温聚合４０ｒａｉｎ： ｄ．ｆ顷去顶层水层，并以ｔｒｉｓ—ｈｃｉ／ｓｄｓｐｈ８．８４×缓冲液冲洗凝胶的顶部表面；ｅ按上表配制浓缩胶，轻轻搅拌均匀；ｆ立即用滴管沿玻璃夹层加入浓缩胶，并将梳子插入夹层的浓缩胶液体中，让 凝胶在室温聚合３０ｒａｉｎ：ｇ．在具有螺口的微量离心管中，用２×ｓｄｓ样品缓冲液按１：ｌ稀释待测蛋白样品，于１００℃煮沸３ｍｉｒａｈ小心拔出梳子，并用电极缓冲液冲洗加样孔，并以此缓冲液充满之； ｉ．在阴极缓冲液室和阳极缓冲液室中加入电极缓冲液： ｊ．用微量进样器将处理好的蛋白样品加入加样孔； ｋ．接通电源，恒流电泳，至溴酚蓝到达凝姣底部为止： ｌｔ关闭电源，回收电极缓冲液，撤去电极装置，取出凝胶： ｍ．将凝胶放在固定液中，固定ｌｈ； ｎ１ｆ顷去固定液，以考马斯亮蓝染色液覆盖凝胶，染色１．５ｈ；ｏ．倾去染色液，以脱色液覆盖凝胶，平均每２ｈ换一次脱色液，商至获得蓝色条带和干净背景。糖蛋白的电泳检测ａ—ｌ步同上 ｍ．ｊ哿１％高碘酸溶于７％乙酸中，作为固定液，用该溶液覆盖凝胶，４。ｃ，暗处放置１ｈ；ｎ．用糖蛋白染色液覆盖凝胶，４＂ｃ，暗处放置ｌｈ；ｏ．ｉ％ｎａｈｓ０３溶于ｏ．１ｍｏｖｌｈｃｌ中，用此溶液进行脱色，平均每２ｈ换一次脱 色液，直至获碍红色条带和干净背景。天津科技火学项ｌ学位论文３结果与讨论３．１菌种的培养 ３．１．１种子培养 ｅ．ｃｏｌｉ接种十种子培养基，３７。ｃ静置培养１２ｈ，菌数约达１０７。３．１．２扩大培养扩大培养后的生长趋势见菌种性能测定。３．２菌种性能的测定３．２．１菌数与ｏｄ值的关系曲线的测定菌的计数可采用活菌计数法，但此法循环周期长，且操作繁琐，而菌数与ｏｄ值在一定范围内存在线性关系，通过测定菌数与ｏｄ值的关系曲线，今后实验中在不需要特别精确的情况下，可通过测定ｏｄ值大致推断出菌数， 不必每次都做活菌计数。５雩 呈４螽３ｌ通２ｏ０ｏ．５１．５２图３—１培养基配方ｌ菌数与ｏｄ值关系曲线 标准曲线方程：ｙ＝３．１６３４ｘ一０．５００９印６．ｘ：吸光度ｙ：菌数×１０。ｃｆｕ／ｍｌ２５｛螽４．｝ 翘ｏ｝２ｒ０１。————０ｏ．５ｌ．５２图３．２培养基配方２菌数与ｏｄ值关系曲线标准曲线方程：ｙ＝４．０６３５ｘ一０．７８１ｘ：吸光度ｙ：菌数×１０—９ｃｆｔ∥ｍｌ暑１．５更瓤 蛭ｒｌ０ ５００ｏ．２０．４０．６０．８图３—３培养基配方３菌数与ｏｄ值关系曲线 标准曲线方程：ｙ＝１．７３２５ｘ．ｏ．０３９３ ３．２．２ｅ．ｃｏｌｉ生长曲线的测定 将一定量的出发菌种（ｅ ｃｏｌｉ）接种于适宜的新鲜液体培养基中，在培养期 ｘ：吸光度 ｙ：菌数×１ ０－９ｃｆｕ／ｍｌ间不再补充营养物，也不从中除去某些物质，那么，为其提供适宜的培养条件后，在不同的培养时间内，取样检测细菌的数目及其性状，则可以发现其 生长过程呈现一定的规律性，这个过程也是ｅ．ｃｏｌｉ的群体生长周期。如果将 活菌数对培养时怕ｊ做图，即以培养时间为横坐标，培养物中活菌数的对数为 纵坐标，可得出一条曲线，即为生长曲线。根据这条曲线，可将菌体生长周 期分为迟缓期、对数生长期、稳定期和衰亡期【５“。不同的细菌有不同的生长曲线，同一种细菌在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定生长曲线对于了解和掌握ｅｃｏｉｌ的生长规律是 很有帮助的。 本实验中将ｅ．ｃｏｌｉ分别接种于三种配方培养基中，所得生长曲线如ｆ：瓣１０： 姐 兰 ９８７ｔｏ４６８１０１２时间（ｈ）图３．４培养基配方】中ｅ．ｃｏｌｉ生长曲线天津科技人学｛ｌｊｊ士学位论文努１０ 擗普９● ．ｒ。● ◆ｌｏ２４６８ｊｏ１２时间（ｈ）图３－５培养基配方２中ｅ．