高通量测序数据分析_中国百科网
高通量测序数据分析
    
研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差。 依靠后期强大的生物信息学分析能力，对照一个参比基因组(reference genome)高通量测序技术可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence)，2007年van...
原理示意图 ? 一、高通量测序的应用 高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差。 依靠后期强大的生物信息学分析能力，对照一个参比基因组(reference genome)高通量测序技术可以非常轻松完成...
?novo)组装、转录组测序、甲基化检测。 ★?高效的样本制备 ??? 高速自动化工作流程以及低样品量要求，可在不到一周的时间内生成数据。 ? 技术应用 ??转录分析 l?mRNA测序(RNA-Seq) ?一次mRNA测序实验即能快速生成以完整...
????? 纳米孔的稳定性和可靠性。 ? ???? 在过去的几年里，第二代测序技术为基因研究做出了杰出的贡献，但是他们普遍存在长度和质量上的缺陷。为实验设计，数据分析和应用带来了不便。第三代测序技术有望克服以上的缺点。测序费用的降低使得过去...
确保了每个序列的高质量、高读长，又兼顾了高通量测序的特性。应用广泛而稳定，在基因组de?novo测序、基因组重测序、目标基因捕获测序、宏基因组测序和RNA测序分析等研究领域发表了上千篇学术论文。 ??获得更全面的数据 每次运行能产生100...
???? 第二代高通量测序仪实现了较廉价和快速的DNA测序方法，但是它们有一个共同的缺点即读出序列（reads）太短，大约在几十个bp到几百个bp。与生物的染色体长度相比，这样长度的reads给下一步的装配工作带来麻烦。看似种类繁多的...
Nature Biotechnology 2009年2月封面文章: 基于安捷伦寡核苷酸序列合成技术的液相序列捕获系统 C 高通量平行靶向测序的最佳解决方案 来自美国麻省理工学院和哈佛大学Broad研究院的研究人员，利用安捷伦...
1、PCR 产物测序时出现重叠峰 问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序 结果移码） 解决方法：将PCR 产物克隆到质粒（如T 载体）中挑单克隆测序，或将PCR 产物进行PAGE 纯化...
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高通量测序的十年：从科研进入临床
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高通量测序本身还有很多局限性，一次测序需要多个样本混合、成本还是相对昂贵、数据分析具有挑战性、操作环节多。企业界、科学界都在解决测序仪的稳定性、样本处理的便捷性、一体化数据分析等等问题。
　　高通量测序的推出背景：
　　2004年全球多个国家共计预算30亿美金的人类基因组测序完成以后，发现单单完成一个人的基因组序列还远远不足以理解人类自身及疾病的机理。由于有了已经完成的人类基因组当做参考基因组，采用廉价、快速的方法对多个样本、群体、病种基因组的比对测序就能提供大量有价值的科研和临床信息。这就要求测序价格足够低、速度足够快，然而对测序结果是否易于拼接、组装基因组则没有明确需求。于是，美国国家基因组研究院(NHGRI)提出了把全基因组测序降至1000美金的研究规划，从而引领科学界、企业界大力发展测序技术。
　　高通量测序的十年：
　　2005年，454公司首先推出了二代测序仪;2006年，Solexa推出了Genome Analyzer，2007年年初Illumina收购了Solexa公司，在随后的几年陆续推出了Hiseq2000、MiSeq、Hiseq2500、MiseqDx、NextSeq 500测序仪，占据了高通量测序的大部分市场。ABI也在2007年推出的是SOLiD测序平台，随后收购了454测序仪发明者创立的Ion Torrent，转而大力推广PGM和Ion Proton平台。2014年，也就是高通量测序技术发展的第十年，illumina公司的Hiseq X平台已经实现了1000美金一个人类基因组测序的目标。虽然这个价格的实现，需要在保证未来数年充足机时的情况下才能完成，但也比十年前的30亿美金降低了300万倍。除此以外，还有好多公司开发了第三代测序仪，比如Pacific Biosciences的PacBio RS测序仪，DNA模板无需二代测序常用的PCR扩增的方法，就可以实现长读长、实时的测序;Oxford Nanopore MinION测序仪只有USB存储器那么大等等。
