一种酶可以在 37℃ 时活性最高，55℃ 时失活，这种酶可以参与聚合酶链式反应 (PCR) 吗？ - 知乎114被浏览14027分享邀请回答9617 条评论分享收藏感谢收起918 条评论分享收藏感谢收起查看更多回答2 个回答被折叠（）献给初学者：PCR 常见问题分析
PCR 常见问题及解决方案
1没有扩展条带
可能的原因及对应的解决方案如下：
酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。
变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Taq 酶以前，将反应体系 95℃ 加热 5~10 分钟。
引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是 DNA 凝胶和 PCR 程序的问题。
2PCR 产物量过少
可能的原因和对应的解决方案如下：
退火温度不合适。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。
PCR 循环数不足。增加反应循环数。
引物量不足。增加体系中引物含量。
延伸时间太短。以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。
变性时间过长。变性时间过长会导致 DNA 聚合酶失活。
DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA 模板干净
3扩增产物跑电泳条带弥散
可能的原因和对应的解决方案如下：
酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
dNTP 浓度过高。减少 dNTP 的浓度。
MgCl? 浓度过高。可适当降低其用量。
模板量过多。质粒 DNA 的用量应&50 ng，而基因组 DNA 则应&200 ng。
引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 PCR 反应。
循环次数过多；增加模板量减少循环次数至 30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的 PCR 循环。
退火温度过低。
电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。
若为 PCR 试剂盒则可能：
①由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
4扩展产物出现杂带
可能的原因和对应的解决方案如下：
引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 PCR 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
样品处理不当。
Mg2+ 浓度偏高，因适当调整 Mg2+ 使用浓度。
若为 PCR 试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
引物特异性差。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
模板量过多。质粒 DNA 的用量应&50 ng，而基因组 DNA 则应&200 ng。
外源 DNA 污染。确保操作的洁净。
5条带大小与理论不符
可能的原因和对应的解决方案如下：
污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
模板或引物使用错误。更换引物和模板。
基因亚型。对研究的基因进行序列分析和 BLAST 研究。
6阴性对照出现条带
可能的原因和对应的解决方案如下：
试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
（来源: 生物学霸）
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在传统的反应中，极易发生引物错配和二聚体的形成，继而导致非特异性产物的扩增。热启动方法的问世有效地解决了这些问题，不仅优化了目标扩增产物，同时也减少了非特异性扩增，而且使得在传统PCR技术中较难扩增的单拷贝基因以及超长片段变得更简便。金思德 E1000-PCR仪是目前市场上唯一具有热启动功能的PCR仪，它主要是通过物理方法实现的热启动，能够在不使用昂贵的热启动酶的条件下，就可以有效地减少反应中非特异性产物的产生。& & 经实验室的研究结果表明，通过使用E1000-PCR仪的热启动功能，能够有效地帮助实验人员在做较难扩增的目标产物时得到最佳的实验结果，减少实验摸索时间，快速解决问题。
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本帖最后由 zrh6315 于
21:58 编辑
啥？？你配样是都是在pcr仪外配的，所谓热启动是说配样时抑制pcr反应（你机子怎么抑制？？），反应时恢复反应，你这有点乱扯吧
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zrh6315 发表于
啥？？你配样是都是在pcr仪外配的，所谓热启动是说配样时抑制pcr反应（你机子怎么抑制？？），反应时恢复反 ...
您好，这就是我们新研发出来的PCR，它采用的是物理方式的热启动！~实验方面我们已经反复做了很多次了，绝对没有问题！~
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JINSIDE 发表于
您好，这就是我们新研发出来的PCR，它采用的是物理方式的热启动！~实验方面我们已经反复做了很多次了，绝 ...
