网易云大神们的神评论 - 歌单 - 网易云音乐
网易云大神们的神评论
播放：1031次
喜欢这个歌单的人
网易云音乐多端下载
同步歌单，随时畅听320k好音乐
网易公司版权所有(C)杭州乐读科技有限公司运营：
违法和不良信息举报电话：6
举报邮箱：当前位置： >>
几种天然抗氧化剂抗氧化性能比较研究
江南大学 硕士学位论文 几种天然抗氧化剂抗氧化性能比较研究 姓名：梁云 申请学位级别：硕士 专业：食品科学 指导教师：王洪新
摘要摘要天然抗氧化剂因其无毒无害无副作用等优点越来越受到青睐。除了作为食品添加剂 防止油脂及含油食品氧化外，天然抗氧化剂还因能够清除人体内自由基而具有延缓衰老 预防疾病的作用。目前，人们对多种天然抗氧化剂的抗氧化活性已进行了深入的评价研 究，取得很多成果，但对几种天然抗氧化剂的综合比较研究较少。本文选取有代表性的 天然抗氧化剂Ｖｃ、ＶＥ、茶多酚（ＴＰ）、迷迭香提取物、１３．胡萝卜素、番茄红素以合成抗 氧化剂叔丁基对苯二酚（ＴＢＨＱ）为对照，比较研究了它们在不同体系中的抗氧化性及协同作用。首先用烘箱法比较研究它们在三种食用油脂体系中的抗氧化性，结果表明在菜油和 豆油中抗氧化顺序基本相同：ＴＢＨＱ＞ＴＰ＞迷迭香提取物＞番茄红素＞Ｖｃ≈Ｂ．胡萝卜素 ≈ＶＥ，ＴＢＨＱ、ＴＰ、迷迭香提取物对菜油和豆油有很好的抗氧化能力；在猪油中ＴＢＨＱ、 ＴＰ、迷迭香提取物、Ｖｅ均表现出很好的抑制猪油氧化的效果。抗氧化影响因素比较研 究结果表明：８０＂０高温能显著降低ＴＢＨＱ、ＴＰ、迷迭香提取物在豆油中的抗氧化能力； ０．２％水分除对Ｂ．胡萝卜素的抗氧化效果有显著的增强作用，对其它影响较小；２ 对番茄红素在豆油中的抗氧化性有很大负作用。 其次在离体实验体系中研究单一抗氧化性，用不同方法评价比较各抗氧化剂清除自 由基能力。结果为ＤＰＰＨ法：ＴＰ＞ＴＢＨＱ＞Ｖｃ＞迷迭香提取物＞ＶＥ＞番茄红素＞Ｂ．胡萝 卜素；由ＰＭＳ．ＮＡＤＨ体系产生超氧阴离子还原ＮＢＴ的方法只适用于测定ＴＰ、迷迭香 提取物对超氧阴离子的清除能力，且ＴＰ的清除能力远远大于迷迭香；邻二氮菲一Ｆｅ２＋ 分光光度法不能准确测定ＴＰ、迷迭香提取物、番茄红素、Ｂ．胡萝卜素清除羟自由基的能力。ｍｇ／ｋｇＦｃ３＋会明显降低ＴＢＨＱ、ＴＰ、迷迭香提取物、番茄红素在豆油中的抗氧化性：０．２ｍｇ／ｋｇＣｕ２＋最后在菜油体系中协同抗氧化实验表明：Ｖｅ与ＶＥ、ＴＰ、迷迭香提取物、Ｂ．胡萝卜 素、番茄红素间均有正协同作用，且Ｖｃ与ＶＥ的正协同作用最强；ＶＥ与Ｂ．胡萝卜素、番茄 红素，ＴＰ与迷迭香提取物间有正协同作用；其它组合间有负协同作用。ＴＰ和迷迭香提取物添加量分别为０．０１５％、０．００５％时，１６ ｄ后油样的ＰＶ值达到１２．９８ ｍｅｑ／ｋｇ为最小，说明ＴＰ与迷迭香提取物添加比例为３：１时抗氧化效果最好。 关键词：天然抗氧化剂 抗氧化油脂 自由基协同效应ＡｂｓｔｒａｃｔＡｂｓｔｒａｃｔＮａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｂｅｃｏｍｅ ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｐｏｐｕｌａｒ ｓｉｎｃｅ ｔｈｅｙ ｈａｖｅ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｖｅ，ｂｙａｎｄｎｏｎ―ｓｉｄｅ－ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｂｅｓｉｄｅｓ ｉｔＣａｌｌｐｒｅｖｅｎｔ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｉｌ ａｎｄ ｆａｔｓａｓｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉ―ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｔｈｅｆｌｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ ｂｏｄｙ ｎａｔｕｒａｌａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ Ｃａｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓｔｕｄｉｅｓｏｎｅｏｎｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｕｐ ｍａｎｙｔｏ ｎｏｗ，ｐｅｏｐｌｅ ｈａｖｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｄｅｅｐｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｋｉｎｄｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｏｎｈａｖｅ ｍａｄｅ ｇｒｅａｔａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ，ｗｈｉｌｅ ｒｅｐｏｒｔｅｄ．ｔｈｅｉｒｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓｓｅｖｅｒａｌ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｈａｖｅ ｓｅｌｄｏｍ ｂｅｅｎＳｅｖｅｒａｌ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｓｕｃｈ ａｓ Ｖｃ、Ｖｎ、ＴＰ、ｒｏｓｅｍａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂ－ｃａｒｏｔｅｎｅａｎｄ ｌｙｃｏｐｅｎｅ ｗｉｔｈ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ＴＢＨＱ ａｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ．ｏｉｌ ｔｈｅｏｎＦｉｒｓｔｌｙ，ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ，ｓｏｙｂｅａｒｌａｎｄｌａｒｄ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＯＶｅｎ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｎｏｉｌｒａｐｅｓｅｅｄ ａｎｄ ｓｏｙｂｅａｎａｎｄＶｃａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅｏｒｄｅｒ：ＴＢＨＱ＞ＴＰ＞ｒｏｓｅｍａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ＞ｌｙｃｏｐｅｎｅ＞Ｖｃ≈Ｂ－ｃａｒｏｔｅｎｅｓ－－－－ＶＥ．Ｗｈｉｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｒｄ，ＴＢＨＱ、ＴＰ、ｒｏｓｅｍａｒｙｅｘｔｒａｃｔｓｈａｄ ｇｏｏｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｔｈｅｔｈａｔ：ｉｔｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙｏｎａｎｔｉｏｘｉｄ―ａｎｔ ｆａｃｔｏｒｓｓｈｏｗｅｄｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＴＢＨＱ、ＴＰａｎｄｒｏｓｅｍａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔｓｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ ａｔ ｔｈｅｈｉ曲ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ８０℃；Ｔｈｅ ０．２％ｗａｔｅｒ ｃｏｕｌｄ ｏｎｌｙｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ ａｎｄ ｈａｄ ｆｅｗ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｓ ａｎｄ ｌｙｃｏｐｅｎｅ，２ ｍｇ／ｋｇ Ｆｅ３＋ｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｂ―ｃａｒｏｔｅｎｅ’Ｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｈａｄａａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ；Ｆｏｒ ＴＢＨＱ、ＴＰ、ｔｈｅｉｒｏｎｒｏｓｅｍａｒｙａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，０．２ ｍｇ／ｋｇ Ｃｕ２十ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓｔｈｅ ｌｙｃｏｐｅｎｅ’Ｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｙｂｅａｒ ｏｉｌ．ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅＳｅｃｏｎｄｌｙ，ｔｈｅｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄｓｔｕｄｉｅｄｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｓｓａｙｅｓ，ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ＞Ｖｎｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＤＰＰＨ ｒａｄｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗａｓＴＰ＞ＴＢＨＱ＞Ｖｅ＞ｒｏｓｅｍａｒｙ＞ｌｙｃｏｐｅｎｅ＞Ｂ―ｃａｒｏｔｅｎｅ．ＰＭＳ－ＮＡＤＨｄｅｏｘｉｄｉｚｅ ＮＢＴ．Ｔｈｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎｒａｄｉｃａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＴＰｓｙｓｔｅｍｃａｎｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ ｗｈｉｃｈＣａｎｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ Ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｄｒｏｓｅｍａｒｙｅｘｔｒａｃｔｓ，ａｎｄｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＴＰ Ｗａｓ ｍｕｃｈｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅｒｏｓｅｍａｒｙｅｘｔｒａｃｔｓ．Ｂｕｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅｕｓｅｄｔｈｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆＴＢＨＱ，Ｖｃ，ＶＥ，ｌｙｃｏｐｅｎｅ ａｎｄ １３一ｃａｒｏｔｅｎｅ．１，１ ０一Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅｔｈｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＴＰ，ｉｎ ｔｈｅ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ：ｔｈｅｒｅｅｘｔｒａｃｔ、－Ｆｅ２十ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｓｓａｙｃｏｕｌｄｎｏｔ ｅｖａｌｕａｔｅｒｏｓｅｍａｒｙｅｘｔｒａｃｔｓ，１３一ｃａｒｏｔｅｎｅ ａｎｄ ｌｙｃｏｐｅｎｅ． ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎＦｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｙｎｅｒｇｉｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｖｃ ａｎｄ ＶＥ，ＴＰ，ｒｏｓｅｍａｒｙＶＥ ａｎｄ １３－ｃａｒｏｔｅｎｅ、ｌｙｃｏｐｅｎｅ，ＴＰ ｗａｓ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ，ａｎｄＢ－ｃａｒｏｔｅｎｅ，ｌｙｃｏｐｅｎｅ。ａｎｄｒｏｓｅｍａｒｙａｎｄｅｘｔｒａｃｔｓ，ｔｈｅ ｔｈｅ ｓｙｎｅｒｇｙ ｎｅｇａｔｉｖｅｂｅｔｗｅｅｎＶＥａｎｄＶｃｂｅｔｗｅｅｎ ｏｔｈｅｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅｓｙｎｅｒｇｉｅｓ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｎｄ Ｖｃ ｗｅｒｅ ｂｅｔｔｅｒ．Ｗｈｅｎ ａｄｄｅｄ ｗａｓｌ２．９８ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｖｃ ａｎｄ ｒｏｓｅｍａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔｓ，ＴＰｒｏｓｅｍａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔｓ，ＴＰｔｏｔａｌ ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｗａｓ Ｏ．０２％，ＰＶ ｏｆ ｏｉｌ ｗｉｔｈ ０．０１ ５％ＴＰａｎｄ ０．００５％ｒｏｓｅｍａｒｙｍｅｑ／ｋｇ，ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＫｅｙｗｏｒｄｓ：ｎａｔｕｒａｌ ｅｆｆｅｃｔａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｔ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ．ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ，ｏｉｌａｎｄ ｆａｔｓ，ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌ，ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ，ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃＩＩ独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料．与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：黎么日期：衣矽驴年多月¨日关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致．