　　2013年9月，illumina公司的MiseqDx平台，首次通过了美国FDA的技术认证，作为开放平台和囊纤维化的试剂产品准许进入临床，标志着经过10年的发展，高通量测序技术已从纯科学研究的平台进入临床诊断领域。
　　各代测序的应用范围：
　　一代测序(Sanger)适合单一片段，长度小于800bp的精准测序;二代适合快速、低价测量海量数据，每次测序能产生数百、数千万条序列，但读长不超过500而以PacBio为代表的三代测序更适合单分子测序，最长可以到几十K的读长，但测序质量略低。所以目前还没有哪一代测序技术可以完全取代同类技术，并不能简单的通过名字来判断技术先进性，重要的还是各个平台都有各自最适合的应用领域。
　　高通量测序应用范围：
　　无需BAC文库构建就可以进行全基因组鸟枪法冲测序;数以千万计的序列同时测序;测序结果无需通过毛细管电泳获得等等特点决定了高通量测序仪具有广阔的应用范围：基因组从头测序、基因组重测序、目标片段测序、数字化基因表达谱、小RNA测序、甲基化测序、蛋白质DNA相互作用测序等等。本文主要就高通量测序的几个应用在临床诊断领域的开展做一个简单介绍。
　　高通量测序的临床应用：
　　1.染色体疾病检测
　　2008年香港中文大学的卢煜明和斯坦福的Stephen Quake先后发表文章提出通过检测母体外周血中的游离DNA，可以准确的判断该孕妇胎儿的染色体非整倍体，该技术无需常规的羊膜腔穿刺、绒毛膜穿刺等创伤性染色体疾病检测技术，故常被简称为无创产前检测。
　　无创染色体检测的技术核心为拷贝数变异的原理。测序所得的序列通过生物信息算法，把所有序列比对到人类参考基因组。通过计数每一个染色体的唯一对应的序列条数来获取全染色体拷贝数变异情况。如果其中有一个染色体增加一条或缺少一条，则该染色体的拷贝数会显著增加或减少。
　　在当前常见的无创染色体非整倍体检测中，主要针对T21、T18、T13这三个染色体三体综合征。从国内外各家公司公布的数字来看，准确率、阳性预测值都可以达到99%。相对血清唐氏筛查技术，无创技术大大提高了准确率，降低了假阳性率。从而推动产前检测技术极大的发展，也帮助高通量测序真正的进入了临床转化应用阶段。在染色体非整倍体疾病中，性染色体异常(XXX、XO、XXY)等也颇为常见，由于X染色体(155mb)相对Y染色体(60mb)要大很多，血浆游离DNA中母体的DNA含量占50~90%，从而造成无创检测性染色体异常 具有一定的难度，准确率基本在90%左右。
　　除了染色体非整倍体以外，染色体病还有微缺失微重复，是指染色体上有局部片段缺失或出现重复片段。常见的表现为染色体上的部分三体、部分单体，比如猫叫综合征、迪格奥尔格综合征(Digeorge) 、Wolf-Hirschhorn syndrome、Prader-Willi syndrome等等。自从高通量测序技术应用于无创产前检测，业界也开始使用该技术来检测微缺失微重复。由于微缺失微重复染色体改变相对较小，需要较深的测序深度，才能较准确的判断染色体变异情况。
　　以上提到的都是无创的方式去检测染色体非整倍及微缺失微重复。对于诊断筛查成年人、婴幼儿、流产组织等染色体变异情况，利用高通量测序也是一种很好的选择，相对于传统的Array CGH，高通量测序技术更准确、速度更快、检测分辨率更高，需要的起始样本量更低，只要几纳克。
　　产前检测领域具有很大的特殊性，每一个结果都会影响一个还未出生的小生命，对于检测的准确率相对其他检测技术要求要高很多。不管是假阴性还是假阳性，都要求尽可能的低，否则会引起很多临床纠纷。而且由于要给后续的产前诊断技术正确尽可能多的时间，所以就要求检测周期尽可能短。无创染色体检测需要每一个样本有一定的测序量，但并不是简单的说测序越深结果就一定越好，需要保证每批测序的稳定性，就对实验室流程控制、试剂盒本身的质量控制、数据分析的校正都提出了很高的要求。如果没有很好的控制，哪怕一台测序仪就跑一个样本，几十倍于常规的测序通量，也不一定就能准确判断结果阴阳性。
　　2.基因突变检测