ｃｏｌｉ生长曲线 黎１０｛匿当９●●８７◆●ｏ●．。２４６８１０１２时间（ｈ）图３－６培养基配方３中ｅ．ｃｏｌｉ生长曲线添ｌｏ 髓 竺９８配方１配方２配方３培养基配方图３—７振荡培养６ｈ时菌体数量 由以上四图（３－４，３—５，３－６，３－７）可知：ｅ．ｃｏｌｉ在这三种配方培养基中的生长趋势基本一致，即振荡２ｈ后进入对数生长期，振荡６ｈ达稳定期。６ｈ时的菌数分别为：４．３×１０９ ｃｆｕ／ｍｌ、５．７×１０９ ｃｆｕ／ｍｌ、１．２×１０９ｃｆｕ／ｍｌ。由此可以看出，对于ｅ．ｃｏｌｉ的生长培养基配方２优于配方１优于配方３。３．２．３活菌计数剐菌落总数是被检样品在一定条件下培养后，所得１９或ｌｍｌ检样中所含细菌菌落的总数。由于一个活细胞能形成一个菌落，因此，菌落数就是待测样品所含的活菌数。 选取菌落数在３０—３００之间的平板作为菌落总数测定标准。同一稀释度倒 ２—３个平板，取其平均值。 通过平皿上出现的菌落数，推算出原菌液含菌数，计算公式为： 总活菌数／ｍｌ＝同一稀释度２—３个平皿上的菌落平均数×稀释倍数３．３ｂ．ｇ活性测定 ｂ．ｇ活性测定原理在目．ｇ活性测定中，ｅ．ｃｏｌｉｂ．ｇ水解底物，游离出呈色物质，可用分光３．３．１光度计在特定波长处比色测定。 ０．ｇ活力定义为：在ｐｈ７．０，３７。ｃ条件下，每小时内使底物释放１ 呈色物质所需的酶量为一个活力单位，记作ｕ。 ３．３．２底物的选择 测定ｓ．ｇ活性的底物主要有：５一溴一４．氯．３一吲哚一ｂ一葡萄糖醛酸苷 （ｘ．ｇｌｕｃ），６氯一３一吲哚．１３一葡萄糖醛酸苷（ｓａｌｍｏｎ．ｇｌｕ），羟基喹啉．ｂ一葡萄 糖醛酸苷（ｈｏｑ），４－甲基伞形酮一８一葡萄糖醛酸苷（ｍｕｇ），对硝基酚．ｂ一葡 萄糖醛酸苷（ｐｎｐｇ）。 天津医药科学研究所于２０００年合成了ｐｎｐｇ，纯度与ｓｉｇｍａ公司ｐｎｐｇｕｍｏｌ相比略高，且价格不足ｓｉｇｍａ公司价格的十分之一，因而选择ｐｎｐｇ为底物。在０．ｇ活性测定中，ｅｃｏｌｉ ０一ｇ与ｐｎｐｇ发生如下反应：对硝基苯基且葡萄糖醛酸苷—骂对硝基酚‘黄’＋。一葡萄糖醛酸苷３．３．３对硝基酚标准曲线的绘制对硝基酚为０．ｇ活性测定中的呈色物质，在一定浓度范围内，对硝基酚 浓度与吸光度值呈『ｆ比，通过测定对硝基酚浓度与吸光度值标准曲线，可在酶活测定时由吸光度值查标准曲线得对硝基酚浓度，从而完成对酶活的换算。ｅ５ ４口誊。３２ １ ｏ ｏ １００ ２００３００４００５００对硝基酚含量（ｕ ｍｏｌ几） 图３－８对硝基酚标准曲线标准曲线方程：ｙ＝ｏ．００５９ｘ一０．０１２４ｘ：溶液浓度ｙ：吸光度天津科技大学坝｛学位论文对硝基酚的颜色与溶液ｐｈ值有很大关系。对硝基酚浓度相同的情况下，ｐｈ值越大，溶液颜色越深，因而测定酶活时，必须先将待测液ｐｈ值统一调 至７．０，以消除因ｐｈ值影响而产生的颜色误差。 在溶液ｐｈ为７．０条件下，对硝基酚浓度超过４８０仪器检测的范围。３．３．４ｕｍｏｌ／ｌ，吸光度值超出ｂ．ｇ活性测定结果 因ｂ—ｇ为胞内酶，所以从理论上推断，ｅ．ｃｏｌｉ经冻融破壁后８．ｇ活性应３．３．４．１冻融破壁前后酶活测定 显著提高，可是实验结果却并非如此。将ｅ．ｃｏｌｉ在三中配方培养基中分别培养至酶活高峰，测培养液中０一ｇ活性，再对其细胞进行冻融破壁。冻融后的细胞分成两组，一组中加细胞致溶剂ｔｒｉｔｏｎ，另一组不加。测定酶活后发现，ｅ．ｃｏｔｉ经冻融破壁酶活反而降低，见表３—１。表３．１冻融破壁前后酶活测定培养液中的ｂ—ｇ活性大大高于冻融破壁后的ｆ３．ｇ活性，说明ｂ．ｏ大部 分存在于培养液中，因而，提取ｐ—ｇ无需对ｅ．ｃｏｌｉ进行破壁。３．