真有那么神，可否请教下其中的原理？ 物理方式目前主要是低温配样，难道你们是说要在pcr仪上配样？？
该用户从未签到
zrh6315 发表于
真有那么神，可否请教下其中的原理？ 物理方式目前主要是低温配样，难道你们是说要在pcr仪上配样？？
实例：PCR扩增目的基因：Human dystrophin gene, Alu7-2 repeat。PCR扩增片段大小：320bp。PCR的反应体系：25ul体系，包含模板DNA（人基因组DNA）-1ul；上下游引物各0.5ul；dNTP -0.5ul；Buffer -2.5 ul；Taq酶0.25 ul；ddH2O-19.75ul。PCR的反应条件：94℃ 2 94℃ 50s,67℃1min,72℃ 2min,4272℃ 104℃∞。热启动的操作步骤：1. 打开E1000-PPCR仪，建立实验方法条件；2. 选择热启动模式；3. 仪器加热板升温，待仪器升温至80℃；4. 打开仪器热盖，将空的PCR管放置于热板上；5. 依次将反应体系中各组分加入PCR管中；6. 合上热盖，点击“Run”按钮，开始运行。PCR产物电泳结果：（1）PCR反应体系中含有普通的Taq酶：& && && && && && && &&& & && && & 图1&&
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& && && && && && && && && && && & 图2
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图1为热启动方式下的PCR产物电泳结果；图2为传统启动方式下的PCR产物电泳结果，两种启动方式下的反应的体系及条件均一致。& & 从图中可见，热启动方式下的PCR产物的电泳结果较为理想，目的条带清晰，非特异性条带较少，且条带拖尾现象较弱；而传统启动方式下的PCR产物的电泳结果就不是十分的理想，虽可见目的条带，但条带较为模糊，拖尾现象较为严重。
（2）PCR反应体系中含有Taq-plus酶：& && && &&&& && && && && &
& && && && && && && &图3
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& && && && && && && && && && &&&图4
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图3为热启动方式下的PCR产物电泳结果；图4为传统启动方式下的PCR产物电泳结果，两种启动方式下的反应的体系及条件均一致。& & 从图中可见，热启动方式比传统启动方式下的PCR产物的电泳结果更为理想，目的片段扩增更加清晰，非特异性条带亮度较弱。（3）PCR反应体系中含有热启动酶：& && && && && &图5
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& && && && && && && && && && && &图6
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图5为热启动方式下的PCR产物电泳结果；图6为传统启动方式下的PCR产物电泳结果，两种启动方式下的反应的体系及条件均一致。从图中可见，热启动方式比传统启动方式下的PCR产物的电泳结果较为理想，目的条带清晰且亮度明显，非特异性产物明显减弱。
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我的神啊&&这种方式 几乎所有pcr仪都能做到啦
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zrh6315 发表于
我的神啊&&这种方式 几乎所有pcr仪都能做到啦
您好，我们只是说我们的仪器可以做到更好！~
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嗯 到这想必大家很清楚你的热启动机子怎么工作的了 谢谢！
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zrh6315 发表于
嗯 到这想必大家很清楚你的热启动机子怎么工作的了 谢谢！
不客气！~谢谢您的指点！~
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murongxiaoxiao大叔级摄影爱好者，喜欢分享绝对零度积极有责任心，热心公益事业yiii红米达人，爱拍照的北京女孩
逛了这许久，何不进去瞧瞧？专论与综述
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热启动ＰＣＲ技术的研究进展
粟玉刚，程天印＋，董欢
（湖南农业大学动物医学院，长沙４１０１２８）