　　不同于一代测序针对单一片段的测序检测基因突变，高通量测序往往可以针对一个基因多个位点、多个基因或全外显子突变的快速检测。在这类检测中，首先通过PCR或者探针捕获的方式富集待检区域的DNA，然后通过高通量测序仪进行测序。高通量测序的准确率不如一代测序，所以为了得到准确的结果，每一个碱基位置都需要至少100条以上的序列结果。由于一个或多个基因位点组合、哪怕是全基因组外显子组合，也就70mb左右的DNA区域，实际工作中很容易实现100X以上的测序深度，往往都可以达到1000X以上。
　　表皮生长因子受体(EGFR)基因突变检测为当前最常用的单基因突变检测，检测结果可用于辅助临床医生筛选可受益于易瑞沙、特罗凯和凯美纳等靶向药物的非小细胞肺癌患者。目前常用的方法为荧光定量技术，需要做多个反应。根据Ensembl的数据库，EGFR最长的编码形式有28个外显子，编码区共有9821个碱基，不管是一代测序还是荧光定量都很难一次把EGFR全部位点都检测到。而针对10K的区域，对于高通量测序来说只需完成10mb测序量(1000X)就可以精确检测所有位点的信息。目前市场上主流的高通量测序仪一次测序都可以完成10G~1.8T，也就说可以一次开机至少可以完成1000个以上病人的样本。
　　对于单基因的检测，除非这个基因很长，或者具有大片段的缺失、重复，否则用高通量测序来做单基因检测有点大材小用，现实临床检验工作中要短时间聚齐1000个病人的样本也颇有难度，样本太少的话单个样本的平摊成本就会剧增。因此对于基因突变检测，高通量测序技术更适合多基因组合、甚至全外显子捕获等测序方式。
　　3.微生物、病毒、细菌鉴定
　　采用PCR方式来鉴定微生物、病毒、细菌非常快捷、廉价，但是需要利用已知物种的DNA序列设计PCR引物探针，对于未知物种则一筹莫展;一代测序的方法是可以鉴定未知物种，但是样本要求是经过分离培养，DNA背景单一，混合多个物种的DNA样本，一代测序会产生大量杂峰而无法正常得出测序结果。而高通量测序无需做任何培养、分离、也无需事先知晓物种，只要把待测样本的基因组DNA构建测序文库，测序产生数十万~数千万条不同的DNA序列，即可以轻易知道待测样本中有何种微生物、病毒、细菌、每一个物种的比例、碱基是否有突变、是否为新物种。
　　2009年H1N1病毒爆发感染时，有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭，然而并不知道具体的死因。科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中，含有0.85%的序列来自于H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发现了该病人的真正死因。在这样高人类基因组干扰的背景下，目前其他技术都难以快速发现致病病毒序列、以及分子分型。
　　结核杆菌感染现在越来越严重，由于结核杆菌生长缓慢，发现结核杆菌感染及分子分型往往需要数月的时间。而结核杆菌的基因组只有4.4mb，利用高通量测序仪可以非常早期发现结核杆菌感染，同时还可轻易测得结核杆菌基因组的大部分区域，便于选择合适的敏感药物，以及确定是否为全新分子分型。
　　肠道微生态为目前热门的研究领域，在肠道内微生物种类众多，各菌群的种类和比例会影响人体的建库、代谢情况。高通量测序仪也是该领域的唯一选择。
　　4.肿瘤相关检测
　　除了前述的肿瘤基因突变检测以外，在血浆中寻找肿瘤组织脱落的DNA片段，对早期发现肿瘤、监控术后复发等领域被寄予厚望。血浆中大部分为正常组织的脱落细胞DNA，如果有肿瘤发生，异常增生的细胞脱落外周血循环，降解成低丰度DNA片段，由于含量低、碎片化DNA，基因芯片和PCR都不能正常检测。在无创产前检测的技术流程上做分析优化，高通量测序技术可精确检测游离DNA的每一个碱基，从而发现是否有肿瘤突变基因存在。美国霍普金斯大学也曾提出，首先对手术肿瘤组织进行全基因组深度测序，发现个体化的肿瘤基因组融合片段，随后在外周血中利用实时荧光PCR方法检测该个体化基因组融合片段的丰度，如果丰度提高则提示肿瘤有转移、复发的可能。
　　十年来，高通量测序慢慢从实验室进入了临床检验，展现了蓬勃的生机及想象空间，未来肯定还有很多新的检测项目有待开发。10年来，高通量测序的单碱基成本已经降低了数百倍，也许在不久的将来，每一个新生儿都会有自己的基因组序列。海量数据的产生，也会反过来帮助近几年遭遇瓶颈的药物研发机构，研发更多的个体化药物。
