当前位置： >> NanoDrop 2000操作流程 NanoDrop 2000 操作流程1. 软件设定： 打开电脑电源， 双击图标打开程序， （1）进入软件主界面, 选择应用程序（默认分组 classic，不用管）选择Nucleic Acid测核算浓度。（2）接着会连续出现几个提示框，选“是”
点 OK（确保检测臂是放下的） , 稍等片刻即进入测量界面。 （3）左边的界面只需勾选 Add to report，其它选项一般情况下不用管。 右边 Sample ID 里给样品命名， Type 里选择样品类型2.操作流程 清洁光纤表面： 做 BLANK 前加 2 ?L 蒸馏水到下光纤表面，放下检测臂， 然 做空白对照： 抬起检测臂，用移液枪吸取适量 BLANK 液体加到下光纤表面, 放 加样测量： 抬起检测臂， 将上下光纤表面的液体用滤纸吸干， 吸取适量样品 （核 后抬起来用滤纸将上下检测臂的水吸干， 如此可保证 BLANK 准确。（1） （2） （3）下检测臂，点击 BLANK 做空白对照 酸 1.5-2 ?L， 蛋白 2-2.5 ?L， 请先将样品混匀） 加到下光纤表面， 放下检测臂，两个 光纤之间会形成液柱， 点击 Measure 测量， 软件右边就会出现测量结果注意事项1 测量前要用蒸馏水清洗上下光纤端面至少 3 次，然后再做 Blank，每换测样 品要清洗 1~2 次，全部检测结束后清洗 5 次，保持原位，清理台面。 2 放上光钎时， 轻拿轻放， 保护仪器的安全， 使用前先登记， 仪器操作不清楚， 请联系仪器负责人代检测。Nanodrop C 分光光度计 V1.0 用户手册 基因有限公司仪器应用技术支持 亲爱的用户，您好！ 非常感谢您选购我公司代理的仪器。我们将竭诚为您提供优质的售后服务及免费的专业应用培训。 为了更好地进行仪器的应用培训，我们根据您所选购的仪器特点，将需要您配合准备的工作敬告如下： 1. 应用培训内容：仪器操作培训和软件应用培训。仪器操作培训包括：仪器的操作、 维护和仪器使用注意事项。软件应用培训包括：用户本次所购买的同仪器配套的所有软件的软件应用培训。 2. 培训时间：仪器正式安装调试后，由安装工程师现场培训仪器操作。 3. 应用培训中所需准备的试剂、耗材和仪器均需由用户提供，并在系统培训开始前 4. 用户签收售后服务工作报告后，基因公司正式的系统培训内容即完成。您以后在 使用的过程中有任何疑问都可以向我们咨询，我们非常乐意为您们解决应用上遇到的问题。 5. 在仪器的使用过程中，无论遇到您认为多么微小或繁琐的问题，请您及时和我们 联系，一个及时的通知能节约您的时间，也能帮助我们更好的了解仪器和软件。 6. 联系我们时请您提供：仪器型号、软件名称，版本、错误代码、实验目的、操作 系统（98/2k/xp/NT）、维修历史等相关资料。 本守则提的信息仅供参考，本守则包含的所有信息应该是正确和完整的。如果对本守则中的描述有疑问，请参考厂家的英文操作说明。如果由于您的不正当使用而对仪器造成损坏或者导致仪器的性能损伤，本公司将不会对此负责。 1．仪器介绍 Thermo Scientific NanoDrop C分光光度计可以检测0.5-2ul的样本，而且检测是非常高的准确性和重复性。ND2000C分光光度计不仅提供了NanoDrop样品保留专利技术的便利性，也可以使用传统的比色皿来进行样本检测。 样本保留系统应用了表面张力来把样本保留在两根检测光纤中间，这使得仪器可以检测较高浓度的样本而不用稀释。应用这个技术，全波长（190－840nm）NanoDrop C分光光度计检测样本的最高浓度是标准比色皿的200倍。 NanoDrop C—基座模式 仪器类型： 分光光度计 最小样品量： 1mm（可以自动调整到0.05mm） 检测器类型： 2048—象素线型硅CCD阵列 波长范围： 190－840nm 波长准确性： 光谱分辨率： ≤1.8nm（FWHM@Hg 253.7nm） 吸收光精确性： 0.002吸光值（1mm光程） 吸收光准确性： ±2％（257nm波长下，0.76个吸光值）吸光值范围： 0.02—300（等同于10mm光程时） 检测极限： 2ng/ul dsDNA 最大检测浓度： 15,000ng/ul（dsDNA） 检测时间： 仪器占地面积; 14cm×20cm 样本基座材料： 303不锈钢以及石英光纤 工作功率： 12－18W（最大30W） 软件兼容性; Windows XP 和Vista（32bit） NanoDrop 2000C—比色皿模式 光束高度： 150－850RPM 10，5，2，1mm 检测极限： 0.4ng/ul dsDNA 最大检测浓度： 750ng/ul dsDNA 检测时间： 看过本文章的还看过。。。 nanodrop_2000中文操作手册_物理_自然科学_专业资料。nanodrop c 分光光度计 v0 用户手册 基因有限公司仪器应用技术支持 亲爱的用户,您好! 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企业性质： 主营产品：石英比色皿,干式恒温器,恒温混匀仪,漩涡混 公司地址：上海市闵行区莘福路388号1号楼303室 价格：48000 元/ NANO-200超微量核酸分析仪是我公司经过长时间的攻关而推出的又一款用来检测DNA,RNA浓度和纯度的仪器，能够快速测量核酸的浓度。每次测量所需要的样品量仅需0.5至2ul即可。直接将样品点于样板上。无需比色杯或毛细管等附件。 上海昨非实验室设备有限公司位于交通便利、信息发达的上海市闵行开发区,是从事实验设备研究开发与制造、销售的专业公司。设备先进，检测手段齐全，拥有一流的技术人才和管理人才，公司产品在同行中始终处于领先地位。 昨非公司研发团队在超声技术、计算机软硬件、信息处理、电子技术、工业控制等领域拥有诸多高水平的专业人才。仪器的研发生产的每一个环节都有规范的流程和标准，成熟的生产工艺和质控体系保证了产品的品质，特别在材料物理性能检测仪器和水质检测仪器方面具有绝对优势，硬度计、厚道计、超声波、电导率和水质在线检测等产品已处于行业领先地位。我公司产品已广泛应用于科研、电工、电子、军事、航空、船舶等企事业单位。 昨非公司恪守“今是而昨非”的原则，多年来不断进取，开拓创新，博得了广大用户的信赖。本着质量为根、服务为本、诚信当先、利益共赢的经营宗旨，密切关注国内外最新科技动态，兼收并取国内外高新技术，不断拓展先进实用的产品。长久以来，一直在孜孜不倦地寻求如何通过昨非的工作，为中国的仪器设备略尽绵薄。 我现公司已按照ISO标准建立质量保证管理体系，同时公司还可以根据顾客需要设计非标产品，欢迎广大新老客户前来公司洽谈、指导! “客户满意&是公司的服务目标，完善的售后服务是公司产品得以畅销全国的重要因素，在营销策略上更致力于为用户提供全面周到的售前售后服务，随时准备为您排忧解难。 作为专业的实验室设备公司，我们坚持专心研发，专一经营，因为专一，所以专业。 归去来兮，田园将芜，胡不归？既自以心为形役，奚惆怅而独悲！悟已往之不谏，知来者之可追；实迷途其未远，觉今是而昨非。舟遥遥以轻飏，风飘飘而吹衣。问征夫以前路，恨晨光之熹微。 ------ 昨非 成立时间： 企业经济性质： 年营业额： 注册资金： 经营模式： 员工人数： 该公司其他产品 价格：￥67000 / 产品详情：NANO-200超微量核酸分析仪是我公司经过长时间的攻关而推出的又一款用来检测DNA,RNA浓度和纯度的仪器，能够快速测量核酸的浓度。... 价格:67000 &元/ 价格：面议 产品详情：上海昨非实验室设备有限公司为您提供微量分光光度计系列产品，NANO-200超微量核酸分析仪是我公司经过长时间的攻关而推出的又一款... 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10、与特定的核酸分离技术相关的常见污染物的来源包括苯酚/Trizol法和列提取。在苯酚/Trizol法提取的情况下，残留试剂的污染可能是由220至240nm之间的异常光谱，以及在260?280nm区域的变化。相反，从列提取的残留胍可能导致附近230纳米的高峰期，在从230纳米到约240纳米的槽的转变。 11、为了准确地评估样品的质量，260/280或二百三分之二百六十○比率应在与整体的光谱质量结合分析。纯核酸通常产量的1.8?260/280的比例和DNA和RNA的2.0?260/280的比例，分别。这个比率是依赖于用于空白和样品测量的缓冲pH值和离子强度。酸性溶液中会根据代表0.2-0.3的比例，而一个基本的解决方案将超过代表比例由0.2-0.3。显着不同纯度率可能表明存在蛋白质，酚或其他污染物，达到或接近280nm处的强烈吸收。二百三十零分之二百六十零纯度比一个&纯&核酸一般在1.8-2.2范围内的值的第二项措施是DNA的纯度。纯度的比例明显低于预期值低可能表明所使用的隔离技术，可能需要进一步优化。 12、NanoDrop分光光度计也可以用来量化的蛋白质，使用直接吸光度或蛋白质比色法。为了确保正确的列形成和重复性，2uL的样品应为蛋白质样品。 