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DXY All Rights Reserved.SYBR Green IRT-qPCR乙肝病毒DNA检测体系--《第一次全国中西医结合检验医学学术会议暨中国中西医结合学会检验医学专业委员会成立大会论文汇编》2014年
SYBR Green IRT-qPCR乙肝病毒DNA检测体系
【摘要】：目的:探讨自建SYBR GreenⅠqPCR定量检测HBV DNA体系的临床价值。方法:采用基因克隆的方法获得含有HBV C-gene的质粒,制作稀释梯度作为标准品。比较SYBR GreenⅠqPCR和TaqMan探针法试剂盒对143例乙肝阴性和106例阳性血清样本检测HBV DNA含量,分别计算其灵敏度、特异性和符合率;对阳性率检测结果进行一致性分析;比较两种试剂盒标准品的扩增曲线。结果:相比ELISA结果,改良SYBR GreenⅠqPCR的灵敏度、特异性和符合率分别为99.28%、95.45%、97.59%;而TaqMan探针法的灵敏度、特异性和符合率分别为98.53%、92.04%、95.58%。对阳性率结果差异无统计学意义(P0.05)。SYBR GreenⅠqPCR检测法特异性高、重复性好、灵敏度更高(P0.05)、线性范围更宽、对低浓度样本检测更准确。结论:SYBR GreenⅠqPCR定量HBV DNA的方法经济、实用,具有推广应用的价值。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R373.21【正文快照】：
SYBR Green IRT-qPCR乙肝病毒DNA检测体系@刘姗姗$解放军总医院临床检验科
@岳素文$北京泰格瑞分子检验有限公司
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京公网安备75号SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测食品中转基因成分方法的初步建立
自20世纪80年代转基因食品(GMF)问世以来,发展非常迅速,但对其安全性问题的争论一直没有停止过[1]。我国农业部颁布的《农业转基因生物标识管理办法》规定:从日起,凡是在中国境内销售的大豆、玉米及其制品若属转基因生物,必须进行标识[2]。因此,建立准确、高效的转基因食品检测方法,对保障公众健康和安全,指导农业合理种植,保护生态等方面具有重要意义。本研究将SYBR Green I染料应用于实时荧光PCR,实现食品中转基因成分花椰菜花叶病毒启动子(Ca MV35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的检测。SYBR Green I是一种结合于DNA双链小沟中的荧光染料,DNA变性时,SYBR Green I不能与单链结合,染料释放,当PCR扩增完成后,SYBRGreen I与双链相结合,PCR系统检测到荧光的净增量加大,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。1材料与方法1.1材料(1)标准品和样品:大豆标准...&
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1999年10月,欧共体(EU)规定转基因成分超过1%时实行强制性标识制度。我国农业部颁布的《农业转基因生物标识管理办法》规定从日起,凡是在中国境内销售的大豆、玉米及其制品若属转基因生物,必须进行标识[1]。但是有些食品企业因为检验手段的落后,没有把好原料关,导致原料受到转基因成分污染;有些企业生产的食品转基因成分含量超过1%,但企业考虑到人们对转基因食品有一种恐惧和拒绝的心理,不在包装上标识,损害消费者的知情权。因此,建立特异的转基因成分定量检测方法极其重要。同时,卫生系统和检验机构也需要发展灵敏、快速的检验方法检测食品中的转基因成分,加强转基因食品的卫生监督和管理。目前的转基因食品检测方法中,定性聚合酶链反应(PCR)假阳性率高,不能定量,定量PCR的TaqMan探针价格昂贵,难以推广普及。SYBR Green I实时荧光PCR方法可用于检测食品中转基因成分花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆...&
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鲨鱼指软骨鱼纲板鳃亚纲鲨鱼总目的鱼类,是位于海洋生物链最高层的重要经济鱼类[1]。市场上的鲨鱼产品主要包括鱼翅、鲨鱼硫酸软骨素、鲨鱼肉以及鲨鱼肝油等[2-6]。由鲨鱼鱼鳍制成的干鱼翅、湿鱼翅及翅针因富含大量的胶原蛋白,且加工成鱼翅汤后肉肥味美,成为大型聚会和商业晚宴的必点菜肴[7]。从鲨鱼软骨中提取的鲨鱼硫酸软骨素,因可降低血脂,防治冠心病和心肌梗塞等心脑血管疾病,深受中老年朋友的喜爱[8]。从鲨鱼肝脏中经精深加工提炼而成的鲨鱼肝油,因富含大量的EPA、DHA及脂溶性维生素而广受消费者的青睐[9]。近年来,鲨鱼产品的广阔市场和巨大经济利益驱动了其造假掺假现象的不断发生,且尤以鱼翅的造假最为严重。目前,我国对鲨鱼产品的检测并没有相关国家标准和行业标准,但市场对鱼翅等鲨鱼产品的需求量非常巨大,急迫需要相关的检测方法对其进行真假鉴别。SYBR Green(SG)是一种荧光染料,能与双链DNA结合并发出荧光,是荧光定量PCR最常用的DN...&