　　高通量测序本身还有很多局限性，一次测序需要多个样本混合、成本还是相对昂贵、数据分析具有挑战性、操作环节多。企业界、科学界都在解决测序仪的稳定性、样本处理的便捷性、一体化数据分析等等问题。就像二代测序技术无法取代一代测序一样，高通量测序技术也无法取代PCR、FISH等其他类型的分子诊断技术。高通量测序技术会成为未来分子诊断领域的重要组成部分，大大推动技术前进。
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& 新一代高通量测序技术_检验医学发展的挑战与机遇
新一代高通量测序技术_检验医学发展的挑战与机遇
基因突变以及碱基修饰等可以导致相关疾病的发生发展。个体的基因型也影响个人罹患
相关疾病的风险和药物代谢率。随着数据的积累,越来越多与疾病相关的基因突变被发现,DNA 测序在疾病预测、诊断、个体化用药等方面显得日益重要。测序技术在短短的数十年间,取得了惊人的进步,从Sanger 法为代表的第一代测序技术发展到了第三代高通量测序技术。
分子诊断与治疗杂志　2011年11月 第3卷 第6期　J
November 2011, Vol. 3
·365·
被移除，避免DNA修饰延误延伸时间。该方法不需事先对待测DNA片段进行克隆扩增，而且读长有望达到1000 bp，一天可以产生4 Gb的数据。
1.3.7 Multiplex polony technology 由G Church 在
，利用该技术可2003年首先提出这一测序技术[27，
体非整倍体的快速准确检测，如21-三体、18-三体，并有望对其它染色体异常进行检测。这一新方法的应用可以避免传统穿刺法对母体和胎儿造成的损伤风险。
2.2 病原生物学检测
以往病原生物学的检测主要依赖形态特征、代谢特性、组成成分以及机体反应性抗体等途径进行鉴别，操作步骤往往比较繁琐、耗时。当某些病原体的变异或新病原体的出现时，这些传统的方法往往表现得很局限。高通量测序技术的出现以及生物信息学的发展，尤其是相关软件的开发应用，可以对大量的测序读长进行比对、拼接、组装，直接鉴定和评估病原耐药等机制。病原体不需要在检测前进体遗传演化、
行培养分群（珠），即可直接测序鉴别，例如第三代测序技术，无需扩增即可进行单分子的测序，灵敏度非常高。2011年5月德国发生了大肠杆菌引起的疾病爆发，共有3000多人感染，另外在欧洲和北美以及韩国等12多个国家也有类似病例报道，主要是旅德人员，造成了社会恐慌。在不知病原体为何种类型的前提下，当地医疗机构利用Ion Torrent Personal Genome Machine以及Illumina HiSeq platform测序系统对病原体进行了紧急基因组测序分析，在不到10天时间内即完成了测序工作，对病原体进行了详细的毒力、耐药和遗传进化分析，最后发现该病原体是Shiga毒素E.coli O104:H4株。高通量的测序系统的应用，使得卫生部门能尽早掌握病原体的致病机制并及时地制定出诊疗方案，控制疫情蔓延[25]。2.3 个体基因组体检
任意两个不相关的人基因组序列有99.9%是一致的，只有0.1%的序列有差异，正是这些差异造成个体罹患各种疾病的不同风险和对药物的不同反应。发现这些与常见疾病相关的DNA序列上的多态位点，是了解引起人类疾病复杂原因的重要途径之一。人类单个核苷酸多态性以及人类基因组单体型图计划的不断完善以及相关临床意义的积累，使得个体基因组测序即基因体检显得必要。临床医生可以借助相关分析软件浏览全基因组图谱，了解患者的整体遗传信息，为预防和诊疗提供指导性意见，例如目前比较成熟的基因检测如CYP2C19、ALDH2、BRCA1、MTHFR等，可以很好地指导临床用药。迄今为止，已有上百种基因位点检测进入临床，限于条件限制，即使在比较大的临床检验中心，一般还停留在用Sanger
以对几个数量级的样本同时测序。代表测序系统有Danaher Motion Polonator model G.007，一次运行时间为2.5天，每个模块可以产生135 Gb的数据，该平台可以耦合200个模块，在5天时间内可以收集100个二倍体基因组，30倍的覆盖率，在1E-5精确度下确保98%的覆盖。由于成本下降，对于个人基因组测序，有望把价格降低到1000美元。
2 新一代高通量测序技术对检验医学发展的挑战与机遇
人类基因组计划完成后，“功能基因组学”、“蛋白质组学”、“表观遗传学”等新兴学科也相继涌现，人类最近提出的系统生对疾病的理解越来越全面和深入，