文章标签：超微量分光光度计应用NanoDrop2000核酸浓度测定 购买、咨询（仪器设备提交仪器设备信息 发表我的评论 相关热门仪器设备一种带有荧光素酶基因的jev感染性克隆及构建方法和应用的制作方法 一种带有荧光素酶基因的jev感染性克隆及构建方法和应用的制作方法 【专利摘要】本发明公开了一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆及构建方法和应用。一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆，其制备步骤是：（1）JEV病毒SA14株基因序列的分段合成；（2）JEV病毒感染性克隆的组装与构建；（3）带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆的构建。本发明通过免疫荧光、Rluc活性的检测、病毒噬斑、药物抑制、活体动物成像及疫苗评价等实验证明：本发明所构建的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆可以拯救出具有与JEV病毒生长趋势相同的Rluc-JEV报告病毒，并且在动物模型、病毒复制与致病机理、药物筛选和药物作用机制、活体动物成像及疫苗评价等方面具有广泛的应用价值。 【专利说明】一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆及构建方法和应用 【技术领域】 [0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆，还涉及一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆的制备方法，以及该克隆拯救出的Rluc-JEV报告病毒在抗病毒药物筛选、动物活体成像以及乙型脑炎疫苗评价中的应用。 【背景技术】 [0002]日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是流行性乙型脑炎(简称乙脑)的病原体，病毒通过蚊虫叮咬传播,病毒随着蚊虫唾液进入人体,引发中枢神经系统损伤，病死率和致残率高，作为一种以儿童为高发人群的传染病，乙脑严重危害儿童的身心健康。乙脑主要流行于亚洲地区，1995年开始传播至澳大利亚，近年来流行区覆盖至亚洲和太平洋地区的24个国家，已成为严重的公共卫生问题。我国是乙脑流行最严重的国家之一，乙脑疫苗的大规模使用明显降低了我国乙脑发病率。尽管如此，2012年WHO统计结果显示，全球每年约有20，000例流行性乙脑病例发生，其中60000人死亡，约有30%-50%的患者存有终生神经系统后遗症，我国大陆的发病人数仍占全球病例的50%左右。目前为止，尚无特效抗病毒药物治疗JEV感染引发的乙型脑炎，主要采用对症及支持疗法。为了降低乙型脑炎的病死率和后遗症的发生，科学工作者针对JEV展开了深入研究，包括病毒复制机制和致病机理等，以期为研制针对乙脑的抗病毒药物，研发新型疫苗和改良治疗方法提供理论依据。 [0003]JEV病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)成员，同属的其它病毒包括登革病毒(DENV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、黄热病毒(YFV)和西尼罗河病毒(WN V)等，均是引起人类致病的重要病原体。黄病毒属病毒为包膜病毒，基因组为单正链RN A，大约长10~llkb，5’端具有有细胞mRNA类似的7-甲基鸟苷帽(Cap)结构，但3’端缺少多聚腺苷尾Poly A.病毒基因组含有一个大的阅读框，在进入细胞后即可以自身为信使RN A，翻译出一条多聚蛋白，在细胞和病毒蛋白酶的作用下切割成三个结构蛋白和七个非结构蛋白。非结构蛋白有多种酶活性，主要参与病毒的复制，包括NS1，NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B和NS5.结构蛋白主要与病毒的包装有关，分别是衣壳蛋白(Capsid，C)、P rM蛋白和包膜E蛋白。 [0004]RNA病毒的反向遗传学技术，也称为“病毒拯救”技术，一般是在质粒中构建含有整个病毒基因组的cDNA拷贝，通过体外转录过程再次得到病毒基因组RNA，将此RNA转染病毒敏感细胞中可以拯救出活病毒，这种cDNA质粒称为感染性克隆。通过感染性cDN A克隆，科学工作者可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰和改造，通过病毒的表型来判断这些操作对病毒的影响，从而研究病毒复制机制和致病机理，甚至得到减毒株，研发新型疫苗。因此，感染性克隆的构建解决了 RNA病毒基因组难以操作的困扰，为RNA病毒的研究提供有效的工具。目前已有许多RNA病毒的全长感染性克隆构建成功，如肠道病毒属的EV71病毒、脊髓灰质炎病毒， 黄病毒属的登革病毒、黄热病毒等，在RNA病毒研究领域有广泛的应用。报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因，如荧光蛋白或荧光素酶等。在感染性克隆的基础上，将报告基因与病毒基因组融合，构建含有报告基因的病毒cDNA感染性克隆，拯救出具有感染性的稳定表达报告基因的病毒，通过测定报告基因所表达蛋白的活性即可直观判断病毒生长情况。与传统的病毒滴度检测方法相比，报告基因的表达检测灵敏度更高、检测时间极大缩短，可以大大提高病毒检测的效率和灵敏度。这种含有含有报告基因和病毒基因组的克隆称为报告病毒感染性克隆，其拯救出的病毒称为报告病毒。与感染性克隆相比，报告病毒感染性克隆显然有着更加便捷的优势。 [0005]活体动物体内成像是近年来新兴的检测活体动物体内基因表达及细胞活动的光学成像技术，具有操作简便，直观性强的特点。活体动物体内光学成像主要采用生物发光技术和荧光技术。其中生物发光是用荧光素酶基因标记细胞或DNA，利用报告基因产生的生物发光就可以形成体内的生物光源。虽然哺乳动物组织是不透光的，但是利用灵敏的光子成像技术可以从动物体表检测到组织内部的生物光源,使研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为，操作简单、结果直观、灵敏度高，是一种十分有效的研究实验动物生理过程的技术，广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。因此，将荧光素酶与病毒基因组进行融合而构建的报告病毒感染性克隆，是将反向遗传学技术与活体动物成像技术结合起来，对病毒在体内进行追踪，观察病毒在体内的发展过程，可为研究者提供广阔的应用空间。 [0006]本发明提供一种带有海肾荧光素酶(Renilla luciferase，Rluc)基因的JEV病毒的感染性克隆的构建方法，以及该感染性克隆所拯救出的报告病毒Rluc-JEV在药物筛选和动物活体成像、疫苗 评价等方面的应用。本发明所构建的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆将为深入展开JEV病毒的复制、包装机制等基础理论研究以及药物研发、疫苗评价等应用研究提供有效的技术平台，可有效地服务于人类的医疗卫生事业。 【发明内容】 [0007]本发明的目的在于提供了一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆pACYC-Rluc-JEV-FL，其序列为 SEQ ID N0.1 所示，其中，I ~95:JEV_5’UTR序列;96 ~197:JEV-Capsid蛋白N端34位氨基酸序列；198~1130:海肾荧光素酶序列;: 口蹄疫病毒FMDV2A自切割肽序列； JEV病毒结构蛋白、非结构蛋白以及3’UTR序列;:丁型肝炎病毒核酶(HDVR)序列；:pACYC177序列；:T7启动子序列。 [0008]本发明还有一个目的在于提供了一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建方法，根据本发明提供的方法，构建带有海肾荧光素酶Rluc报告基因的JEV SA14病毒株感染性克隆，并将体外转录获得的RNA转染ΒΗΚ-21细胞，通过定点收集细胞和上清，可获得带有荧光素酶的JEV病毒。 [0009]本发明还有一个目的在于提供了一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆在活体动物成像中的应用。利用带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV报告病毒对小鼠进行Rluc-JEV报告病毒感染实验，通过动物活体成像系统检测小鼠体内Rlu c信号，实现了对病毒在小鼠体内的动态观察。[0010]本发明还有一个目的在于提供了一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆在抗病毒药物筛选的应用。