基本培养基占80%～90%，小牛血清占10%～20%。 按1%体积分数加入双抗贮存液（青霉素+链霉素），使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。 （五）注意事项
1．培养细胞使用的瓶子和饭盒应与提取RNA和培养细菌的瓶子和饭盒严格分开。因为用于处理提取RNA的DEPC水（0.1%焦炭酸二乙酯）是一种致癌剂，并可能影响细胞生长；而培养过细菌的用品也不应与细胞混用。
2．过滤时压力不要太大，以压力数字2为宜，否则细菌易滤过达不到除菌效果，或使滤膜破裂。分装时需根据使用量的多少分装于大小合适的瓶子中（分装量为使用3～5次用完为宜，并且每瓶只能装2/3体积的液体，过多时瓶子易爆或胶塞自喷）。
3．滤器用毕立即刷洗，过蒸馏水，晾干收藏。 （六）实验报告
根据表1-2的实验安排进行实验，实验结果中填写：遇到什么问题？如何解决？实验结果怎样？
（七）思考题
1．为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理？ 2．血清在细胞培养中有何作用？
3．配制培养基时调节pH值的目的是什么？
三、PBS和消化液(胰酶液)的配制
（一）实验目的
熟练掌握PBS平衡盐溶液的配制，了解消化液（胰酶液）的配制方法。 （二）实验原理
PBS液是常见的平衡盐溶液（BSS）之一。PBS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在PBS中可生存几个小时。
胰蛋白酶（胰酸）溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1:125或1:250。本实验室一般用1:250（GRC公司生产）。胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。一般来说浓度大、温度高(勿高于37t)、作用时间长，则对细胞分离能力大。但超过一定程度会损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃时消化能力最强。溶液
中的Ca、Mg和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca、Mg2+的D-Hanks液。当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。
细胞传代使用的胰酶浓度是0.25%或0.2%。用于原代细胞培养消化组织块则为0.1%或0.125%。
（三）仪器、材料和试剂
抽滤泵1套，过滤器1套，高压灭菌锅，量筒，磁力搅拌器，研磨器。
3000mL锥形瓶，25mL、50mL试剂瓶，500mL输液瓶，螺口盖，翻帽塞，pH试纸，孔径0.22μm的微孔滤膜。
NaCl，Na2HPO4，KH2PO4，KCl，酚红，NaHCO3，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl2，D-葡萄糖，MgCl2?6H2O，MgSO4?7H2O，酚红（2%）（配法：称酚红2g，置于研磨器中，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加进该5.6%NaHCO3溶液使最终体积为100mL。瓶装保存，备用）。 （四）实验步骤 配制D-Hanks液
1．按表1-3称取D-Hanks试剂。
2．依次加入上述试剂至800mL蒸馏水中，溶解后定容至1000mL。 3．高压灭菌，10磅10min。 配制Hanks液
1．按表1-2称取Hanks试剂。
2．配制Hanks时，需将CaCl2另溶解于100mL的蒸馏水中。
3．依次加入上述试剂至700mL蒸溜水中，溶解后再与CaCl2溶液一起定容至1000mL。 4．10磅，10min高压灭菌。 配制胰蛋白酶消化液
1．D-Hanks液高压灭菌之后，晾至室温，4℃保存备用。
2．称取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中（夏天时研磨器应放在冰浴中），加入少量D-Hanks液研磨1000次左右，调制成糊状。再放人4℃预冷的适量D-Hanks液中，4℃下磁力搅拌使完全溶解。
3．用NaHCO3干粉将胰酶溶液的pH值调至8.0左右（胰酶作用的最适pH值），并加入0.02%EDTA以协助消化作用。
4．滤过除菌（方法见二、培养基的配制），-20℃冻存。 （五）注意事项
1．BSS的pH值应确定为7.2左右。
2．如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混，则可将100mL的CaCl2与含有其他成分的液体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。这样可以避免高压灭菌后液体变混。
3．胰酶受热易失活，所以尽量避免盛夏配制，并且在配制过程中温度应始终保持在4℃左右。
4．胰酶研磨要充分，否则在过滤时会将较大的颗粒过滤掉，不能达到真正的浓度。 5．胰酶分装时尽量分装成小瓶，并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻
保存时体积会膨胀，而多次使用同一瓶胰酶可能增加污染的机会。尽量缩短胰酶在0℃以上停留的时间，以保持胰酶的消化能力。 （六）实验报告
根据你的实验填表1-3-1
1．D-Hanks液的主要用途是什么？
2．配制胰酶消化液时应注意哪些问题？
3．D-Hanks和Hanks液的成分和配制方法有什么主要区别？ 4．如何估计是否传代和传代的方式？
四、细胞传代培养
（一）实验目的
熟练掌握细胞的传代培养法。 （二）实验原理
传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当
细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。细胞对酶的消化作用反应不一，有的敏感，有的迟钝，适度掌握细胞消化时间和选择适宜的方法很关键。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。 （三）仪器、材料与试剂
CO2培养箱，倒置显微镜，超净台。
培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，培养细胞。
培养基（RPMIl640或DMEM），小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，Hanks液。
（四）实验步骤
1．入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。
2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。
3．超净台台面应整洁，用0.1%新洁尔灭溶液擦净或75%酒精棉球清洁。
4．打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开风机清洁空气，除去臭氧。
5．点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
6．将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7．倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2～3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