物学概念，表明疾病的复杂性。因此对疾病和健康状况的实验室检测和评估，也应该是全方位的，不能仅仅停留在形态、细胞成分、蛋白质水平等。近几十年，核酸测序技术的迅猛发展，特别是各种成熟测序平台的推出，给检验医学发展带来前所未有的契机，它具有灵敏、精确度高等特点。随着第二代高通量技术的成熟以及第三代高通量技术的兴起，测序技术可以渗透到传统检验方法难以触及的深度和广度。价廉、快速、超大信息量的测序技术越来越为临床实验室所接受，尤其是各类高通量的测序服务价格平民化，检验医学无疑将会迎来另一片天空。2.1 遗传病的诊断
一般而言，遗传性疾病分为以下几类：家系传递的基因遗传疾病、染色体数目或区段异常、线粒体基因和核基因组序列缺失或插入以及点突变等。这些遗传病的一个共同的特点是特定位点DNA序列发生了变异或缺失。对于多病种、多位点的评估，高通其用量测序技术将会显示出它强大的优势。另外，于无创性产前诊断，对胎儿进行靶基因扫描，能更加胎儿的精细地评估胎儿的健康状况[29]。一般而言，基因组DNA以短片段形式存在于母体的血液循环中，Sehnert等[30]人直接从母体外周血分离血浆提取DNA，利用高通量测序技术对胎儿DNA片段进行测序，并通过生物信息技术分析数据，实现对胎儿染色
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zhaoyi@ ...(CCD) 新一代高通量测序技术 高通量测序技术带来的挑战和机遇 Company: ...学带来了新的机遇和挑战.有效地对测序数据进行针对...新一代高通量测序技术得到了突飞猛 进的发展,在此...这些差异一般可以用一些统计 假设检验方法检测,但这种...高通量测序技术的最新研究进展_刘英华_基础医学_医药...随着新一代测序技术的发展,高通量测序技术的 应用...它为 现代生命科学的研究提供了前所未有的机遇 。 ...发展起来的高通量测序技术无论 在成本还是效率上.都对传统测序提出了巨大的挑战...进而为传统生物学以及医学研究开辟新的视角。与此同时,随着各大测序平台的不断...? 269? 述评 新一代高通量测序技术及其临床应用...术平台进行介绍, 并对其在临床医学的应用前景进行...它必将成为临床常规检验技术, 并被不断普及, 在临床...发展高峰论坛”上,形成了共识:新 一代基因测序技术的发展给我国带来前所未有的 机遇与挑战,国内企业应抓住这一 重大机遇,以期实现生物医学及其产业的跨越式 发展...高通量测序_基础医学_医药卫生_专业资料。高通量测序名词解释什么是高通量测序? 高通量测序技术(High-throughput sequencing,HTS)是对传统 Sanger 测序(称 为一代测...关注微信公众号精彩内容天天送
& 技术专栏 & 正文
肿瘤靶向治疗基因突变高通量测序检测的问题与思考
核心提示：随着个体化医学的发展和&精准医学&概念的提出，肿瘤靶向治疗发展迅速，临床研究逐渐发现并证实更多与靶向治疗相关的基因突变。……作者：张瑞，李金明
单位：北京医院　卫生部临床检验中心
随着个体化医学的发展和&精准医学&概念的提出，肿瘤靶向治疗发展迅速，临床研究逐渐发现并证实更多与靶向治疗相关的基因突变。
肿瘤靶向治疗依赖于基因突变检测，传统的基因突变检测方法，如Sanger测序、焦磷酸测序和实时荧光PCR等通常对单个基因或者单个基因的部分外显子的突变进行检测，如果对多个基因进行检测，需要更多的样本量、更长的检测时间以及更大的工作量。而新一代测序技术(NGS)采用大规模平行测序(MPS)，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA片段进行测序，因此可实现在较低的成本下，一次对多至上百个肿瘤相关基因、全外显子以及全基因组进行检测，而且需要的样本量并不增加。因其在通量、成本和效率方面的优势，高通量测序在肿瘤靶向治疗基因突变检测展现了其广阔的应用前景。
2015年初，国家卫生和计划生育委员会批准了26家肿瘤诊断与治疗高通量测序技术应用试点单位，表明了我国开始规范化的肿瘤高通量测序检测。同时，在现阶段临床实验室对肿瘤高通量测序检测也存在很多的问题。例如，实验室应选择哪些基因进行检测？另外，我国尚没有国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准的肿瘤靶向治疗基因突变检测NGS试剂，因此临床实验室所使用的试剂均为实验室自配试剂(LDTs)。