３．４．２不同培养条件下酶活的测定采用不同的培养条件培养ｆ＿．ｃｏｌｉ，测定ｂ．ｇ活性，目的是筛选出适合ｅ．ｃｏｌｉ 产ｂ—ｇ的培养基形式，培养基配方和培养时问，为ｆ３．ｇ的提取和纯化做准备。 （１）不同培养基形式将ｅ．ｃｏｌｉ分别接种于三种配方液体培养基和普通肉汤斜面，同时置３７。ｃ温箱静置培养，在开始培养１、２、３、４天测其酶活。斜面培养基上的菌用与 液体培养基等量的生理盐水洗脱后测其酶活。测定结果如下：一ｎ）螟嚣∞∞∞ ∞∞∞０．＾ｕ餐图３－９不同培养基形式酶活的测定十配方１—镕～配方２ 配方３ 斜面由测定结果可以看出，对于提高０一ｇ活性，液体培养优于斜面培养。这 是因为在液体培养基中￡ｃｏｉｌ分布均匀，吸收培养基中的营养比较充分。而 斜面培养，因为是划线分离，￡ｅｏｌｉ叠加繁殖，只能吸收局部的营养。此外， 液体培养基比斜面培养基的溶氧量大，利于￡ｃｏｚｉ的生长，所以在液体培养基中ｐ—ｇ活性高。 ｆ２１不同培养时间ａ．不同培养基配方ｌｌｈ振荡培养酶活 不同的培养基配方为ｅ．ｃｏｌｉ提供的生长环境各不相同，对ｐｈ缓冲能力也不相同，从而影响ｚｃｏｌｉ的生长，进而使酶活产生差别，此外随培养时间延长，ｂ．ｇ活性也在不断变化。测定ｅ．ｃｏｌｉ在不同配方培养基中振荡１ ｌｈ的酶活变化，目的是挑选出适 合ｅ．ｃｏｌｉ产酶的培养基配方，并挑选出产酶最佳培养时间。 酶活的变化如图３－９，３－１０，３－１ ｌ所示。ｓ ８０００燠６０００ 溢４０００２０００（） （）２４６８１０１２时间（ｈ）图３—１０配方１不同培养时间酶活ｏ８０００躐；ｏ０２４６８１０１２时间（ｈ）图３－１１配方２不同培养时间酶活§８０００蝰６０００蛙４０００２００００．董，——＿＼／＿＼——＼／“、１０１２时问（ｈ） 图３－１２配方３不同培养ｂ，ｊ ｆａ］酶活 由以上三图（３—１０，３．１１，３．１２）可知：ａ．０一ｇ在振荡培养６ｈ时达到酶活峰值，分别为：配方ｌ７５６４．０７５６０８，８１ｕ、配方２ｕ、配方３ ３３０９．８３ｕ： ２０００ｂ．配方１ ４０００ｕ以上持续时问５ｈ；配方２ ７０００ｕ以上持续时间３ｈ：配方３ｕ左右持续时间１０ｈ：ｃ．振荡培养６ｈ后，随着振荡时间的增长，酶活皆呈ｆ降趋势； ｄ．不同培养基配方１１ｈ振荡培养ｐｈ值变化 培养液ｐｈ值的变化对菌体产酶有较为显著的影响，测定培养液的ｐｈ值， 与酶活测定结果综合考虑，有助于筛选出适宜ｅ．ｃｏｌｉ产ｐ．ｇ的培养基配方。 ＝ｊ＝种培养基配方１１ｈ振荡培养ｐｈ值的变化如图３－１３，３—１４，３．１５所示。 吾８ ７６０２４６ｏｏｌ０【ｎ￡日 －｝＝●问 （ｈ图３—１３配方１不同培养时问ｐｈ值丢８７．————＋——＋——．－——◆＿——．＿——◆＿——ｐ——．－——ｐ。６——一一０ ２４一－－ｊ８ｊ一６１０ｉ２时ｆａｊ（ｈ）图３一１４配方２不同培养时间ｐｈ值．—／—飞———一８ １０１２时间（ｈ）图３—１５配方３不同培养时间ｐｈ值 由图３—１３，３一１４，３—１５可见：不同培养基配方对ｐｈ缓冲能力为配方２ 优于配方１优于配方３。 培养基配方不同，能为ｅ．ｃｏｌｉ提供的营养不一致，对ｐｈ缓冲能力也不同。由于菌体数量及ｐｈ对酶活影响较大，因而配方２适合ｅ．ｃｏｌｉ生长，同时产生大量的ｂ—ｇ。ｂ．不同培养基配方８天振荡培养酶活育资料显示，对ｅ．ｃｏｌｉ采取８天振荡培养，随培养时问的延长，培养液 中ｐ—ｇ会逐渐增加。本实验对ｅ．ｃｏｌｉ进行８天振荡培养。在此过程中，每２４ｈ 测定菌液的ｐ—ｇ活性，观察发展趋势。３ ｕ５００ ４００忙３００菇ｉ船０．．／＼．＋．—一１０天数图３．