利用该克隆所拯救出的Rluc-JEV报告病毒，通过检测荧光素酶活性，可知道药物对病毒的抑制情况，可以作为有效的抗病毒药物筛选平台。 [0011]本发明最后一个目的在于提供了一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆在乙型脑炎疫苗评价中的应用。通过比较新型疫苗株病毒免疫的小鼠与未免疫对照小鼠在感染Rl uc-JEV报告病毒后的动物成像结果，对新型疫苗研制进行效果评价。 [0012]为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案: [0013]本发明的设计思路为: [0014]以低拷贝的载体PACYC177为对象，将JEV的基因组插入到pACYC177中，同时在与病毒5’端非编码区上游的连接区域引入T7RNA聚合酶的启动子序列，病毒3’末端引入HDVR(hepatitis delta virus ribozyme, HDVR)序列，并将 Rluc 基因插入病毒衣壳蛋白capsid的N端，Rluc基因插入的同时,将capsid的N端34个氨基酸进行重复拷贝，因此带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆基因组的顺序为:T7-5’ UTR-Capsid34-Rluc-2A-Capsid-PrM-E-NSl~5_3’ UTR.其中5’ UTR后面重复的capsid-34可以提供病毒复制必须的顺式作用元件，保证病毒5’末端和3’末端的正常环化，从而不影响Rluc插入后的基因组的正常复制。此外，T7启动子可以线性化的DNA为模板，在体外高效的转录获得病毒RNA，H DVR序列可将转录后的RNA从3’ UTR末端与pACYC载体序列切割开来，从而保证体外转录的RNA具有正确的病毒3’ UTR序列。以上处理可以高效获得正确的病毒RNA，并解决了外源基因插入病毒基因组造成基因组不复制的现象，转录出的RNA转染细胞后，RNA可正常复制，并产生具有感染性的病毒粒子。 [0015]一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆，其构建方法如下: [0016]1) JEV-SA14病毒株基因组序列分段合成: [0017]构建带有JEV全长基因组的cDNA感染性克隆:选择JEV-SA14病毒株序列，GenBank N0.U14163.1;分成四个片段进行基因合成，这四个片段分别命名为片段A，片段B，片段C，和片段D，其中片段A为T7+基因组I~3450nt序列，片段B为基因组nt序列，片段C为基因组nt序列，片段D为基因组nt+H DVR序列；T7启动子序列如SEQ ID N0.2所示，HDVR序列为SEQ ID N0.3所示，四个片段分别用Psi I和BamH I插入低拷贝质粒pACYC177载体，转化至大肠杆菌感受态HBlO ;质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为pACYC-A，pACYC-B, pAC YC-C和pACYC-D。 [0018]2)含有病毒基因组的JEV cDNA感染性克隆的构建: [0019](I)JEV基因组片段A+B的拼接:用BspE I和BamH I酶切上述步骤I)中所得的pACYC-A和pACYC-B，回收pACYC-A的大片段与pACYC-B的大片段；将pACYC-A的大片段作为载体，pACYC-B的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pACYC-A+B ； [0020](2) JEV基因组片段C+D的拼接:用Xba I和Xho I酶切上述步骤I)中所得的pACYC-C和pACYC-D，回收pACYC-C的大片段与pACYC-D的大片段；将pACYC_C的大片段作为载体，pACYC-D的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pACYC-C+D ； [0021](3) JEV基因组全长pACYC-A+B+C+D的拼接:用BamH I和Xho I酶切上述步骤中所得的pACYC-A+B和上述步骤所得pACYC-C+D，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pACYC-A+B的大片段与pACYC-C+D的大片段；将pACYC-A+B的大片段作为载体，pACYC-C+D的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的含有JEV全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-JEV-FLο [0022]3)带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建: [0023](I)待融合的三个目的基因的特异性扩增: [0024]①片段T7-5’ UTR-Capsid-34 的扩增:以 pACYC-JEV-FL 为模板，使用 PrimeSTARHS酶扩增含有T7-5’UTR-Capsid-34的序列，引物为SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.6所示，回收DNA片段。 [0025]②片段Rluc-2A的特异性扩增:以含有Rluc基因的WNV-Rluc-r印Iicon质粒为模板，使用PrimeSTAR HS酶扩增含有Rluc_2A的序列，引物为SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8，回收DNA片段； [0026]③片段Capsid-prM-E的特异性扩增:以pACYC-JEV-FL为模板，使用PrimeSTAR HS酶扩增含有Capsid-prM-E的序列，引物为SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10，回收DN A片段； [0027](2)两步融合 PCR 法扩增 T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E 片段: [0028]第一步融合PCR:片段T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc_2A的融合PCR特异性扩增:以上述所得片段T7-5’ UTR-Capsid-34和Rluc_2A为模板，使用PrimeSTAR HS酶扩增含有T7-5，UTR-Capsid-34-Rluc-2A 的序列，引物为 SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.8，回收 DNA 片段； [0029]第二步融合PCR:片段 T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E 的融合 PCR特异性扩增:以上述所得片段Capsid-prM-E和T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc_2A为模板，使用 PrimeSTAR HS 酶扩增含有 T7-5’ UTR-Capsid34-Rluc-2A-Capsid-prM-E 的序列，引物为SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.10，回收 DNA 片段； [0030](3)将荧光素酶基因Rluc插入JEV全长感染性克隆:将T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Cap si d-prM-E和JEV全长感染性克隆pACYC-JEV-FL分别用Kpn I和BsrG I双酶切。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，经过T4DNA连接酶将回收的酶切产物按照片段:载体摩尔比为6:1进行连接，并将连接产物转化HBlOl感受态，将PCR鉴定阳性的克隆进行培养并抽提质粒，测序正确，获得的质粒即为带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆，命名为 pACYC-Rluc-JEV-FL。 [0031]带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆成功拯救出与野生型病毒生长趋势相同的Rluc-JEV报告病毒，其步骤是: [0032]1、用Xho I酶切pACYC-JEV-FL及pACYC-Rluc-JEV-FL进行线性化处理，线性化产物经酚氯仿抽提后，分别以线性化的pACYC-JEV-FL和pACYC-Rluc-JEV-FL为模板，使用体外转录试剂盒T7mMESSAGE mMACHINE kit (购自美国Ambion公司)，按照试剂盒说明分别得到带 JEV 的 RNA 及 Rluc-JEV 的 RNA。 [0033]2、体外转录得到的Rluc-JEV及JEV RNA分别使用电转的方法转染BHK-21细胞，接种2 X IO5转染了各RNA的BHK细胞于12孔细胞培养板中，并在转染后2、12、24、48、72和96h后收取培养基上清作为不同时间点的Rluc-JEV及JEV PO代病毒，并于_80°C保存。 [0034]3、接种2 X IO5转染了 Rluc-JEV的BHK细胞于12孔细胞培养板中，在转染后2、12、24、48、72和96h后，收集上清完毕后分别向孔中加入Iml PBS洗一遍后，吸弃孔中PBS，并分别加入200 μ I细胞裂解液处理细胞，分别混匀孔中的细胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入 50μ1 的底物腔肠素(coelenterazine),按照 Luciferase Assay S ystem(购于Promega公司)说明书的要求使用多功能酶标仪(购于德国Thermo公司)检测Rluc的活性。 [0035]4、接种4 X IO5转染了 Rluc-JEV及JEV RNA的BHK细胞于每孔放置了三个IOmmX IOmm盖玻片的6孔板中，分别于转染后24、48、72h后用丙酮固定液(购于国药集团化学试剂公司)对细胞进行固定，使用针对黄病毒E蛋白的抗体进行免疫荧光检测，检测RN A转染至细胞后的病毒E蛋白表达情况； [0036]5、双层噬斑检测不同时间点的Rluc-JEV及JEV PO代病毒的噬斑形态及生长曲线:在6孔细胞培养板的各孔中分别接种4X IO5个VeiO细胞，24h后待细胞覆盖孔底80-90%时，吸弃孔中的培养基，加入DMEM培养基10倍比稀释的转染后不同时间点的Rluc-JEV及JEV的病毒100μ 1，37°C吸附lh。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入第一层由含有2%FBS培养基的琼脂糖覆盖物，于37°C、5%C02的培养箱中培养3天后，加入第二层含有中性红的琼脂糖覆盖物，于37°C、5%C02的培养箱中培养12h后观察噬斑形态和数量。 [0037]—种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆在抗病毒药物筛选中的应用，其步骤是: [0038]本发明选择两种已知的对黄病毒属病毒有抑制作用的药物:利巴韦林及NITD008来检测这两种药物对Rluc-JEV的抑制作用: [0039]1、利巴韦林对Rluc-JEV的抑制作用:在12孔细胞培养板每孔中接种 IX 105BHK-21细胞，在37 °C，5%C02培养条件下，待汇合度达到60%时，分别向每孔加入Rluc-JEV病毒液，感染复数MOI为0.01，37°C，5%C02培养箱中吸附Ih后，将各个孔的病毒液用枪头吸弃，分别加入用含2%胎牛血清的DMEM培养基2倍系列稀释的利巴韦林(浓度分别为0,0.25,0.5,0.25、1和2mg/ml )，于37°C，5%C02的培养箱中培养48h后分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入Iml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200 μ I细胞裂解液处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入50 μ I的底物，按照LuciferaseAssay System (前面已述)说明书的要求使用多功能酶标仪(前面已述)检测Rluc的活性。 [0040]2、NITD008对Rluc-JEV的抑制作用:在12孔细胞培养板每孔中接种I X 105BHK_21细胞，在37°C，5%C02培养条件下，待汇合度达到60%时，分别向每孔加入Rluc-JEV病毒液，感染复数MOI为0.01，37°C、5%C02培养箱中吸附Ih后，将各个孔的病毒液用枪头吸弃，分别加入用含2 %胎牛血清的DMEM培养基系列稀释的NITD008 (浓度分别为O、0.11、1、3、9和27 μ Μ),于37°C、5%C02的培养箱中培养48h后分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入ImlPBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200 μ I细胞裂解液处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入50 μ I的底物,按照Luciferase Assay System(前面已述)说明书的要求使用多功能酶标仪(前面已述)检测Rluc的活性。[0041]一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆在活体动物成像中的应用，其步骤是:[0042]取两只三周龄BALB/c小鼠，每只均经腹腔注射I X IO7PFU Rluc-JEV病毒，分别在接种病毒后的24h、48h和72h以后，每只小鼠腹腔注射1.5mg Rluc的底物腔肠素(Coelenterazine)(购于Promega公司),注射腔肠素10分钟后,将小鼠经小动物麻醉机(购于 美国Matrx公司)麻醉后放入成像暗箱，使用Xenogeri IVISr 50成像系统(购于美国精诺真公司Xenogen Corp)进行检测成像并摄取影像，应用系统配套分析软件ROI对小鼠体内细胞或组织发出的荧光进行定量分析。 [0043]一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆在乙型脑炎疫苗评价中的应用，其步骤是: [0044]取两只三周龄BALB/c小鼠，分别为实验组和对照组。实验组小鼠经腹腔注射 0.03ml乙型脑炎减毒疫苗JEV-SA14-14-2 (购于北京生物制品研究所)，对照组腹腔注射0.03mlPBS。三周后，实验组和对照组小鼠均经腹腔注射IX IO7PFU Rluc-JEV病毒，分别于注射Rluc-JEV病毒后第3天和第5天，实验组小鼠和对照组小鼠分别经腹腔注射 1.5mgRluc的底物腔肠素，注射腔肠素10分钟后，将小鼠经小动物麻醉机(前面已述)麻醉 后放入成像暗箱，使用Xenogen SVISe 50成像系统(前面已述)进行检测成像并摄取影像，应用系统分析软件ROI进行分析，比较实验组和对照组小鼠体内细胞或组织发出的荧光量。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果: [0045]1、本发明制备的带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆可以高效获得正确的病毒R NA，并解决了外源基因插入病毒基因组造成基因组不复制的现象，转录出的RNA转染细胞后，RNA可正常复制，并产生具有感染性的病毒粒子。 [0046]2、本发明中的Rluc-JEV报告病毒感染性克隆拯救出的Rluc-JEV与野生型JEV病毒有着相同的生长趋势，Rluc-JEV病毒滴度又与Rluc信号值直线相关，因此，可通过直接检测Rluc信号值，即可判断Rluc-JEV的病毒生长情况，继而反映JEV的病毒生长情况。因此，可通过检测Rluc信号来替换传统的病毒滴度测定方法，与传统的通过病毒噬斑检测病毒生长情况相比，通过检测Rluc-JEV的荧光素酶活性来反映病毒生长趋势更加快捷、更加灵敏。不仅具有极高的检测灵敏度，而且可以用低廉的实验费用在极短的时间获得预期的实验或检测结果。 [0047]3、通过药物抑制实验，证明本发明中的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV病毒是有效的药物筛选平台。与传统的药物筛选方法相比，Rluc-JEV病毒不仅有着明显的灵敏度和高效率，还可以用于高通量筛选抗病毒药物，可同时对多种药物抗病毒效果进行快速检测，缩短药物研发周期，是研发出特异性抗JEV病毒药物的有效工具。与目前应用广泛的带有报告基因的复制子系统筛选体系相比，Rluc-JEV报告病毒与带有报告基因的复制子系统一样，具有易操作、高灵敏度以及高准确性的优点，都可应用于抗病毒药物的高通量筛选。同时，Rluc-JEV报告病毒克服了复制子系统不能筛选作用靶点为病毒结构蛋白的药物的缺点:复制子系统由于缺失病毒结构蛋白基因，仅能检测作用靶点为非结构蛋白的药物；然而本发明所拯救出的Rluc-JEV病毒含有病毒全长基因组，可形成具有感染性的病毒粒子，不仅可以筛选作用靶点为非结构蛋白的药物，还能筛选出作用靶点为结构蛋白的药物，并可区分出所筛选药物的作用机制是基于病毒的复制过程还是包装过程。 [0048]4、本发明中的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV病毒可有效在动物体内进行活体成像。这项技术可以实现无损伤的在动物体内进行病毒的动态示踪，因此可以利用同一组动物进行长时间的研究，从而大大减少了实验动物的使用数量。更为有力的是，由于一系列的数据来源于同一只或同一组动物，以自身作为内对照，大大增加了数据的可靠性。通过活体动物体内成像系统，可观测到病毒在动物体内的发展进程以及药物治疗或疫苗免疫所产生的反应，可广泛应用于动物水平的药物测试和疫苗评价。通过活体动物成像系统，可以观察Rluc-JEV病毒在动物体内的繁殖部位、数量变化及对外界因素的反映；并且是同一批老鼠持续观察，可排除个体间的差异；具有更高的灵敏度，在整体上观察活体动物的感染途径；可定量比较各个器官的感染程度。 [0049]5.本发明所构建的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆，是以JEV病毒强毒株SA14株为模板所构建的，SA14病毒为强毒株，其弱毒株SA14-14-2为目前广泛使用的乙型脑炎疫苗株。通过比较JEV-SA14-14-2疫苗株病毒免疫的小鼠与未免疫对照小鼠在感染Rluc-JEV报告病毒后的动物成像结果发现，疫苗株免疫的小鼠可以抵抗Rluc-JEV病毒感染，成像结果为阴性，而未免疫对照小鼠则可以检测到明显的Rluc信号，证明本发明所构建的Rluc-JEV报告病毒系统可用于疫苗评价，未来可对新型疫苗研制进行效果评价。 [0050]因此，以本发明为基础，将为深入开展JEV的动物模型、病毒的复制机制与致病机理，抗病毒药物筛选和药物的作用机制、疫苗和诊断试剂等方面具有广泛的应用价值，因此具有十分重要的理论意义和现实意义。 【专利附图】 【附图说明】: [0051]图1为一种含有JEV病毒SA14株基因组cDNA的JEV全长感染性克隆的构建示意图。 [0052]图2为一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建示意图。 [0053]图3为一种由感染性克隆拯救出的JEV及Rluc-JEV病毒免疫荧光及噬斑形态示意图。 [0054]图4为JEV及Rluc-JEV RNA转染BHK-21细胞的病毒生长曲线，及Rluc-JEV不同时间点的Rluc信号与病毒滴度的线性关系示意图。 [0055]A =Rluc-JEV不同时间点的Rluc信号，以及JEV和Rluc-JEV转染后不同时间点的病毒生长曲线； [0056]B =Rluc-JEV不同时间点的Rluc信号与病毒滴度的线性关系，其中R2=0.986，y=0.6.[0057]图5为抗病毒药物NITD008及利巴韦林对Rluc-JEV病毒的抑制作用示意图。 [0058]A:不同浓度NITD008作用下Rluc-JEV病毒的Rluc信号； [0059]B:不同浓度利巴韦林作用下Rluc-JEV病毒的Rluc信号。 [0060]图6为Rluc-JEV感染小鼠后第1，3，5天动物活体成像示意图。 [0061]图7为JEV-SA14-14-2疫苗株免疫的实验组小鼠及未免疫对照组小鼠在感染Rluc-JEV后的体内成像示意图。 [0062]A为JEV-SA14-14-2疫苗株免疫的实验组小鼠及未免疫对照组小鼠在感染Rluc-JEV后的体内成像图； [0063]B为ROI软件分析免疫组与对照组小鼠腹腔内的Rluc信号值对比； [0064]C为ROI软件分析免疫组与对照组小鼠脑内的Rluc信号值对比。 【具体实施方式】 [0065]本实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。 [0066]实施例1: [0067]一种带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建方法，其步骤是: [0068]1 .JEV-SA14病毒株基因组序列分段合成: [0069]构建带有JEV全长基因组的cDNA感染性克隆:选择JEV-SA14 (GenBankN0.U14163.1)病毒株序列，分成四个片段进行基因合成(金唯智生物科技有限公司)，这四个片段分别命名为片段A，片段B，片段C，和片段D。其中片段A包括”T7+基因组1~3450nt ”的序列，片段B包括”基因组 Int ”的序列，片段C包括“基因组nt “的序列，片段D包括“基因组nt+HDVR”的序列。片段A中的”T7”为启动子，序列如SEQ ID N0.2所示，位于病毒基因组5’UTR之前，是为了保证构建的cDNA在体外转录得到基因组RNA。片段D中的”HDVR”为序列为丁型肝炎病毒核酶(hepatitisdelta virus ribozyme, HDVR)序列，序列如SEQ ID N0.3所不,位于病毒基因组3’ UTR之后，可将体外转录出的RNA自3’ UTR处切断，与cDNA克隆3’ UTR后面的载体序列分开，形成正确的基因组3’UTR末端，如此在体外转录出的RNA序列，即为完整的JEV基因组R NA，不含有其他非特异序列。四个片段分别用Psi I (购于美国NEB公司)和BamH I (购于美国NEB公司)插入低拷贝质粒PACYC177载体(购于美国Promega公司)，转化至大肠杆菌感受态HBlOl (购于美国Promega公司)。含有所合成基因片段的质粒均经过D NA测序鉴定为正确序列，分别命名为 pACYC-A，pACYC-B, pACYC-C 和 pACYC-D。 [0070]2、含有病毒基因组的JEV cDNA感染性克隆的构建: [0071](I) JEV基因组片段A+B的拼接:用BspE I (购于美国NEB公司)和BamH I(前面已述)酶切上述步骤I中所得的pACYC-A和pACYC-B，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)回收pACYC-A的大片段与pACYC-B的大片段，使用T hermo Scientific NanoDrop2000 (购于Thermo公司)测定DNA的浓度，使用1%琼月旨糖凝胶电泳检测DNA的质量。将pACYC-A的大片段作为载体，pACYC-B的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶(购于美国NEB公司)将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HBlOl (前面已述)，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR的鉴定反应体系为:10Xbuffer:2U1 , dNTP:0.4μ 1，引物(5，-GAATGCCCTGATGAGCACAGA-3，):0.2 μ 1，弓丨物(5，-A TGGCAAACATCAATCCA-3，):0.2 μ 1，Taq 酶:0.2 μ 1，水:16.8 μ 1，总体系 20 μ 1.扩增条件为:94°C 2min,94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 3min,72°C IOmin, 16 °C IOmi n，28 个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pACYC-A+B。[0072](2) JEV基因组片段C+D的拼接:用Xba I (购于美国NEB公司)和Xho I (购于美国NEB公司)酶切上述步骤I中所得的pACYC-C和pACYC_D，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收pACYC-C的大片段与pACYC-D的大片段，使用Thermo S cientificNanoDrop2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DN A的质量。将pACYC-C的大片段作为载体，pACYC-D的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶(前面已述)将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HBlOl (前面已述)，挑取菌落并进行 PCR 鉴定。PCR 鉴定的反应体系为:10Xbuffer:2y I, dNTP:0.4μ I,引物(5，_GGAAGGCCTGGGGGCAGGACG-3，):0.2 μ 1，引物(5，-AGATCCTGTGTTCTTCCTCAC ΤΑ-3，): 0.2 μ 1，Taq 酶: 0.2 μ 1，水:16.8 μ I，总体系 20 μ 1.扩增条件为:94°C 2min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min,72°C IOmin, 16°C IOmin, 28个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pACYC-C+D。 [0073](3) JEV基因组全长pACYC-A+B+C+D的拼接:用BamH I (前面已述)和Xho I (前面已述)酶切上述步骤中所得的pACYC-A+B和上述步骤所得pACYC-C+D，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)回收pACYC-A+B的大片段与pACYC-C+D的大片段，使用ThermoScientific NanoDrop2000 (购自Thermo公司)测定DNA的浓度,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。将pACYC-A+B的大片段作为载体，pACYC-C+D的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶(前面已述)将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101(前面已述)，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR鉴定的反应体系为:10Xbuffer:2y l,dNTP:0.4μ I,引物(5，-GTGTTTTGGGACACGCCATCC-3’): 0.2 μ 1，引物(5，-ACTAGAGCACCAAGACCCATC-3 ’):0.2 μ 1，Taq 酶:0.2 μ 1，水:16.8 μ 1，总体系 20 μ 1.扩增条件为:94°C 2min，94°C 30s,55°C 30s, 72°C 3min,72 °C IOmin, 16°C 10min，28个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的包含有JEV全长基因组的cDNA质粒(图1 )，命名为 pACYC-JEV-FL.[0074]3、带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建: [0075](I)待融合的三个目的基因的特异性扩增: [0076]①片段“T7-5’UTR-Capsid-34”的扩增:以pACYC-JEV-FL 为模板，使用 PrimeSTA RHS酶(购自Takara公司)扩增含有“T7-5’UTR-Capsid-34”的序列，引物为SEQ ID N0.5，SEQID N0.6所示。使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)分别回收DNA片段,使用Thermo Sci entific NanoDrop2000(前面已述)测定DNA的浓度，使用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20°C保存备用。 [0077]②片段”Rluc-2A”的特异性扩增:以含有Rluc基因的iNV-Rluc-r印licon”(来自Lo MK, Tilgner M, Shi PY.Potential high-throughput assay for screening inhibitorsof W est Nile virus replication J Virol.): 12901-6.)质粒为模板，使用PrimeS TAR HS酶(前面已述)扩增含有“Rluc_2A”的序列，引物为SEQ ID N0.7, SEQ IDN0.8 ;其中Rluc为海肾荧光素酶序列，序列为GenBank:HV所示，2A为口蹄疫病毒FMDV的2A自切割肽序列，序列为SEQ ID N0.4所示。使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)分别回收DNA片段，使用ThermoScientific NanoDrop2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于_20°C保存备用。 [0078]③片段” Capsid-prM-E”的特异性扩增:以pACYC-JEV-FL为模板，使用PrimeSTARHS酶(前面已述)扩增含有”Capsid-prM-E”的序列，引物为SEQ ID N0.9, SEQ ID N 0.10。使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)分别回收DNA片段,使用Thermo Scientific NanoDrop2000 (前面已述)测定DNA的浓度,使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于_20°C保存备用。 [0079](2)两步融合 PCR 法扩增” T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM_E” 片段: [0080]第一步融合PCR:片段 “T7-5，UTR-Capsid-34-Rluc_2A” 的融合 PCR 特异性扩增:以上述所得片段“T7-5，UTR-Capsid-34”和” Rluc-2A”为模板，使用PrimeSTAR HS酶(前面已述)扩增含有 “T7-5，UTR-Capsid-34-Rluc-2A” 的序列，引物为 SEQ ID N0.5, SEQ IDN0.8.使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)分别回收DNA片段,使用Thermo Scientific NanoDrop2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于_20°C保存备用。 [0081]第二步融合PCR:片段“T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E”的融合 PCR特异性扩增:以上述所得片段”Capsid-prM-E”和“T7-5，UTR-Capsid-34-Rluc_2A”为模板，使用 PrimeSTAR HS 酶(前面已述)扩增含有“T7-5，UTR-Capsid34-Rluc-2A-Capsid-prM_E”的序列，引物为SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.10.使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测P CR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(前面已述)分别回收DNA片段,使用Thermo ScientificNanoDrop2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20°C保存备用。 [0082]上述PCR扩增所用PCR仪为Biorad公司的MyCycler Thermal cycler,所用引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR的反应体系均为5XPS buffer:10 μ 1，dNTP:4μ 1，引物:0.5μ 1，引物:0.5μ 1，模板:0.5μ I, PrimeSTAR HS 酶:0.5μ 1，水:34μ I。扩增条件为:98°C 30s, 98°C 10s, 55°C 10s, 68°C 3min, 68°C IOmin, 16°C IOmin, 30 个循环。 [0083](3)将荧光素酶基因Rluc插入JEV全长感染性克隆:将“T7-5’UTR-Capsid_34-Rluc-2A-Capsid-prM-E”和 JEV 全长感染性克隆 pACYC-JEV-FL.分别用 Kpn I 和 BsrG I 双酶切。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，经过T4DNA连接酶(购自美国NEB公司)将回收的酶切产物按照片段:载体摩尔比为6:1进行连接，并将连接产物转化HBlOl感受态，将PCR鉴定阳性的克隆进行培养并抽提质粒，测序正确。至此获得的质粒即为带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆(图2)，命名为pACYC-Rluc-JEV-FL.