摘要：热启动ＰＣＲ技术是通过各种物理化学方法控制ＰＣＲ反应的珏须组分来实现达到有效扩增特异性ＰＣＲ产物的目的一种方法。该技术的ｆ＊ｌ世－解决了非特异性扩增产物的出现，引物二聚体的形成等问题。使单拷贝基因和超长片段的扩增更为简便。本文较系统的介绍了热启动ＰＣＲ的原理和近几年的技术进展。关键词：热启动ＰｃＲ；研究进展
ＰＣＲ是多聚酶链式反应的简称，由Ｋ．ＢＭｕｌｌｉｓ于１９８５年首创，是体外酶促合成特定ＤＮＡ片段的一种方法．它能在一个试管内将目的基闪或ＤＮＡ片段在数小时内扩增十万或数百万倍。这一技术在生物学的许多研究领域已得到广泛的应用。随着该技术的发展．ＰＣＲ技术也存在一些问题，如非特异性扩增产物的出现、引物二聚体的形成、甚至凝胶电泳上无扩增带，从而限制ｒＰＣＲ技术的应用。热启动ＰＣＲ技术的问世解决了这些问题，使ＰＣＲ技术更加完美。本文就近几年国内外有关热启动ＰＣＲ技术的进展做相关介绍。
热启动ＰＣＲ的产生背景及原理
在传统的ＰＣＲ反应中，反应体系各成分均是一次加入
并进入循环，在反应温度由室温（２５℃）上升至高温（９４—９５℃）过程中，可能发生引物错配和■聚体的形成。引物与模板中一些非靶位点的错配和引物之间形成的二聚体，在Ｔａｑ酶的作用下均可延伸。这些非特异性产物又町在以后的ＰＣＲ循环中继续扩增，使非特异性产物不断积累，同时，也消耗反应体系的各成分，最终ＰＥＲ扩增的特异性产物将大大减少。
热启动是一种在ＰＣＲ反应中优化目标扩增产物的方法，同时也抑制非特异扩增。这是利用各种物理化学方法控制ＰＣＲ反应的必须组分，如ＤＮＡ聚合酶，直到反应混合物被加热到可以阻止非特异引导和引物聚合的温度后，再启动ＰＣＲ来实现的，达到有效扩增特异性ＰＣＲ产物的目的。２扩增反应体系和影响因素
ＤＮＡ聚合酶ＴａｑＤＮＡ聚合酶丰要用于合成
ＤＮＡ，其最适反应温度为７４℃左右，在高温下（９５℃）无明显不可逆变性。ＰＣＲ反应所用的酶龋町根据ＤＮＡ、引物及其他因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产萤降低。２．２引
物ＰＥＲ反应产物的特异性是由一对上下游引物
所决定，引物的好坏往往是ＰＣＲ成败的炎键。引物长度约为１５—３０ｂｐ，太短会降低退火温度，影响引物与模板配对，从而使非特异性增高；过长，ＰＣＲ最适延伸温度会超过Ｔａｑ酶的最佳作用温度．降低产物的特异性。
２．３四种三磷酸脱氧核苷酸三磷酸脱氧核苷酸（ｄＮＴＰ）是生物体内与体外合成核酸的原料。一般在ＰＣＲ反应中每种ｄＮＴＰ的浓度为２０—２００ＩＸｍｏｌ／Ｌ。四种ｄＮＴＰ各２０¨ｍｏｌ／Ｌ，足以在１００斗反应中合成２．５斗ｇ的ＤＮＡ。当ｄＮＴＰ终浓度大于
作者简介：枷１＇］（１９８５一），湖南长沙人，２００７级硕士研究生
２００９年第３期
方数据５０ｍｍｏｌ／Ｌ时可抑制ＴａｑＤＮＡ聚合酶的活性。
２．４模板ＰＣＲ反应必须以ＤＮＡ为模扳进行扩增，模板ＤＮＡ可以是单链、双链、线状或环状分子。模板Ｉ）ＮＡ用量依ＤＮＡ的性质而定。对于质粒ＤＮＡ，一般用ｎｇ量；对于染色体ＤＮＡ一般用
“ｇ级。—般反应中的横版数量为１０２—１０５个拷贝。
２．５缓冲液反应缓冲液一般包含１０—５０ｍｍｏｌ／Ｌ＂Ｉｒｉｓ．ＨＣ！（ｐＨ８．３～８．８）、５０
ｍｍｏｉ／Ｌ
ＫＣＩ和适当浓度的Ｍ矿。Ｔｒｉｓ?Ｈｃｌ
在２０℃时ｐＨ值为８．３～８．８，但在实际ＰＣＲ反应中，ｐＨ值为６．８—７．８，５０ｍｍｏｌ／－Ｌ的ＫＣｌ有利于引物的退火。另外，反应液可加入５ｍｍｏｌ／Ｌ的二硫苏糖醇（ＤＤＴ）可稳定酶活性。
Ｍ矿ＴａｑＩ）ＮＡ聚合酶是依赖Ｍ矿＋的一种酶。Ｍ矿浓
度对ＴａｑＤＮＡ聚合酶影响很大，它町影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的彤成等。Ｍ矿过低时，会降低ＴａｑＤＮＡ聚合酶的活性；而过高的Ｍ矿浓度会使ＰＣＲ扩增的特异性降低。３热启动ＰＣＲ的方法３．１经典的热启动ＰｃＲ方法
早在１９８９年，Ｓａｌｌｙ等人在测定免疫球蛋白的重链可变区时，为最大限度减少两引物３’端间的退火，将ＰＣＲ反应体系中的ＴａｑＤＮＡ酶扣除，直至循环仪温度上升至７０＇１２后再加入，这是最早的热启动ＰＣＲ。１９９１年，Ｄ’Ａｑｕａｌｉａ等人正式提出热启动ＰＣＲ的概念，并与传统ＰＣＲ技术进行了对比实验，证实热启动方法可显著增加特异产物的扩增量，减少非特异性产物和背景，使低拷贝的ＨＩＶ病毒更易扩增。然而，上述方法操作繁琐，需反复开关ＰＣＲ管盖，加大了工作量，同时也增加了样品交叉污染的机会。
后来人们在这种方法上进行了改良，将ＰＣＲ反应体系混匀后，置于冰浴中。其他步骤不变。该方法取得了极好的扩增效果，同时也减少了样品间交叉污染的几率和工作量。３．２发展的热启动ＰＣＲ方法３．２．１作用于ＴａｑＤＮＡ酶的方法３．２．¨单克隆抗体
１９９９年ＨｉｒｏｓｈｉＭｉｚｕｇｕｅｈｉ等人根据