１６培养基配方１振荡培养８天酶活ｏ ５０００ｇ ４０００蜞黜８龉１０００ｎ—／＼．．．一＼ｒ／。ｌｏ天数图３—１７培养基配方２振荡培养８天酶活灭律科技大学坝ｉｊ学位论文磊１８８８００：／—＼一．．．． 套２０００—一’“１０００１０天数图３，１８培养基配方３振荡培养８天酶活 从图３—１６，３．１７，３—１８中可以看出：ｅ．ｃｏｌｉ在三种配方培养基中振荡培养 ８天的ｂ—ｇ活性并不是一直呈增长趋势，且活性极值低于振荡６ｈ时的酶活。 从经济角度来讲，培养时间的延长，增加了人力物力的损耗，且存在酶的失 活作用。如此看来８天培养并不适用，培养周期可以大大缩短。 通过不同培养条件下酶活的测定，可得出ｆ。ｃｏｌｉ最适产酶条件为使用液 体培养基配方２振荡培养６ｈ。３．４ｂ．ｇ的提取纯化及检测 ｐ—ｇ是溶酶体酸性水解糖昔酶，原理上当细胞坏死时，溶酶体外膜破裂，３．４．１不同方法破壁结果 酶溢出进入细胞质，使细胞发生自溶，此时，ｓ．ｇ大量释放，可使菌液ｂ—ｇ活性升高。３．４．１．１不同方法破壁原理ｆ１１冻融破壁法原理例冻融破壁法是将细胞在－－２０℃以下冰冻，室温融解乃至高温保温反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。（２）酶溶破碎法原理【５９】 酶溶破碎是利用酶反应方法，分解细胞壁上的特殊连接键，从而破坏细 胞壁结构，达到破碎细胞使细胞内含留物流出的目的。 （３、液氮破壁法原理【６６ｌ液氮破壁是以液氮为冷冻剂，将细胞降至玻璃化温度，利用细胞在低温下变脆的性质，在高速冲击和磨擦下使细胞粉碎。 ３．４．１．２不同方法破壁效果的比较破壁率（％）＝（１一～ｂ）×１００％ａ：破壁后活菌数ｂ：破壁前活菌数３结果与讨论由破壁率的计算可见，冻融法破壁效果最佳。但相对于其他两种方法， 冻融破壁具有周期长，能耗大等缺点。 ３．４．２１３．ｇ的提取蛋白质是亲水溶胶，它的稳定因素有两个：一是胶粒上的电荷，使他们 之间互相排斥，不易凝固成团。二是水化膜，它使凝胶颗粒与水相溶，又在胶粒问起隔离作用。如果这两个因素全被破坏，蛋白质即会沉淀。如溶液的 ｐｈ值，溶剂的极性，蛋白质的沉淀剂及盐离予浓度都会影响蛋白质的溶解度。 提取０一ｇ的工艺路线的主要是利用硫酸铵对蛋白质的沉淀作用。（１、硫酸铵浓度的选择：在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大，越容易沉淀，使用盐饱和度的极 限越低。如欲进行两次盐析时，第一次由于浓度较稀，盐析分段范围较宽， 第二次则逐渐收窄。 提取过程中共使用２次硫酸铵，首先使用的４＂ｃ饱和硫酸铵沉淀蛋白，然 后采用３２—４５％饱和度的硫酸铵分组沉淀，边搅拌边加入硫酸铵固体粉末至 ３２％饱和度、室温放置２ｈ，离心２０ ｍｉｎ、弃沉淀，上清液中继续加入固体硫 酸铵至４５％饱和度、搅拌３０ ｍｉｎ后、于４＂ｃ放置数小时或过夜，离心２０ｍｉｎ， 收集沉淀。ｆ２１离心转速的确定： 物质分子大小、形状和质量不同，它们在离心时表现出不同的行为。原 则上，质量大的分子沉降速度快：而体积大的分子阻力大，沉降较慢。本实验从培养液中分离菌体时，采用转速１００００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，其余离心采用１００００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ。（３）沉淀的溶解 沉淀的溶解使用少量的ｐｈ８．０ １／１５ｍｏｌ／ｌ磷酸盐缓冲液。３．４．３ｂ，ｇ的纯化３．４．３．１凝胶过滤法纯化ｂ．