那么，肿瘤基因突变检测的NGS自配试剂应当如何建立并使用？应当如何进行性能评价？在检测过程中，如何进行室内质量控制？NGS在进行多基因检测时，报告多种突变，临床实验室对于检测的突变结果应当如何向临床进行报告和解释？现就这些问题探讨如下。
一、检测基因选择的一般原则
肿瘤靶向治疗，是药物作用于肿瘤细胞特异性的靶点，例如与信号通路有关的受体、激酶以及其他蛋白，从而特异性杀伤或抑制肿瘤细胞。而基因的突变导致编码蛋白的结构和功能发生改变，从而对靶向治疗的应答效果不同。
目前，临床实验室往往困惑的是选择检测哪些基因？美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)认为，对于疾病相关的多基因检测，没有临床意义的基因不能纳入到检测当中[1]。但在实际应用中，有无临床意义该如何界定？除国内外指南中明确的基因外，处于临床试验阶段的、文献报道的、甚至广义上的信号通路中明确的驱动基因是否是有临床意义的呢？
美国病理学家协会(CAP)对19家提供肿瘤NGS检测的实验室进行调查，共涉及611个检测基因，有393个基因仅有1个或2个实验室提供检测，而且这部分基因突变极其罕见。3个实验室均检测的基因有54个，4个实验室都检测的基因有43个，没有一个基因是所有实验室都检测的[2]。当然这与检测肿瘤的类型、实验室的检测目的不同也有关系，但同时也反映了肿瘤相关基因检测的复杂性。
美国FDA在2014年10月对临床实验室改进修正案(CLIA)监管的实验室采用NGS进行肿瘤或遗传检测的临床有效性提出质疑，并试图对LDTs进行有限监管，认为检测指标应当进行临床有效性的评估[3,4]。但很多学者对此反对，认为临床有效性的评估时间漫长，而且仅限制在已明确临床意义的基因，会影响对新指标发现和科学研究的进步[5]。
在目前阶段，可将基因分为以下4种情况：(1)靶向治疗药物伴随诊断相关的基因；(2)写入国内外诊疗指南，如美国国立综合癌症网络(NCCN)的基因，包括处于Ⅱ期和Ⅲ期药物临床试验的基因；(3)临床意义不太明确，但是已有权威文献报道的基因；(4)临床意义完全不明确。在选择检测基因时，建议优先选择前两种情况的基因，对临床意义不太明确和完全不明确的基因，不建议进行检测。如果一定要进行检测，需与临床医生沟通是否有检测的必要，经过患者知情同意，而且在报告结果时注明仅供研究使用。
二、LDTs的建立和性能评价
我国以往临床实验室大多使用CFDA批准的试剂，临床实验室很少使用LDTs。因此，很多实验室对LDTs的概念比较模糊，通常认为只有实验室自己建立的检测方法属于LDTs。实际上LDTs有3种情况：(1)实验室通过购买试剂原材料，如引物、探针、扩增缓冲液、酶等，进行片段化、文库建立、测序并建立生物信息学分析系统。(2)未经CFDA批准的商品试剂盒。即试剂、生物信息学分析完全采用商品化试剂，但试剂没有经过CFDA批准。(3)实验室使用CFDA批准的商品试剂盒，但是对其中的组分或操作进行改变。由于CFDA尚未批准相关试剂，目前我国肿瘤NGS检测LDTs只有前两种情况。
1．LDTs的建立：
目前国内使用的NGS仪器平台主要为Illumina Hiseq和Thermo Fisher Ion PGM为代表的测序仪，使用的基因富集方法有杂交捕获和多重PCR。几乎所有实验室都采用肿瘤相关的多基因检测，全外显子组测序或全基因组测序的临床应用很少。
多基因检测分为两种类型。一种是肿瘤特异的多基因检测，例如非小细胞肺癌、结直肠癌、胃肠道间质瘤、黑色素瘤、遗传性乳腺癌、遗传性视网膜母细胞瘤等特异的肿瘤多基因检测。这种方式更容易进行结果的解释，但是检测流程相对复杂，因为需要根据不同的肿瘤对样本进行分类，而且需使用不同的试剂进行检测。另一种是临床实验室提供一组完整的多基因检测，但不按照肿瘤进行区分，即所有的患者都接受相同的一组基因检测。这种方式检测流程简单，而且只需一种检测试剂，在进行LDTs建立和性能评价时也只需对一种检测试剂进行，而且对NGS而言，100个基因和50个基因相比，检测成本不呈2倍增加，检测时间也接近。但检测结果中会出现目前没有明确临床意义的一些基因突变，患者也可能会接受一些没有必要的基因检测。