8．每个大培养瓶加入1mL胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落人消化液中。
9．加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7～10mL/大瓶，3～5mL/小瓶）制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养
瓶放回CO2培养箱。
10．对悬浮培养细胞，步骤7～9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。 （五）注意事项
1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。
2．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。
3．如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。
（六）实验报告
1．试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？ 2．判断细胞健康的标准是什么？ （七）分析
1．细胞传代培养的目的是什么？
2．贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同？
五、细胞冻存与复苏
（一）实验目的
掌握细胞保存的方法，能独立地进行细胞冻存与复苏操作。 （二）实验原理
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
细胞冻存时向培养基中加入保护剂――终浓度5%～15%的甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。
采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1～-2℃/ min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内（-196℃）。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入40℃热水中迅速解冻。 （三）仪器、材料和试剂 仪器
4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮容器，微量加样器，水浴锅，离心机。
冻存管，离心管，细胞培养用材料，500mL烧杯，胶布，搪瓷杯，75%酒精棉球。 试剂
培养基（RPMIl640或DMEM），小牛血清，0.25%胰蛋白酶溶液，二甲基亚砜（DMSO）或甘油，0.5%台盼蓝染液，液氮。 （四）实验步骤 细胞冻存 1．取待冻存的细胞用胰酶消化（见四、细胞传代培养部分），用培养基将细胞冲洗下来。800r/min离心5min，弃上清收集细胞。如果是悬浮生长的细胞，则可直接离心收集细胞。
2．加入适量冻存液（10%甘油＋90%培养基，或者10%DMSO＋90%培养基）制成细胞悬液。细胞浓度宜大，3×106个/mL左右，并可适量增加小牛血清浓度至20%。
3．细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记（写上细胞种类、时间及冻存条件等）。
4．冻存管在4℃下存放30min，转放-20℃ 1.5～2h，再转入-70℃ 4～12h后即可转移到液氮内（-196℃），注意进行登记。
1．取一搪瓷杯盛上适量自来水加热至40℃左右。 2．从液氮中取出冻存管立即投人40℃水中迅速解冻。 3．取出冻存管，用75%酒精清洁管口，打开。您好，欢迎来到！
会员类型：旗舰版会员
阿仪网旗舰版会员：4年
工商认证【已认证】
最后认证时间：
注册号：**** 【已认证】
法人代表： 【已认证】
企业类型：生产商 【已认证】
注册资金：人民币***万 【已认证】
产品数：9910
当前位置：>>>关于细胞的冻存与复苏的心得
会员类型：旗舰版会员
阿仪网旗舰版会员：4年
工商认证 【已认证】
最后认证时间：
注册号：**** 【已认证】
法人代表： 【已认证】
企业类型：生产商 【已认证】
注册资金：人民币***万 【已认证】
产品数：9910
参观次数：1070995
手机网站：
旗舰版地址：
关于细胞的冻存与复苏的心得
点击次数：1329 发布时间： 17:05:45
&一、 实验目的掌握细胞保存的方法，能独立地进行细胞的冻存与复苏操作。二、实验原理细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到保种的作用。此外，还可以利用细胞冻存的形式购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂&&终浓度5%-15% 的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，在细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用&慢冻快融&的方法能较好的保证细胞的存活。标准冷冻速度为-1~-2℃/min，当温度低于-25℃时加速，到-80℃之后直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入40℃热水中迅速解冻。三、、试剂和材料：4℃冰箱、-70℃冰箱、液氮容器、微量加样器、水浴锅、离心机。材料：冻存管、细胞培养用材料、500ml烧杯、胶布、搪瓷杯、75%酒精棉球。试剂：培养基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液、二甲基亚砜(DMSO)或甘油、0.5%台盼篮染液、液氮。四、实验步骤(一)细胞冻存1、取待冻存的细胞用胰酶消化，用培养基将细胞冲洗下来。800r/min离心5min，弃上清收集细胞。如果是悬浮培养的细胞，可直接离心收集细胞。2、加入适量冻存液(10%甘油+90%培养基，或是10%DMSO+90%培养基)制成细胞悬液。细胞浓度宜大，3*106个/ml左右，并可适量增加小牛血清浓度至20%。3、细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记(注明细胞种类、时间、条件等)。4、冻存管在4℃下存放30min，转放-20℃1.5h~2h，再转入-70℃4~12h后即可转入液氮内(-196℃)，注意进行登记。(二)细胞复苏1、取一搪瓷杯盛上适量自来水加热至40℃左右。2、从液氮中取出冻存管立即投入40℃水中迅速解冻。3、取出冻存管，用75%酒精清洁管口，打开。4、离心去上清收集细胞，用无血清培养基洗1次，加入3ml新鲜培养基，于小培养瓶中培养。5、每日观察细胞生长情况，如果死细胞较多，复苏次日应换液。待细胞长满后进行传代培养。五、注意事项1、在使用含有DMSO的冻存液时，因为DMSO在室温状态易损伤细胞，所以在细胞加入冻存液后应尽快放入4℃环境中。2、准确记录细胞的种类、冻存时间、冻存液的品种和冻存者信息。小结：这里总结了细胞的冻存复苏操作技术，希望对大家有用。如有需要可以与我们联系。
请输入您的咨询或建议详细信息君，已阅读到文档的结尾了呢~~
细胞色素C与TRPV通道开通的关系通道,细胞,帮助,TRPV,细胞色素C,细胞色素c,细胞色素
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
细胞色素C与TRPV通道开通的关系
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口