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SDS—PAGE法测定红细胞膜蛋白的4种CB染色法的探讨与改进的用户评论
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非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)电泳,PAGE,page,凝胶电泳
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非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)
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3秒自动关闭窗口【求助】关于膜蛋白SDS-PAGE电泳 - 经验共享 - 分析测试百科网 - 分析测试百科网
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【求助】关于膜蛋白SDS-PAGE电泳
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最近在提细菌膜蛋白做SDS-PAGE电泳，用的是超速离心法，膜蛋白用10mM的Tris缓冲液（ph 7.0)，2％Trintionx－100溶解。每孔80ug左右蛋白做SDS-PAGE电泳却看不到条带。我原来是加sds加样缓冲液跟样品煮3min，但是发现沉淀较多，后来没有煮，直接跑电泳，考马斯亮蓝染色，但是结果都一样，没有条带，只在胶的底部看到很多smear一样的东西。我估计是膜蛋白溶解性太差的原因。哪位战友能帮我想办法解决这个问题？查看完整版本请点击这里：
hustwb ( 21:56:44)
似乎urea对膜蛋白的溶解性很差的
对楼主建议
1） 先做个western确定下目标蛋白是否表达？ 因为膜蛋白表达量教低，即使过量表达也只有1mg/l 甚至更低 SDS检测不到很正常
2） 保证每步都加有PMSF或者相应蛋白酶抑制剂 避免被降解
3） 换表面活性剂。不同膜蛋白适用的表面活性剂不同 参考文献的选择吧
不过没有参考的话 一般DDM是优先选择的。。。尤其对于a-helix膜蛋白。。
兔纸 ( 21:57:02)
楼主做的什么菌?
菌是如何破碎的?
用什么方法测定的蛋白浓度?
超速离心离了几次?
另外,上样前最好还是和上样缓冲煮一下
BUK ( 21:57:41)
谢谢各位！我做的是金葡菌，不是做蛋白表达。参照文献，我先用溶菌酶加溶葡萄球菌菌先溶菌，再超声破碎，BCA测定蛋白浓度，超速离心100000g，1h，只一次。我不做western,但是western我做过，目的蛋白是有的。我做的是直接sds-page电泳。我看到有人说4M尿素加在分离胶里可以增加膜蛋白在分离胶的溶解度。不知道行不行。我想试一下。
daod ( 21:58:10)
我看到一篇文献是在E.coli里表达膜蛋白的，但是也说到了样品的处理方法。你可以参考一下，因为文献我也没有仔细看，就是看了下处理方法。发上来做个参考。
兔纸 ( 21:59:56)
QUOTE:原帖由 BUK 于
21:57 发表
谢谢各位！我做的是金葡菌，不是做蛋白表达。参照文献，我先用溶菌酶加溶葡萄球菌菌先溶菌，再超声破碎，BCA测定蛋白浓度，超速离心100000g，1h，只一次。我不做western,但是western我做过，目的蛋白是有的。我做的是直接sds-page电泳 ...
很多破碎用的是french pressure,G+的是不太好破碎,破碎过程中尽量保持低温。另外，你离心后重新悬浮起来，再离心一次，有助于去除一些杂质。我没加过尿素，不知道效果如何，不过缓冲pH尽量保持在7.5-8.0之间吧。样品最好煮一下，上样前在离心
兔纸 ( 22:00:17)
楼上给的TNG buffer可以试一下
BUK ( 22:00:38)
问题解决，方法仍然不变，只是换了以前买的南京凯基膜蛋白抽提试剂盒的suspension buffer 溶解膜蛋白，sds－page效果良好。
查看完整回复请点击这里：您所在位置： &
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中华绒螯蟹精子膜蛋白的提取分离和部分生化性质研究.pdf 53页
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中华绒螯蟹精子膜蛋白的提取分离和部分生化性质研究
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硕士学位论文
中华绒螯蟹精子膜蛋白的提取分离及部分生化性质研究
姓名：程立均
申请学位级别：硕士
专业：水生生物学
指导教师：康现江
成熟精子的质膜表面含有多种蛋白 有些是精子本身所固有的 有些是在精
子成熟过程中黏附到精子表面的 这些精子膜蛋白在维持精子形态结构完整 完
成精子的新陈代谢和生殖功能中发挥着重要的作用 特别是与精卵识别 结合以
及质膜融合等受精活动密切相关
本文以我国重要的淡水养殖珍品──中华绒螯蟹 Eriocheir sinensis
验材料 从提取 分离 生化性质分析等几个方面对精子膜蛋白进行了初步的研