无论使用商品化的试剂还是实验室完全自配的试剂，目前都属于LDTs，而LDTs的建立需有严格的试剂配制和使用标准操作程序(SOP)，不能随意改变。NGS检测通常包括核酸提取、片段化、文库制备、加入标签、混样、测序、生物信息学分析和结果报告等步骤，对所有试剂原料的来源、试剂配制的过程、基因检测的区域、软件及版本、对照品等均需详细说明，以及使用试剂进行检测的步骤，均需有试剂使用说明书或SOP，并且每次检测都按照SOP来进行。在NGS检测中，需建立测序的质量标准，且所有的性能指标均在相同的测序质量标准下进行评价。重要的质量标准有：最低测序深度(minimum coverage)、平均测序深度(average coverage)、测序均一性(uniformity)、符合要求质量值的碱基百分比(如Q20百分比)、比对至靶向区域的读长(reads)百分比[6]。另外，GC偏倚、链偏倚等也需注意。临床实验室需建立自己的质量标准，并在每一批的检测过程中始终监测并记录，不符合质量标准的结果为检测失败，并在SOP中建立检测失败的进一步处理方法。一旦建立质量标准，临床实验室在所有的检测过程均需在此条件下进行，不得随意改变。例如实验室在建立LDTs和性能评价时，要求的最低测序深度为500倍，基于此质量标准，检测下限(检测突变等位基因百分比)为5%，那么在临床检测中，最低测序深度为500倍的结果为有效结果，如果怀疑临床样本中有低于5%的突变，也不得随意增加测序深度。可在SOP中，设立重新采集样本或者采用其他更敏感方法重复检测的程序。
2．LDTs的性能评价：
实验室往往困惑的是，肿瘤NGS检测的基因和突变位点非常多，而且由于流程复杂、检测成本高等问题，如何对每个检测基因进行性能评价？肿瘤NGS性能评价需包括哪些性能指标？这些性能指标在肿瘤NGS中代表什么含义？如何评价？性能评价最低应当使用多少样本？
首先，临床实验室无法对NGS检测的所有基因和突变位点进行评价，建议评价时可以从不同的突变类型(单核苷酸变异、缺失、拷贝数变异和结构变异)和临床意义明确的常见基因两个方面进行[7,8]。也就是说，一方面证明NGS对各种不同突变类型的检测能力，另一方面证明对重要常见基因的检测能力。
其次，如果临床实验室可接受多个样本类型，那么对每种样本类型均需分别进行评价，特别是甲醛固定石蜡包埋(FFPE)样本，由于其制备过程中DNA有可能存在降解或交联，会影响NGS检测，因此需要更多的样本进行性能评价。
再次，NGS检测项目、检测基因以及检测突变类型等均有不同，难以统一规定实验室性能评价的最低样本数。实验室可根据检测的基因数量、检测过程的复杂程度和所使用的检测试剂平台的成熟程度自行决定。
应该说，尽管NGS有其特殊性，但是其性能评价的指标与临床检验的其他项目并无不同，包括精密度、准确性、检测下限以及检测范围等。精密度指同一样本在多次检测中结果的一致程度。评价时，每种类型的变异最少需要3份阳性临床样本(最理想的样本是突变百分比接近检测下限)，可同一批重复检测3次(批内)，不同批重复检测3次，在不同天，由2名不同操作人员进行(批间)。需要强调的是，每份有独立标签的样本，为1份重复样本，而不是3份分别提取的样本，加入同一标签进行检测。对准确性的评价可通过两部分进行。一是通过检测已知序列的人基因组DNA，来评价测序本身的准确性。如果为疾病相关的多基因或全外显子测序，可仅评价靶向区域的测序结果。测序的准确性可通过碱基的正确率来表示；二是通过将NGS与另一方法同时检测临床样本来评价，比较NGS与另一方法之间结果的差异，不一致的结果再用第三种方法确认，通过计算阳性符合率和阴性符合率来评价定性测定的准确度。推荐采用Sanger测序法(金标准)作为比较的方法，突变百分比低的样本可以采用其他方法验证。其他经过性能验证的检测方法也可以作为比较的方法。检测下限指可被重复检测出突变等位基因百分比的最低浓度水平。可采用已知突变等位基因百分比的样本与另一基因组DNA混合稀释来进行评价。可报告范围指，测序质量值达到要求的基因区域，可通过对多份临床样本以及细胞系提取的人基因组DNA进行检测，评价不同的靶向基因区域测序质量值是否达到要求[9]。
此外，临床实验室应当将性能评价看作一个连续的、不断完善的过程，在起始阶段，性能评价的样本例数可能较少、样本突变也无法覆盖所有基因区域，但是在检测过程中，可逐步增加性能评价的内容。例如，起初检测下限的评价，仅能通过混合基因组DNA完成，但以后可通过突变百分比低的临床样本来补充验证。重要的是，临床检测过程中的任何改变，例如仪器更换、样本类型改变、试剂改变、软件更新或者其他变更，均需重新进行评价，以证明试剂性能未发生改变。重新评价的程度取决于改变的程度。例如实验室更换了新的试剂批号，只需重复检测以往的样本，并比较质量指标和检测结果，与以往相同即可。如增加新的检测基因，则需要进行更为全面的评价。如实验室对软件进行更新，应当记录软件更新的内容，以及新的版本号，此时仅需对数据分析部分进行评价。