[0084]实施例2: [0085]带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆成功拯救出与野生型病毒生长趋势相同的病毒 [0086]1、质粒的线性化和酚氯仿抽提:各取10 μ g质粒pACYC-JEV-FL和质粒pACYC-Rluc-JEV-FL,用XhoI (前面已述)酶切，37°C酶切两小时，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切完全后，向酶切产物中加入100 μ I饱和酚(购自国药集团化学试剂公司)，振荡混匀，17000g离心5min，吸取上层液体于新的离心管中，并向原离心管中加入100 μ I无菌水振荡混匀，17000g离心5吸取上层液体与上一步所得液体合并(总体积约200 μ I )，加入200 μ I氯仿(购自国药集团化学试剂公司)混匀，17000g离心5吸取上层液体于无菌进口离心管管中(约150~200 μ I),加入十分之一体积的pH5.2, 3mol/l醋酸钠(购自国药集团化学试剂公司)和2.5倍体积无水乙醇(购自国药集团化学试剂公司)混匀，_20°C放置30min,17000g离心5吸弃上清，加入lml70%乙醇洗涤，17000g离心5min，吸弃上清；室温放置15min,最后加入 11 μ I 无 RNAase 的水溶解，使用 Th ermo Scientific NanoDrop2000 (前面已述)测定DNA的浓度，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，于_20°C保存备用。 [0087]2、RNA的体外转录:各取2.5 μ g酚氯仿抽提的pACYC-JEV-FL和pACYC-Rluc-JEV线性化产物为模板，按照HmMESSAGE mMACHINE kit (购自美国Ambion公司)说明书的要求将其体外转录为RNA,使用Thermo Scientific NanoDrop2000 (前面已述)测定RNA的浓度，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，检测体外所得RNA均有明显主带后，于_80°C保存备用。 [0088]3、转染BHK-21细胞:将5 μ g体外转录的JEV和Rluc-JEV RNA采用电转的方法分别转入8X 106BHK-21细胞，分别接种4X IO5转染了 Rluc-JEV及JEV RNA的BHK细胞于每孔放置了三个IOmmX IOmm盖玻片的6孔板中进行免疫突光实验,于转染后24、48、72h分别用5%丙酮固定液(购于国药集团化学试剂公司)室温固定细胞15分钟，PBS洗三遍后，于室温环境孵育一抗，抗体为1:250倍稀释的针对黄病毒属E蛋白小鼠单克隆抗体(购于美国Millipore公司)，一抗孵育I~2h，PBS冲洗10遍后，于室温避光孵育二抗，抗体为1:125倍稀释的偶联德克萨斯红(Texs-Red)羊抗鼠抗体。孵育二抗Ih后，PBS冲洗10遍，于荧光显微镜下使用200X放大倍数进行观察(图3A)。于此同时，电转后的细胞分别接种于12孔细胞培养板中，每孔接种2 X IO5的细胞，并在转染后2、12、24、48、72h和96h收集孔中培养基(即JEV和Rluc-JEV PO代不同时间点的病毒液)，并于-80°C保存。其中转染Rluc-JEVRNA的细胞，每次收集病毒完毕后分别向孔中加入Iml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200 μ I细胞裂解液处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入50 μ I的底物,按照试剂盒说明书的要求使用多功能酶标仪(购自德国Thermo)检测Rluc的活性(图4A)。将冻存的不同时间点Rluc-JEV和JEV病毒取出，室温冻融，使用双层噬斑检测Rluc-JEV及JEV的滴度和噬斑形态，方法是:在6孔细胞培养板的各孔中分别接种4X IO5个Vero细胞，24h后待细 胞覆盖孔底80-90%时，吸弃孔中的培养基，接入DMEM培养基10倍比稀释的转染后不同时间点的Rluc-JEV及J EV的病毒100μ 1，37°C吸附Ih。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入由含有2%F BS培养基的琼脂糖上层覆盖物，于37°C、5%C02的培养箱中培养3天后，加入含有中性红的琼脂糖覆盖物，于37°C、5%C02的培养箱中培养12h后观察噬斑形态(图3B)和数量(图4A)。从图4A中可以看到，Rluc-JEV病毒生长曲线与JEV病毒生长曲线趋势相同，同时，Rluc信号值与病毒滴度也呈相同增长趋势，表明Rluc信号可以反映Rluc-JE V病毒生长情况，进而反映出JEV病毒的生长趋势。将Rluc-JEV Rluc信号值和滴度分别取对数值后，使用SPSS统计软件进行二者线性回归分析，得出Rluc-JEV病毒滴度与Rlu c信号值呈线性相关，回归方程为y=0.6，R2=0.986 (图4B)。 [0089]以下应用实施例中使用的均为pACYC-Rluc-JEV-FL拯救出的完整病毒粒子Rluc-JEV，方法参见实施例2。 [0090]实施例3: [0091]一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆在抗病毒药物筛选中的应用，其步骤是:[0092]1、NITD008对Rluc-JEV的抑制作用:在12孔细胞培养板每孔中接种I X 105BHK_21细胞，在37°C，5%C02培养条件下，待汇合度达到60%时，分别向每孔加入Rluc-J EV病毒液，感染复数MOI为0.01，37°C、5%C02培养箱中吸附Ih后，将各个孔的病毒液用枪头吸弃，分别加入用含2%胎牛血清的DMEM培养基系列稀释的NITD008 (浓度分别为0、0.11、1、3、9和27 μ Μ),于37°C、5%C02的培养箱中培养48h后分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入ImlPBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200 μ I细胞裂解液处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入50 μ I的底物,按照Luciferase Assay System说明书的要求使用多功能酶标仪检测Rluc的活性(图5A)。通过对Rluc的活性检测发现，随着NITD008浓度的增加，Rluc信号值逐渐减弱，表明NITD008抑制JEV病毒生长呈现浓度依赖性。 [0093]2、利巴韦林对Rluc-JEV的抑制作用:在12孔细胞培养板每孔中接种 1X 105BHK-21细胞，在37 °C，5%C02培养条件下，待汇合度达到60%时，分别向每孔加入Rluc-JE V病毒液，感染复数MOI为0.01，37°C，°C，5%C02培养箱中吸附Ih后，将各个孔的病毒液用枪头吸弃，分别加入用含2%胎牛血清的DMEM培养基2倍系列稀释的利巴韦林(浓度分别为0、0.25,0.5,0.25、I和2mg/ml )，于37°C，5%C02的培养箱中培养48h后分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入Iml PBS后吸弃孔中PBS，并分别加入200 μ I细胞裂解液处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入50 μ I的底物，按照Luciferase Assay System说明书的要求使用多功能酶标仪检测Rluc的活性(图5B)。图中结果显不，随着利巴韦林浓度的增加，Rluc信号值逐渐减弱,表明利巴韦林抑制JEV病毒生长也呈现浓度依赖性。 [0094]以上两种药物均是已报道的对黄病毒生长有抑制作用的药物，通过检测不同浓度作用下Rluc-JEV病毒的Rluc信号值,发现随着药物浓度增加，Rluc信号值均呈下降趋势，说明Rluc-JEV病毒的生长受到了抑制，这与已报道的药物抑制野生型JEV病毒的结果相同。因此，实验表明:本发明所构建的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV报告病毒能够用于抗JEV的药物筛选，且灵敏度更强，检测效率更高。 [0095]实施例4: [0096]一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆在动物体内成像中的应用，其步骤是: [0097]取两只三周龄BALB/c小鼠，每只均经腹腔注射I X IO7PFU Rluc-JEV病毒，分别在接种病毒后的24h、48h和72h以后，每只小鼠腹腔注射1.5mg Rluc的底物腔肠素(Coelenterazine)(购于Promega公司),注射腔肠素10分钟后,将小鼠经小动物麻醉机(购于美国Matrx公司)麻醉后放入成像暗箱,使用Xenogen IVIS8 50成像系统(购于美国精诺真公司Xenogen Corp)进行检测成像并摄取影像(图6)。从成像图像中显示，病毒感染后第一天，即可在小鼠的脑部和腹腔检测到Rluc阳性信号，说明病毒在小鼠体内正常扩增；到病毒感染后第三天，小鼠体内呈现强阳性Rluc信号，说明病毒在小鼠体内大量扩增并持续感染周围组织和细胞；到病毒感染后第五天，小鼠体内仍可观察到阳性Rluc信号，与第三天相比，信号强度及范围有所下降，提示随着时间延长，小鼠体内产生免疫应答，产生特异性抗体，将病毒中和。