ｇ （１）基本原理和适用范围【７２１凝胶过滤的基本原理为：将溶胀的多孔凝胶颗粒装入柱中，当把含有不 同分子量的蛋白质混合样品加到柱上时，再用洗脱液沈脱柱子，这时分予量 大的物质不能渗入多孔凝胶颗粒内部，只能沿颗粒间的空隙向下流动，受到天津科技人学硕十学位论文阻碍作用小、流程短，先被洗脱出层析柱：而分子量小的物质可渗入多孔凝 胶颗粒内部，受到的５且碍作用大、流程长，后被洗脱出层析柱。这种层析的 结果，使得多孑ｌ凝胶颗粒象筛子一样，将分子量大小不一的各种蛋白质分别 先后不同洗脱出柱，从而达到分离的目的。孔径较小的葡聚糖凝胶（ｇ一１０，ｇ．１５，ｇ．２０，ｇ一５０）适用于脱盐，肽与其它小分子的分离，孔径较大的凝胶（ｇ．７５，ｇ一１００，ｇ一１５０，ｇ一２００）适用于分离蛋白质与其它大分子。表３－３各型葡聚糖凝胶的性质（２滔ｌ胶过滤的参数 ａ．凝胶型号的选择 由于０一ｇ的分子量为２８０ｋｄ，因此本实验采用ｓｅ曲ａｄｅｘｇ一２００凝胶，而 且ｓｅｐｈａｄｅｘｇ．２００凝胶是分离蛋白质的常用凝胶； ｂ．凝胶的准备将５９ ｓｅｐｈａｄｅｘｇ．２００干胶浸没在１ ０００ｍｌ洗脱液内。缓缓搅拌，使其分散 在溶液内（不可剧烈长时间搅拌，因软凝胶易破损），９０℃水浴加热膨胀约５ｈ， 这样膨胀需时短，可除去气体（室温浸泡后还需除气），并达到部分消毒。将膨胀了的凝胶移入玻筒，将玻筒倒转一次，然后静置使凝胶粒沉降，吸去上层液中细悬浮物。如此重复处理一次。 ｃ．洗脱液的选择 由于凝胶不受大多数缓冲离子的影响，所以凡是对样品成分无破坏作用的离子种类都可以用来配缓冲液。因为各种凝胶都含有少量带电基团，为了减少这些基团和样品带电基团之间的相互作用，洗脱剂的离子强度应大于 ｏ．０２。本实验选用的洗脱液为０．０５ｍｏｌ／ｌ ｄ．流速的选择 流速应根据所分离的物质的性质通过预试确定，一般ｓｅｐｈａｄｅｘｇ．２００洗 脱流速为２－６ｍｌ／ｈ／ｃｍ２；本实验选择流速ｏ．１ｍｌ／ｍｉｎ：洗脱量：３ｍｌ／管； ｅ．加样量的选择ｐｈ８．０ ｐｂｓ；一定体积的凝胶柱一次只能处理一定体积的样品，加样量过高，会导致凝胶分离效果的降低，同时，加样量也不宜太少，会造成检测的困难。遵守样品体积为床体积的ｌ％一５％的规则，凝胶的高度为１５ｃｍ，柱床体积１４．２５ｃｍ３，上样量ｌｍｌｆ３、凝胶过滤结果基 ｌ星０．８。０．６ ０．４ ０．２ ０ ０ｌｏ２０３０５（）６０沈脱管数图３—１９ ｓｅｐｈａｄｅｘ ｇ一２００纯化ｂ．ｇ洗脱曲线ｐ，ｇ凝胶过滤图谱如图３一ｉ９所示，可见粗提物中含有２种蛋白。将活性峰主要部分合并，浓缩，电泳检测蛋白峰成分。３．４．３．２吸附层析法纯化ｂ．ｇ（１）基本原理ｆ６８】吸附层析是一种常用的分离酶蛋白的技术。多用磷酸钙凝胶、白土类纤 维素及淀粉等作为吸附剂。其主要原理是根据物质对活性物体表面吸附亲和 力的差异来分离。而亲和力则主要取决于物质极性的大小。有机化合物分子 中功能团要比非极性的碳链骨架对分离有更大的影响。所以吸附层析是按混 合物中各物质所含极性基团的数目来分离它们。 （２）吸附层析的参数 ａ．凝胶的准备把２ｌ烧杯放在一个磁力搅拌器上，用两个恒流泵以１２ｍｌ／ｍｉ ｎ的流速等量地将ｌｌ的０．４ｍｏｌ／ｌ的ｃａｃｌ。和ｌｌ的０．４ｍｏｌ／ｌ的ｎａ，ｐ０．加到烧杯中并持续搅拌，搅拌速度以刚能连续搅动液面为准。漓加完毕后，静置沉淀，倾去上清液。以约３ｌ蒸馏水、分多次洗涤沉淀。向重新悬浮于水中的沉淀中加入０．０ｌｍｏｌ／ｌ ｐｈ８．０的ｐｂｓ缓冲液，于８０℃下水浴１ｈ，静置后倾去上清液，以沉淀分离介质装填玻璃层析柱； ｂ．洗脱液的选择据资料显示，ｄ—ｇ在ｐｈ８．０ ０．