三、质量保证
1．室内质量控制和室间质量评价：
采用已知阴性和弱阳性质控品进行室内质量控制(IQC)是保证检测质量的关键环节，其监控的是实验室测定的最重要的性能指标即重复性，并决定了当批实验测定是否有效，报告能否发出，是对实验室测定的即时性评价。
在肿瘤NGS检测中，同样如此。在NGS中，阴性质控品不是指突变阴性的样本，而是采用无模板对照(NTC)作为阴性质控品，阴性质控品需包含在所有的扩增步骤中，以证实在样本和试剂中没有核酸的污染[8]。
此外，每批检测中，需使用阳性质控品。阳性质控品中包括至少一个已知突变位点，最好变异百分比接近检测下限，以证实低百分比的突变可在每批次中检出。质控样本无需在每批检测中包括所有突变类型，只需加入一个已知突变位点的质控品。但是，实验室最好有多个突变的质控品，并在日常检测中轮流使用。质控样本可以采用人基因组DNA或者其他合成的带有突变的基因组DNA(但不建议采用质粒)。但是这种质控品不能监测提取过程。临床样本当然是最理想的质控品，但是样本来源有限，很难长期使用。
实验室常规检测的性能指标除了重复性外，另一个重要的指标是准确性，或不同实验室间结果的可比性。可通过室间质量评价(EQA)或实验室间比对来完成。肿瘤靶向治疗涉及的基因位点较多，EQA往往难以覆盖所有的情况，而且为保证EQA样本的来源和重复性，EQA组织者可能采用细胞系或人基因组DNA作为评价样本，临床实验室可通过临床样本的实验室间比对，来作为补充。
2．结果报告和解释：
建议报告检测范围，即所有可检测的基因。报告中要清晰地说明所有阳性结果，推荐使用人类基因组变异学会(HGVS)的标准格式来报告基因突变。
由于基因突变有的没有临床意义，或者临床证据不足，因此美国ACMG和美国临床和实验室标准委员会(CLSI)等均对基因突变给出分类[6,10]，ACMG将基因突变分为致病性的、可能致病的、良性的、可能良性的以及临床意义不确定等类型[10]。CLSI也根据突变序列是否被报道、是否公认与疾病相关等将突变分为6类[6]。
总的来说，在肿瘤靶向治疗基因突变NGS检测中，结果可分为4个部分进行解释：(1)靶向治疗药物伴随诊断相关的基因突变。在解释时注明证据的来源，明确其药物及临床意义；(2)写入国内外诊疗指南，如NCCN的基因，包括处于Ⅱ期和Ⅲ期药物临床试验的基因突变。解释时注明证据的来源，明确其药物及临床意义、临床试验分期、开展的组织；(3)临床意义不太明确，但是已有权威文献报道的基因突变。解释时注明来源的文献或PMID号，说明其相关药物及临床意义，并注明仅供研究使用；(4)临床意义完全不明确的突变。
同一基因，有的突变临床意义非常明确，但也同样会出现未报道过的，或者临床意义不明确的突变类型。实验室需明确指出目前尚不清楚该突变其临床意义，报告的结果仅供研究使用。如果体细胞变异和种系变异同时存在，应分别进行报告和解释。需对检测范围、检测下限等进行说明，并对检测的局限性，如哪些区域缺乏足够的覆盖深度，可能导致突变漏检以及对结果可能有影响的因素进行说明。
目前来说结果的解释是非常复杂的。在国外，有的临床实验室在生物信息学分析的部分，包含了临床意义的解读，而且定期对软件进行更新，当然其解读的基础也是基于如ClinVar等数据库的基础之上，这种形式可能更容易实现对结果解释的规范化[11]。但是，国内目前多数的情况，临床实验室生物信息学分析不包含这一部分，对检测的突变只能通过在数据库检索的基础之上进行解释。而且临床意义不明确的结果如何与临床医生沟通也是临床实验室面临的问题。
综上所述，随着越来越多的靶向治疗药物获得批准或进入临床研究，肿瘤多基因突变的NGS检测正展示广阔的应用前景，并开始从组织样本进入到循环肿瘤DNA的&液体活检&时代。选择适当的靶基因、采用合适的平台、有严格的LDTs建立、配制、检测的SOP，并进行应用前充分的性能评价，加上检测中的IQC和EQA，以及对结果的充分合理的解释，是实现肿瘤靶向治疗基因突变NGS检测临床价值的前提条件。
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