因此，根据实验结果可以看出，本发明所构建的Rluc-JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV病毒可实现病毒在小鼠活体内进行动态观察，可观测到病毒在动物体内的发展进程，具有广泛的应用价值。 [0098]实施例5:[0099]一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆在乙型脑炎疫苗评价中的应用，其步骤是:[0100]取两只三周龄BALB/c小鼠，分别为实验组和对照组。实验组小鼠经腹腔注射 0.03ml乙型脑炎减毒疫苗JEV-SA14-14-2 (购于武汉生物制品研究所)，对照组腹腔注射0.03ml PBS。三周后，实验组和对照组小鼠均经腹腔注射I X IO7PFU Rluc-JEV病毒，分别于注射Rluc-JEV病毒后3天和5天,每只小鼠腹腔注射1.5mg Rluc的底物腔肠素(前面已述)，注射腔肠素10分钟后，将小鼠经小动物麻醉机麻醉后放入成像暗箱放入成像暗箱，使用Xenogen IVISb 50成像系统进行检测成像并摄取影像(图7A)，应用系统分析软件ROI进 行分析，对实验组小鼠和对照组小鼠体内腹腔(图7B)及脑部(图7C)的荧光进行定量。结果显示，经过JEV-SA14-14-2疫苗株免疫的实验组小鼠可以抵抗Rluc-JEV病毒的感染，活体成像结果为阴性背景，而在对照组小鼠体内，Rluc-JEV则可正常扩增，呈现出强阳性信号。ROI软件分析显示，在脑内和腹腔，对照组小鼠体内Rluc信号值可达到IO7至108，而经过疫苗株免疫的实验组小鼠，脑内和腹腔的Rluc信号则为阴性。证明JEV-SA14-14-2疫苗株的免疫，使小鼠获得了抵抗JEV病毒感染的能力。因此，实验表明:本发明所构建的带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV报告病毒可观测到病毒在动物体内的发展进程，实现直观观察病毒在小鼠体内经过疫苗免疫所产生的反应，可广泛应用于动物水平的乙型脑炎疫苗评价。 【权利要求】 1.一种带有荧光素酶基因的JEV感染性克隆pACYC-Rluc-JEV-FL，其序列为SEQ IDN0.1所示。 2.权利要求1所述感染性克隆的构建方法，其步骤如下: 1)JEV-SA14病毒株基因组序列分段合成: 构建带有JEV全长基因组的cDNA感染性克隆:选择JEV-SA14病毒株序列，GenBank N0.U14163.1;分成四个片段进行基因合成，这四个片段分别命名为片段A，片段B，片段C，和片段D，其中片段A为T7+基因组I~3450 nt序列，片段B为基因组 nt序列，片段C为基因组 nt序列，片段D为基因组 nt+ HDVR序列；T7启动子序列如SEQ ID N0.2所示，HDVR序列为SEQ ID N0.3所示，四个片段分别用Psi I和BamH I插入低拷贝质粒pACYC177载体，转化至大肠杆菌感受态HBlO ;质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为pACYC-A，pACYC-B, pACYC_C和pACYC_D ; 2)含有病毒基因组的JEVcDNA感染性克隆的构建: (1)JEV基因组片段A+B的拼接:用BspE I和BamH I酶切上述步骤I)中所得的PACYC-A和pACYC-B，回收pACYC_A的大片段与pACYC_B的大片段；将pACYC-A的大片段作为载体，pACYC-B的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pACYC- A+B ； (2)JEV基因组片段C+D的拼接:用XbaI和Xho I酶切上述步骤I)中所得的pACYC_C和pACYC-D，回收pACYC-C的大片段与pACYC_D的大片段；将pACYC_C的大片段作为载体，PACYC-D的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HBlOl，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pACYC-C+D ； (3)JEV基因组全长pACYC- A+B+C+D的拼接:用BamH I和Xho I酶切上述步骤中所得的pACYC-A+B和上述步骤所得pACYC-C+D，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pACYC-A+B的大片段与pACYC-C+D的大片段；将pACYC-A+B的大片段作为载体，pACYC-C+D的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HBlOl，挑取菌落并进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的含有JEV全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-JEV-FL ； 3)带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的构建: (1)待融合的三个目的基因的特异性扩增: ①片段T7-5’UTR-Capsid-34 的扩增:以 pACYC-JEV-FL 为模板，使用 PrimeSTAR HS 酶扩增含有T7-5’UTR-Capsid-34的序列，引物为SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.6所示，回收DNA片段； ②片段R1UC-2A的特异性扩增:以含有1?111(3基因的1附-1?111(3-1'印1化011质粒为模板，使用PrimeSTAR HS酶扩增含有Rluc_2A的序列，引物为SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8，回收DNA片段； ③片段Capsid-prM-E的特异性扩增:以pACYC-JEV-FL为模板，使用PrimeSTARHS酶扩增含有Capsid-prM-E的序列，引物为SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10，回收DNA片段； (2)两步融合PCR 法扩增 T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A- Capsid-prM-E 片段:第一步融合PCR:片段T7-5，UTR-Capsid-34-Rluc-2A的融合PCR特异性扩增:以上述所得片段T7-5’ UTR-Capsid-34和Rluc_2A为模板，使用PrimeSTAR HS酶扩增含有T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A 的序列，引物为 SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.8，回收 DNA 片段； 第二步融合 PCR:片段 T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E 的融合 PCR 特异性扩增:以上述所得片段Capsid-prM-E和T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc_2A为模板，使用PrimeSTAR HS 酶扩增含有 T7-5’ UTR-Capsid34-Rluc-2A- Capsid-prM-E 的序列，引物为SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.10，回收 DNA 片段； (3)将荧光素酶基因Rluc插入JEV全长感染性克隆:将T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E和JEV全长感染性克隆pACYC-JEV-FL分别用Kpn I和BsrG I双酶切，使回收酶切产物，经过T4 DNA连接酶将回收的酶切产物按照片段:载体摩尔比为6:1进行连接，并将连接产物转化HBlOl感受态，将PCR鉴定阳性的克隆进行培养并抽提质粒，测序正确，获得的质粒即为带有荧光素酶基因的JEV病毒感染性克隆。 3.权利要求1所述的感染性克隆在活体动物成像中的应用。 4.权利要求1所述的感染性克隆在抗病毒药物筛选的应用。 5.权利要求1所述 的感染性克隆在乙型脑炎疫苗评价的应用。 【文档编号】G01N21/64GKSQ 【公开日】日 申请日期:日 优先权日:日 【发明者】张波, 李晓丹, 秦成峰, 李晓峰, 袁志明, 邓成林, 单超, 叶寒青 申请人:中国科学院武汉病毒研究所