１ｍｏｌ／ｌ磷酸赫缓冲液中易被解析。起始与平衡缓冲液用ｐｈ８．０ ０．０１ｍｏ］／ｌ磷酸盐缓冲液，洗脱用ｐｈ８．０ ０．１ｍｏｌ／ｌ磷酸赫缓冲液； ｃ．流速的选择根据吸附层析相关资料流速选择１５ｍｌ／ｈ：ｄ．加样量的选择天津科技夫半蛳ｌｊ学位论文蛋白质与吸附剂的比：通常按重量比选，蛋白质／吸附剂＝ｏ，５—１０，本实 验上样量ｌｍｌ，使用磷酸钙凝胶１９。（３）吸附层析结果经ｓｅｐｈａｄｅｘ ｇ一２００初步纯化样品第１峰，上磷酸钙吸附柱层析（见图３－２０１洗脱后出现单一蛋白峰。｛ｊ．６’０．５０．４０．３ ｏ．２０．１０ １０１５ ２０沈脱管数图３．２０磷酸钙凝胶吸附纯化３．４．４ｂ－ｇ提取纯化的回收率与提纯倍数‘７１ ｊ３．４．４．１有关术语（１）总活力指整个样品全部酶活力。它可由酶活力（ｕ／ｍｄ×总体积（ｍ１）或酶活力（ｕ／ｇ）×总重量（ｇ）而求得。 （２）酶活力指酶催化反应的能力，它表示样品中酶的含量，通常用ｕ／ｇ或ｕ／ｍｌ表不。（３）比活力指单位蛋白质所含有的酶活力，这是酶的纯度指标，它可由酶的活力单 位被蛋白质含量（ｍｇ／ｒｄ）所除而求得。 比活力越高表示越纯，即单位蛋白质中酶催化反应的能力越大。但是比 活力仍是个相对指标，它并不说明酶的实际纯度，要了解酶的纯度，可用电 泳等方法测定。（４）回收率指提纯前与提纯后酶的总活力之比，表示提纯过程中酶的损失程度大小，回收率越高，损失越少。（５）提纯倍数（纯化倍数）指提纯前后两者的比活力之比，这是表示提纯过程中纯度提高的程度， 提纯倍数越大，表示该方法纯化效果好。 ３．４．４．２蛋白的测定３结果ｌｓｉ，ｔ论在酶的提取过程中常涉及酶的提纯倍数等问题，因１３一ｇ为可溶性蛋白，所 以测定蛋白的方法选用考马斯亮蓝（；一２５０法。 （１）标准曲线的绘制每次测定样品时，都需同步绘制蛋白质标准曲线，以减少系统误差。目ｌ毒盛０．５８ｏ ０ ２００ ４００６００８００１０００１２００蛋白质浓度（ｕ∥ｍ１）图３—２ｌ １００一１０００ｕｇ／ｍ１蛋白质标准曲线 ｘ：蛋白质浓度ｙ：吸光度标准曲线方程：ｙ＝ｏ．００４９ｘ＋０．０２８３。ｏ．６蕞０．４蓉０．２００２０４０６０８０ｌ ００１２０噩白质浓度（ｕｇ／ｍ１）图３—２２ １０一１００ｕ ｇ／ｍｌ蛋白质标准曲线标准曲线方程：ｙ＝ｏ．００３６ｘ＋０．０３５２３．４．４．３ｘ１蛋白质浓度ｙ：吸光度ｐ—ｇ回收率与提纯倍数表３—４ ｂ—ｇ提取纯化总表１３一ｇ提取纯化的回收率与提纯倍数测定结果见表３．４。理想的纯化方法是既有相当的提纯倍数，又有较高的回收率：或者说既能最大限度地去除杂蛋白，又能尽量保护酶蛋白不受损失，但是，要达到两全其美是不容易的，往往提纯倍数高的方法回收率则较低，反之，回收率高天津科技大学顾ｉ‘学位论文的方‘法其提纯倍数却偏低。工业用酶对纯度的要求较低，但用量大，成本、价格具重要意义，故一般选用回收率高的方法，试剂、医药用酶，需要量少但纯度要求高，采用提纯倍数高的方法为宜。 本实验中因对纯度要求较高，所以回收率偏低。 此外，酶活的损失可能原因一是提取过程除离一心外都未在４。｜ｃ进行，二是 操作过程耗时过长酶活有一定的损失，三是硫酸铵的加入导致蛋白的变性。 ３．４．５提取及纯化物成分的检测 ３．４．５．１电泳方式及凝胶浓度的选择 （１）电泳方式的选择 在非变性ｐａｇｅ中，蛋白质不发生变性，二硫键不会被打开，蛋白质不会 解聚为亚基。ｓｄｓ ｐａｇｅ中，蛋白质解聚为几个亚基，亚基的分子量之和即为 蛋白质的分子量。在变性电泳与非变性电泳之间进行选择时，因缺少梯度发生器因而选择变性电泳。 在连续与不连续电泳间选择时，因不连续电泳有能浓缩样品、分辨率高 的优点而选择变性不连续电泳。 （２）凝胶浓度的选择 对于ｓｄｓ—ｐａｇｅ正确选择凝胶浓度十分重要。如果凝胶浓度过大、孔径太 小，电泳时样品不能进入凝胶。如果凝胶浓度太小、孔径太大，则样晶中各 种蛋白质分子均随缓冲液流向前推进而不能缛以很好的分离。因此不同分子 量的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。 表３－５凝胶浓度与测定分子量范围的关系ｂ．ｇ分子量为２８０ｋｄ，由四个相同的亚基组成，每个亚基分子量为 ７０ｋｄ，因而凝胶浓度选择为１２％。 （３）标准蛋白的选择 因凝胶浓度选择１２％，所以电泳时使用如下组成的中分子量标准蛋白。表３－６中分子量标准蛋白的组成及分子量３．４．５．２电泳图谱分析用培养基配方２培养ｅ．ｃａｌｌ至酶活高峰时停止培养，经提取和纯化的ｐ—ｏ样品进行ｓｄｇ—ｐａｇｅ，电泳图潜如下： １：兔磷酸化酶ｂ ２：牛血清白蛋白 ３：兔肌动蛋白 ４：牛碳酸酐酶 ５：胰蛋白酶抑制荆 ６：鸡蛋氢溶菌酶 ａ：纯化ｂ—ｇ ｂ：粗提ｄ—ｏ糖蛋白染色 ｃ：粗提ｂ—ｇ ｄ：标准蛋白图３．２３电泳图谱 电泳后的凝胶采取了两种染色方法，分别为考马斯亮蓝染色和碱性品红 染色。 耜提物电泳后经考马斯亮蓝染色出现２条带，其中第１条带在９７．４ｋｄ和 ６６．２ｋｄ之间，第２条带在２０ １ｋｄ左右，凝胶经碱性品红染色，表明９７．４ｋｄ 和６６．２ｋｄ之间的条带具有糖链结构。 纯化后样品经考马斯亮兰染色，在９７．４ｋｄ和６６．２ｋｄ之间出现单一条带， 与粗提物第１条电泳带位置～致。 表３－７中分子量标准蛋白质的分子量及相对迁移率天津利技人学硕上学位论文分子量与迁移率的关系方程：ｌｏｇｍｗ＝．１２１５７ｘ＋５．３５２４通过相对迁移率计算，可以得出粗提物两条带的分子量分别为７２ｋｄ和 １９ｋｄ，推测７２ｋｄ谱带为ｂ—ｇ。因为ｂ．ｇ的分子量为２８０ｋｄ，由四个相同 的贬基组成，经ｓｄｓ．ｐａｇｅ ｂ．ｇ会裂解为７０ｋｄ的四个亚基。且凝胶经碱性 品红染色后在考马斯亮兰染色相应的位置出现红色带，说明此物质为糖蛋白， 与资料上的内容相符，基本认定提取物为ｓ．ｇ。４±占论４结论（１）ｅ．ｃｏｌｉ菌数与吸光度值在一定范围内存在线性关系，菌数与ｏｄ值关系曲线 的确定，简化了实验步骤。（２）从ｅ．ｃｏｌｉ在三种配方的培养基中测得的生长曲线褥出：ｅ．ｃｏｌｉ在三种配方培 养基中的生长趋势基本一致，即振荡２ｈ后进入对数生长期，振荡６ｈ达稳定期。 （３）对硝基酚标准曲线方程：ｙ＝０，００５９ｘ０．０１２４。（４）冻融法破壁效果优于酶溶法优于液氮法。（５）培养液中的ｂ—ｇ活性大大高于冻融破壁后的口．ｇ活性，提取ｂ—ｇ无需对 ｅ．ｃｏｌｉ进行破壁。 （６）ｅ．ｃｏｌｉ最适产酶条件为使用液体培养基配方２振荡培养６ｈ。（７）提取路线及葡聚糖凝胶联合吸附层析的纯化路线，成功的提取出了０一ｇ。 １３一ｇ最终提纯倍数１５．３，回收率５．１％。（８）纯化的ｂ—ｇ在ｓｄｓ—ｐａｇｅ中出现７２ｋｄ单一亚基带。４０————奎竖兰！丝盔兰塑！二兰垒堡兰５展望本论文确定了ｅ．ｃｏ］ｉ最佳产ｂ—ｇ培养条件，并对培养液中的ｂ—ｇ进行了提 取纯化和检测。下面还有许多工作要做。 在提取纯化方面，本论文初步探讨了ｂ．ｇ提取纯化工艺，但对韵：多参数没 有进行优化设计，下一步要解决的是减少酶活损失，提高得率的问题。 在理化性质方面，应当运用各种电泳方式进一步分析提取及纯化物，以期 得到关于ｐ—ｇ整体分子量、等电点等更为准确的信息。利用气质联用等实验方 法更多的了解ｂ．ｇ的性质。 在完成理化性质及提纯路线优化的基础上，扩大￡．