Ｔａｑ聚合酶特异抗原决定簇的单克隆抗体在常温下与ＤＮＡＴａｑ聚合酶结合使其失去聚合作用的特性，研制出了单克隆抗体，它均南ＴａｑＤＮＡ聚合酶制备。常温下这两个抗体分别与ＴａｑＤＮＡ聚合酶结合，无聚合酶延伸作用不能进行。当温度大于７０。Ｃ时，抗体失活，同时释放出ＴａｑＤＮＡ聚合酶。研究表明，加入这两个抗体的目的基因的特异性扩增产物量比不加抗体的高得多，这种方法也适于１７．５ｋｂｐ以上长片段的ＰＣＲ反应。
??ａ翟冱蚕墨Ｏ－
３．２．１．２琼脂糖包埋低熔点琼脂糖凝胶的熔点为６５～７０。Ｃ。凝同点为３７～４０℃．在室温下它是凝固状态的，当加热到复性温度以上时（一般品种的复性温度是５５℃）才开始融化、释放Ｔａｑ酶发挥作用，所以不会有更低温度时的非特异性扩增发生。低熔点琼脂糖的存在不影响ＰＣＲ反应的进行。冈此，人们想出了一种简便方法。配制１．４％的低熔点琼脂糖凝胶水溶液，于７０。Ｃ水浴中均匀融化；再取与该水溶液等体积的Ｔａｑ酶（２Ｕ／“），趁热将两液混合，即得０．７％凝胶、１Ｕ／“Ｔａｑ酶混合溶液；迅速将此混合溶液分装与ＰＣＲ扩增管底部，室温下令其凝Ｉ司使酶得以包埋。进行ＰＣＲ扩增时，直接将其余试剂加于包埋管中即可。该方法包埋的Ｔａｑ酶可于４℃存放３—４个月不失活。３．２．１．３变异ＴａｑＤＮＡ聚合酶
２００３年Ｍｉｌｋｏ
Ｂ．Ｋｅｒ－
ｍｅｋｃｈｉｅｖ等发现一种嗜热菌，其ＤＮＡ聚合酶在２０～３７０Ｃ时有显著活性。研究人员将这种酶的Ｎ端删除后获得了一种Ｎ一末端缺失的变异ＫｌｅｎｔａｑＤＮＡ聚合酶。该酶会诱发部分错配，当错配产物达到一定浓度时就会停止。即在前１２—２０个循环出现一种错配产物；２５—３０个循环出现另一种产物。所产生的产物均町用ＰＥＧ沉淀消除。而该酶主要在２４个循环时作用效果最佳。因此可以达到热启动的目的。３．２．２作用于引物的方法
３．２．２．１类发卡结构引物一种带有茎环结构的寡核甘酸引物被研发并应用到实践中。这种引物不需要在末端添加任何染色物就可起到分子信标的作用。它的３’末端序列足够能与模板配对，另外３’末端还有多余的５或６个核苷被加到５’末端形成类发卡的摹环结构。在ＰＣＲ反应的初始阶段，有茎环结构引物在ＤＮＡ聚合酶的作用下不能发挥引物作用。当达到退火温度的时候，引物的茎环结构自动打开并迅速结合到模板上，启动扩增。
３．２．２．２双链引物２００４年研究人员提出了一种用双链引物取代单链引物的ＰＣＲ热启动新方法。双链引物由两条长度相等的寡核甘酸组成，其中一条寡核甘酸在ＰＣＲ扩增过程中相当于普通的与模板结合或分离的单链引物，被称为“引物链”。另一条引物作为引物带的互补，它带有一个或数个错配的寡核甘酸，在ＰＣＲ反应过程中不能扩增，即为“竞争链”。在低温时，引物带与竞争带以双链的形式结合在一起，尽管存在错配的现象，但在有模板的情况下，竞争链为来自模板的双链取代，扩增只在特定条件下发生。
３．２．２－３热活性引物热活性引物是指在３’末端和３’次末端核苷之间的连接处加入一个或两个不耐热的四氧化戊烷磷酸二脂基团，在低温的情况下，一个或多个四氧化戊烷磷酸二脂基团修饰过的引物能减少ＤＮＡ聚合酶作用下的延伸。而这种【，ｑ氧化戊烷引物在升温的过程中能产生相应的未被修饰的磷酸二脂引物，该引物是ＤＮＡ聚合酶的合适底物。当四氧化戊烷引物作为未被修饰的磷酸二脂引物替代物在ＰＣＲ中使用时，扩增目的片段的特异性和有效性将被提高。３．２．３作用于ｉ磷酸脱氧核苷酸（ｄＮＴＰ）的方法２００８年
Ｋｏｕｋｈａｒｅｖａ等人制备了一些２’一脱氧核糖核苷和３’三
磷酸基团被醚和酯取代的ｉ磷酸脱氧核苷酸（ｄＮＴＰ），这些ｄＮＴＰ不会在ＤＮＡ聚合酶作用下发生反应。当ＰＣＲ反应９５。Ｃ短暂预热过程中这些３’修饰过的ｄＮＴＰ会转化为相应的未被修饰过的天然ｄＮＴＰ，并有效的参与ＰＣＲ扩增。经
方数据??ａ翟至蓄四??
专论与综述
ＰＣＲ产物分析表明，有３’修饰过的ｄＮＴＰ参与的反应其扩增产物量增多，非特异性产物减少，ＰＣＲ反应显示出了良好的效果。
３．２．４其他方法２００２年研究人员提出了一种提高ＰＣＲ反应特异性的方法。该方法是通过改变Ｍ矿的浓度来控制ＤＮＡ聚合酶的活性从而达到热启动的目的。ＭＳ；＋的浓度依赖于反应的温度，在ＰＣＲ反应中Ｍ矿在低温Ｆ受到束缚而在高温下得到释放。在低温的情况下改变Ｍ矿的浓度使反应受到束缚而在高温下改变Ｍ９２＋的浓度使其促进反应，以达到减少非特异性扩增的门的。
另外，人们发现短舣链ＤＮＡ片段有抑制ＤＮＡ聚合酶活性的作用。这种抑制作用没有特异的顺序，而是专一的依赖于片段的解链温度，这个温度是根据片段之问的相互作用而制定出的熔解曲线来确定的。在ＰＣＲ混合物中加入合适长度的短双链ＤＮＡ片段．能抑制退火温度以下非特异性扩增。
热启动ＰＣＲ技术作为已成为ＰＣＲ领域的研究热点之一，并获得迅速发展。它在较难扩增的ＰＣＲ反庇如基因组ＤＮＡ单拷贝序列的扩增、多重ＰＣＲ和超长片段的扩增中的应用尤为突出。它能有效降低或消除非特异性产物以及＇－３Ｉ物二聚体的形成，提高引物与模板结合的效率。进一步提高目的基因的扩增产物量，是ＰＣＲ反应更趋于完美。
【１１Ｄ’ＡｑｕｉｌａＴ，ｏｔａ１．ＭａｘｉｍｉｚｉｎｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆＰＣＲ
ｂｙｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｈｅａｔｉｎｇ．ⅡｌＮｕｔ，ｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ＿ｉ９９１，１９（１３）３７４９
ＨａｋｅｓＪ。ｅｌａ１．ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
ｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅａｒ
ｍａｔｒｉｘ
ａｎｄｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｎｎｃｌｅｆｉＬｒｍａｘｔｒｉｘ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ．硼．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．
１９９１，２６６（１７）：１１Ｉ
１３Ｉ－１１１４０
【３１Ｓａｌｌｙ
ａ１．Ｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆ
ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．ｏｆｓｉｎｇｌｅ
ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｓｓｅｃｒｅｔｅｄｆｒｏｍ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．
Ｎａｔｕｒｅ．【Ｊ】１９８９，３４１（６２４２）：５刊一５４６【４】Ｈｉｒｍｈｉ
ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｔｏＨｏｔＳｔａｒｔ
ＰＣＲｏｆＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｓａｉｎｓｔＫＯＤ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．【Ｊ】ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９９，１２６（４）：７６２【５】Ｂｒａｃｅ
Ａ．ＰＣＲ
ｃｌｏｎｉｎｇ
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．［ＭＩ．ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ：ＨｕｍｓｎｓＰｒｅｓｓ．
１６１Ｍｉｌｋｎ
Ｂ．．ｅＩ
ａ１．Ｃｏｌｄ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ｍｕｔａｎｔｓ
ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｐｒｏｖｉｄｅ
ｈｏｔｓｔａｎ
ＰＣＲ．【Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００３，３１（２１）：
６１３９—６１４７
１７１Ｋａｂｏｅｖ０Ｊ（．．ｅｔａＬＰＣＲｈｏｔ
ｓｔｒａｔｕｓｉｎｇｐｒｉｍｅｒｓ
ｗｉｔｈｔｈｅ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
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ｂｅａｃｏｎｓ（ｈａｉｒｐｉｎ－ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）ｆＪｌ
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．
２０００２８（２１田４
［８１ＤｅｍｉｎｇＫ，ｅｌａ１．ＰＣＲｈｏｔ—ｓｔａｒｔｕｓｉｎｇｄｕｐｌｅｘｐｆｉｍｅｒｓ．［Ｊ１．
ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２００４，２６：２７７－２８０．
［９１ＭｅｘａｎｄＩ；ｅ
ａ１．ＨｏｔＳｔａｒｔＰＣＲｗｉｔｈｈｅａｔ－ａｅｌｉｖａｔａｂｌｅｐｆｉｍｅｍ：
ｎｏｖｅｌａｐｐｒ“ａｃｈｆｏｒｉｍｐｒｏｖｅｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．［Ｊ１．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２００８，３６（２０）：１３１．［１０ｌ
Ｋｏｕｋｈａｒｅｖａ，ｄａ１．ＨｅａｔＡｃｔｉｖａｔａｂｌｅ３’一ｍｏｄｉｆｉｅｄｄＮＴＰｓ：
ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒ
Ｓｔａｒｔ
ＰＣＲ．Ｕ】．Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
Ｓｅｒｉｅｓ．２００８（５２）：２５９－２６０
【ｌｌ】ｌｇｎａｔｏｖ
ＮｅｗＡｐｐｒｏａｃｈｔｏＥｎｈａｎｃｅｄＰＣＲＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．
１Ｊ１．ＲｕｓｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆ
Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２００３，２９（４）：３６８－３７１
【１２】ＫａｉｎｓＰ．Ｓｅｔａ１．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｅｎｈａｎｃｅｄｈｏｔ－ｓｔａｒｔＰＣＲ：ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆ
Ｄｏｕｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ａｄａｐｔｅｄ
ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．【Ｊ】．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２０００，２８（２）：２７８－２８２
２００９年第３期
热启动PCR技术的研究进展
作者单位：
英文刊名：
年，卷(期)：粟玉刚， 程天印， 董欢湖南农业大学动物医学院,长沙,410128畜牧兽医科技信息CHINESE JOURNAL OF ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY MEDICINE2009(3)
参考文献(12条)
1.Kainz P S Specificity-enhanced hot-start PCR:addition of Doule-stranded DNA fragments adapted tothe annealing temperature[外文期刊] 2000(02)
2.Ignatov K B A New Approach to Enhanced PCRSpecificity 2003(04)
3.Inna Koukhareva Heat Activatable 3-modified dNTPs:Synthesis and Application for Hot Start PCR[外文期刊] 2008(52)
4.Hakes J DNA binding properties of the nuclear matrix and individual nuclear maxtrix proteins1991(17)
5.Alexandre V Hot Start PCR with heat-activatable primers:a novel approach for improved performance
[外文期刊] 2008(20)
6.Deming K PCR hot-start using duplex primers[外文期刊] 2004(4)
7.Kaboev O K PCR hot strat using primers with the structure of molecular beacons(hairpin-likestructure)[外文期刊] 2000(21)
8.Milko B Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[外文期刊]2003(21)
9.Bruce A PCR cloning protocols 1997
10.Hiroshi M Characterization and Application to Hot Start PCR of Neutralizing Monoclonal Antibodiesagainst KOD DNA Polymerase 1999(04)
11.Sally E Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secretedfrom Escherichia coli[外文期刊] )
12.DAquila T Maximizing sensitivity and specificity of PCR by preamplification heating[外文期刊]1991(13)
本文链接：http://d..cn/Periodical_yfsyxjz.aspx
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