究 首先 通过分级分离和比较电泳的方法对中华绒螯蟹精荚各部分的蛋白组分
进行分析 并在试验过程中 建立起一套精荚分级分离的方法 通过电泳分析和
透射电镜观察等手段对这一方法的可行性进行了验证 其次 利用超声波匀浆和
蔗糖密度梯度离心的方法对中华绒螯蟹的精子膜进行了分离纯化 并利用透射电
镜技术对精子膜分离纯化的效果进行了研究 最后 利用去污剂溶脱的方法从中
华绒螯蟹精子膜表面提取得到膜蛋白 并对其部分生化性质进行研究
实验结果显示 通过分级分离所得的精液 精荚基质和纯品精子等各个部分
在SDS电泳图谱上均显示出不同的特征性谱带 且试验的重复性较好 证
明本实验建立的精荚分级分离的方法是可行的 对精液 精荚基质蛋白组分的
PAS糖蛋白染色结果显示 精液中主要的蛋白组分均为糖蛋白 共有3种 精荚
基质中有2种主要的蛋白组分是糖蛋白 这一实验结果与精液的营养功能一致
同时也表明 精荚基质除了对精子具有保护作用外 还可能含有精子在其中进行
新陈代谢所需要的营养物质 通过对精荚和分级分离得到的精子样品进行透射电
镜观察 研究发现 分级分离所得的精子绝大多数形态结构未发生变化 质膜结
构保持完整 这一结果进一步证明了通过分级分离方法获取精子的可行性 也为
接下来的膜蛋白提取研究奠定了基础 另外 利用超声波匀浆和蔗糖密度梯度离
心法成功地纯化得到了中华绒螯蟹的精子膜 经透射电镜观察发现 所得的精子
膜均一性很好 使用含1
TritonX-100和少量SDS的膜蛋白提取缓冲液对中华
绒螯蟹精子膜蛋白进行溶脱提取 对所得的膜蛋白溶液进行SDS电泳分析
结果显示 中华绒螯蟹的精子至少含有11种不同的膜多肽组分 对这些精子膜
蛋白组分的部分生化性质进行分析 结果表明 中华绒螯蟹精子膜蛋白是一组具
酸性等电点的低分子量糖蛋白 分子量在38~83ku之间 等电点在4.8左右
本文在中华绒螯蟹精子膜的分离纯化 精子膜蛋白的提取分离 及其生化性
质的测定分析等方面进行了初步的研究和探索 各种精子膜蛋白在受精过程中的
具体作用 仍有待于进一步的研究
关键词 中华绒螯蟹 精子膜蛋白 糖蛋白 SDS超微结构 生化性质
Extraction and characterization of
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&&Tricine-SDS-PAGE电泳结果分析，
Tricine-SDS-PAGE电泳结果分析，
做了一个小分子的电泳，海洋酵母的，marker还可以，不知道为什么样品，特点是小分子特别差，是不是盐分高了？方法是按照nature的方法做的，还是有别的原因，谢谢大家啊。。。。。
未标题-1.jpg
谢谢牧炀的意见。
分离胶的浓度具体调多少，根据你的经验，多谢
第一天制胶，第二天才上的样，胶的凝固应该可以
加样我减少一下吧
多谢啊。。。。。:hand:
哦，我减少上样量试试
变性的话，是按照nature上说的37 °C for 15 min or for up to 60 min，还是煮沸3-5min啊？
我的上样buffer就是nature文献上的，我指的是我的样品是海洋材料，是不是样品中的盐分有点高啊。
谢谢你的建议。
我之前跑的时候大概都是1.5%这样的幅度下调的&&胶我很少用过夜冷藏的&&你试下胶凝完半小时后就上样跑下&&因为你的图上条带扭曲的总觉的是因为胶中间凝的不是很好导致的&&上样量可以考虑减少一半&&我是做海洋生物的血红蛋白的&&变性选择煮沸五分钟的&&上样减少的话&&增加样品缓冲液的比例就好&&不然到时候条带也会看不出来的
谢谢。。。。
我再试一下，减少上样量
是什么材料部重要，主要看你提取蛋白样品的缓冲液里的成分。煮沸对膜蛋白变性不好，容易聚集。可溶蛋白的话可以煮沸。
哦，多谢，长见识不少
我的样品是乙醇沉淀后，0.01 M的 Tris-HCl （pH8.6）溶解的，不知道影响大不大？多谢 cicelyzh的指点。。。。
应该是制样的问题，我又降低上样量跑了一下，分子量3.5k的marker跑了出来，但是10k以下的样品还是不清楚。
其中7是marker，最低分子量3.5；& & 1、4、8是乙醇沉淀后tris-cl溶解的，其他的是tris-cl研磨液。
为什么会出现这样的结果呢，谢谢了。。。。
你的样品只是溶解在tris里，应该不是盐的问题。不知道你的loading buffer用的什么pH。如果是在pH6.8的tris里的话，样品最好也溶解在pH为6.8的Tris里。如果loading buffer不含tris，最好也把样品溶在pH6.8的tris里，与浓缩胶的pH一致。
谢谢jineijin1227，
1.上样量我做一下梯度试试
2.marker弯曲可能是分离胶上缘不整齐，（胶是配了2h后用的，应该不存在凝固不完全的问题）
3.样品变性时，我分别用了37度45min，50度30min，煮沸4min，效果都一样，应该是样品本身的问题，再提一下试试吧。
请问浓度过高的盐对普通SDS-PAGE有什么影响，我的实验目的条带也跑不出来，当时BMMY中加了磷酸钾缓冲液，看了您的回复，猜测是不是我的样品中有钾离子的原因。请赐教啊！万分感谢。
是的。有钾离子对胶的影响比较大，会让SDS沉淀聚集，破坏蛋白表面的负电荷。如果可能，尽量避免使用磷酸钾。必须要用的话，最好可以在跑SDS-PAGE前除去。
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