ｃｏｌｉ培养量，得到大量高活性高纯度的￥一ｇ，完成ｐｇ抗体的制备及分离纯化，制成ｅｃｏｌｉ快速检测 试剂盒是最终的目标。６致谢６致谢本论文是在导师曹小红教授的精心指导下完成的。在实验工作的顺利开展及论文的撰写等方面都得到了恩师的悉心指导和关怀。曹老师严谨的科研态度、 渊博的专业知识和崇高的敬业精神都将使我终身受益。此外，曹老师对我思想 与生活方面的教导与关心，我会永远铭记在心。在此，对曹老师的培育致以最 真诚的谢意！在实验过程中，得到了鲁梅芳、王冬洁、王春玲老师耐心细致的指导，在此表示深深的谢意。研究生梁候明、石世学、李凡、杜冰冰、周强等同学对我论文的完成也给予了很大的帮助，在此表示真诚的感谢。 感谢所有给予我关心和帮助的老师、同学、亲人和朋友，你们的关心与鼓励是我不断前进的动力。灭津科技人学颂士学位论文７参考文献：ｉ：聂凌鸿．微生物污染与食品安全［ｊ］．四川食品与发酵，２００３，３９（２）：５２５，５．［２］潘云娣．食品安全一个世界性的公共卫ｑｉ问题［ｊ］．华南预防医学，２００２，２８（６）：６３—６４．［３］侯为道，张丽，杨梅，食源性疾病的流行因素及检洲与控制进展［ｊ］．预防医学情报杂志，２００３，１９（２）：ｉ１８一１２１．［４］严卫星．关于与食品安全有关的热点问题［ｊ］．中国经贸导刊．２００１，１２：１２—１ ３．［５］任发政，罗云波等．国外食品安全研究和管理的现状［ｊ］．中国农业科技导报２００１，３（６）：２５—２９．［６］朱行．食品安全在美国［ｊ］．世界农业，２００１（２）：３０—３２． ［７］杨海，王靖虹．疯牛病研究进展［ｊ］，医学综述，２００２，８（６）：３５９一ｂ６１． ［８］刘文宗．世纪恶毒一二恶英［ｊ］，食品科技，２００１（３）：６８绍，１９９７，１７（１２）：５７７—５７７．７０．［９］王舰．病原性大肠杆菌０１５７引起的暴发性集体性食物中毒［ｊ］．日术医学介［１０］梁红山．大肠杆菌０１５７：ｈ７［ｊ］．预防医学情报杂志，２００３，１９（２）：１１８—１２１．［１１］任士明．１９９５年６月左治亚州和田纳西州大肠杆菌０１５７：１１７感染的爆发［ｊ］疾病监测，２００３，１９（２）：１１８－ｉ２１． ［１２］张永光．臼蹄疫及其防治［ｊ］．海峡预防医学杂志，２００３，９（１）：２５ ２７．［１３］袁文泽，苏永生．１９９０—２００１年世界口蹄疫流行情况及防治对策［ｊ］．中国动物检疫，２００２，１９（２）：４３－４４．［１４］汤天曙，薛毅．我国食品安全现状和对策［ｊ］．食品工业科 技，２００２，２３（２）：４－８． ［１５］庄英杰，范景利．２７起食物中毒的综合分析［ｊ］，解放军预防医学杂志，１９９８，１６（４）：３１０—３１０。［１６］张肃．１９８５—２０００我围食物中毒情况重点分析［ｊ］．中国食品卫生杂志，２００２１４（５）：２６ ２８．［１７］关怀．新的食源性疾病与食品安全［ｊ］．国外医学：卫生学分册，２００１，２８（１）：１７一１９．［１８］林祥金．欧洲农业的灾难及其教训［ｊ］．经济要参，２００１（５２）：１２～２１． ［１９］陈君石．食品安全的现状与形式［ｊ］．预防医学文献信息，２００３，９（２）：２５４—２５６．［２０］秦贞奎，唐光江．中围进出口食品安全现状与展望［ｊ］．中国食物与营养，２００３（３）：１４—１６，［２１］宋才发．ｗｔｏ规则与中国食品安全保障［ｊ］．西北民族学院学报：哲学社会科７参考文献学版，２００２（６）：４３—４８．［２２］李建科．围际食品安全动态与中困入世后的形势与对策［ｊ］．食品工业科技２００２，２３（１２）．［２３］王勇志．国际食品安全综述摘要［ｊ］．中外食