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曲霉菌是一种广泛分布于自然界的真菌,作为一种条件致病菌,近年来越来越受到人们的关注,特别是深部真菌的感染在临床中呈持续上升趋势[1]。国外调查结果显示,在获得性血液感染中,曲霉菌感染已经上升到了深部真菌感染的第2位;而在尸检病例中,侵袭性曲霉菌病(Invasive aspergillosis,IA)的感染达4%。侵袭性曲霉菌病预后严重,病死率高,可达50%~100%[2,3]。侵袭性曲霉菌病主要由烟曲霉和黑曲霉感染引起[4]。相对一般细菌的感染,深部真菌感染的诊断一直是临床检验的主要难题。目前,烟曲霉诊断试剂盒已经问世,但对于黑曲霉的诊断还主要通过菌落形态学观察来进行鉴定。本实验以黑曲霉GAPDH基因为目的基因,针对其特异位点设计引物及探针,建立了快速检测黑曲霉的实时荧光PCR(Real-timefluorescent PCR)方法。1.材料与方法1.1供试菌株黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC16404和AT...&
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1961年,在英国就发现了世界首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcusaureus,MRSA)感染病例。MRSA从发现至今感染几乎遍及全球,已成为院内感染的重要病原菌之一[1]。实验证实,在MRSA中存在一种与β-内酰胺类抗生素低亲和力结合蛋白PBP2a,这种蛋白存在于细胞表面,由mecA基因编码表达,相对分子量为78×103,对β-内酰胺类抗生素有极低的亲和力[2]。在β-内酰胺类抗生素存在的情况下,其他的PBPs均被抑制而不能发挥正常生理功能时,PBP2a则代替其他被抑制的PBPs发挥作用,使细菌细胞得以生存而表现为耐受性[3]。所以,目前认为mecA基因为MRS耐药所必须的决定基因。本试验以mecA基因为目标基因检测耐甲氧西林葡萄球菌,辅以金黄色葡萄球菌特异性凝固酶基因NUC基因特异性引物探针,可判断是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。本次实验中共对22例葡萄球菌属...&
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近年来条件致病性真菌感染日益增多,其发病率和死亡率都呈明显上升趋势,由于深部真菌感染初期症状不明显,临床表现缺乏特征性,致使早期明确诊断十分困难,患者生前确诊率相当低,是影响患者预后的重要因素。传统真菌感染的临床鉴定主要依赖于镜检和培养,但这些方法存在周期长、阳性率低的缺点。因此临床上迫切需要一种能用于真菌感染的早期诊断方法[1]。实时荧光PCR具有灵敏、特异和快捷的特点,我们应用该技术建立了检测病原真菌的方法,并检测临床标本37例,初步评价该方法在临床上的应用价值。1实验1·1标本来源:临床标本来自无锡市第二人民医院2006年3月至2007年7月皮肤科、眼科门诊和部分住院患者,包括感染处的棉拭子、角膜刮片、肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、病理组织和外周血。5株真菌菌株来源于既往临床培养阳性真菌,包括:红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、念珠菌(Candidaalbicans)、孢子丝菌(Sporothrix)、犬...&
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肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic E.coli,EHEC为致泻性大肠埃希菌(Diagrrheagenic Escherichia coli,DEC中的一个亚型,能够产生stx1和(或)stx2及其变异毒素,可引起出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)[1]。EHEC包括O157︰H7、O26︰H11、O111︰H8等100多个血清型,O157︰H7、O26及O111是引起疾病的主要血清型[2],近年来由EHEC引起的食物中毒等突发公共卫生事件越来越多,如2011年5月德国发生的因食用O104︰H4血清型EHEC污染的黄瓜等食物引起的食物中毒,到目前为止共波及奥地利、丹麦、德国、荷兰、挪威和英国等17个国家,超过4000人感染,50多人死亡,给人民的生命安全造成极大威胁,因此,建立可以快速、灵敏、特异、有效的检测EHEC的方法非常重要。目前,应用于EHEC的检测方法...&
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