保密的学位论文在解密后也遵守此规定． 签名：翌墨导师签名：日易 罢纱￡ ／－期：２细占．么． ｜１第一章绪论第一章绪论前言１８９８年，Ｓ．Ｉ．Ｂｉｇｅｌｏｗ发现少量的亚硫酸钠做还原剂可以保护对氧化敏感的材料，并 最早提出了“抗氧化剂＂的概念【１１。上个世纪四十年代，一些天然物质如橡胶树脂首先 成为被应用于动物油脂特别是猪油的食品抗氧化剂。食品抗氧化技术始于上世纪四十年 代末五十年代初，以使用合成抗氧化剂ＢＨＡ（丁基羟基茴香醚）为代表有力的推动了食品 工业的发展。 美国食品药物管理局（ＦＤＡ）明确规定，食品抗氧化剂是指延滞因氧化而引起的劣变、 酸败或变色的物质。美国早在１９４７年就开始使用抗氧化剂来稳定油脂以及含油脂较多的 食品【２．３】。添加抗氧化剂已成为贮存食品的有效手段，它能够延缓甚至阻遏食品由于空 气的氧化作用而引起的氧化腐败，并对维生素类和必需氨基酸等一些易氧化的营养成分 起保护作用［４羽。早期应用的合成抗氧化剂如ＢＨＴ（－－丁基羟基甲苯）、ＢＨＡ和ＴＢＨＱ（叔 丁基对苯二酚）等由于具有产量大、价格低、抗氧化较强的优点，长期以来一直垄断着 食品抗氧化剂的市场。然而，不断有人对人工合成的抗氧化剂的安全性提出质疑，并对 其可能存在的毒性进行了一系列的研究，结果表明，人工合成的抗氧化剂具有一定的毒 性和致癌作用【７－９】，因此食品科学家将研究的重心转移到天然抗氧化剂的研究上来。 天然抗氧化剂是从天然动、植物体或其代谢物中提取出来的具有抗氧化活性的物质【１０１，如从植物中提取的多酚类、黄酮类化合物，植酸等。自１９５６年Ｈａｎｎ一１１】提出衰老的自由基学说以来，愈来愈多的研究证实机体内过多的自由基会引发各种病变如：动脉粥 样硬化、心血管疾病及肿瘤等，而适当补充外源性抗氧化剂可改善这一状况【１２。４１。因此， 以天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂是今后食品抗氧化剂发展的趋势；同时寻找清除体内 自由基的天然物质也是现代医药、保健行业发展趋势【ｌ５１。本文以合成抗氧化齐ＵＴＢＨＱ为对照选取ＶＣ、ＶＥ、茶多酚、迷迭香提取物、Ｂ．胡萝卜 素、番茄红素六种天然抗氧化剂做功能和机理的比较研究。１．１几种抗氧化剂简介国内外科技工作者一直在对香辛料、食用植物、中草药等十余类数百种天然物质的 抗氧化能力进行研究，并取得了许多研究成果。下面概述了选取的抗氧化剂的结构或组 成、理化性质、生理功能等。１．１．１ＴＢＨＱ（叔丁基对苯二酚）ＴＢＨＱ【ｌｑ（Ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）学名为叔丁基对苯二酚亦称叔丁基氢醌，为白色晶体，较之ＢＨＡ，ＴＢＨＱ在空气中更容易氧化为米色粉末，氧化严重时为褐色。溶于油、 乙醇、乙醚，难溶于水，溶解度随温度升高而增大。添加于任何油脂均无异味、异臭， 其热稳定性优于ＢＨＡ和ＢＨＴ，且与碱土金属不发生呈色及风味方面的变化。其结构式【ｌ ８】如图１．１：江南大学硕士学位论文Ｃ（ＣＨ３）３ｏＨ图１－１ＴＢＩｔＱ分子结构式Ｆｉｇ．１－１Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆＴＢＨＱＴＢＨＱ是化学合成抗氧化剂，Ｔ１９７２年在美ｍ＿＃－－空ＦＤＡ批准用于肉类、家禽产品的抗 氧化【１７１，我国于１９９１年开始使用。ＴＢＨＱ分子中有两个酚羟基，在抑制氧化的过程中，提供两个氢后自身可形成稳定的耐１８１如图１．２：Ｃ（ＣＨ３），．Ｈ。＿＿＿－－－－－－－■●ｏｏＨｏＨ西◇Ｃ（ＣＨ３）３。Ｈ。Ｃ｛ＣＨ４）３＇＿－＿＿?－＿?＿＿－－Ｏ图１－２ ＴＢＨＱ的抗氧化机理Ｆｉｇ．１－２ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆＴＢＨＱ尽管ＴＢＨＱ对各种油脂和含脂食品都有较好的抗氧化效果，但在动物实验中发现其有致 突变的可能，因此ＦＡＯ／ＷＨＯ于１９９６年对ＴＢＨＱ重新评价。鉴于ＴＢＨＱ的致突变性尚无一 致的实验结果，因此ＴＢＨＱ目前仅为美国、巴西、韩国、中国、南非等国家允许使用， 所有欧洲国家均未批准使用【３】。１．１．２ ＶｃＶｃ又称Ｌ抗坏血酸（Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ），是一种水溶性的维生素，在自然界中存在还 原型抗坏血酸和氧化型脱氢抗坏血酸两种形式【１９１。ＶＣ为白色或略带淡黄色的结晶或粉 未，无臭有酸味，熔点１９０＂－＂１９２℃（分解）；易溶于水，微溶于乙醇和甘油，不溶于有 机溶剂。干燥状态比较稳定，但在水溶液中易受空气中的氧气氧化而分解。因其还原特 性而极不稳定，容易被热或氧化剂所氧化，在中性或碱性溶液中尤甚；光、微量重金属 （尤其是Ｆｅ、Ｃｕ）或荧光物质（如核黄素）更能促进其被氧化【２０１。 Ｖｃ是一种不饱和的多羟基六碳化合物（己糖内酯），分子结构如图１．３，在其分子中２、Ｈ――９――ｃＨ２０ＨＩ‘ｌｏＨ图１－３ Ｖｃ分子结构式Ｆｉｇ．１－３Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ Ｖｃ３位碳原子之间的烯醇式羟基上的氢可游离出来，从而显酸性。Ｖｃ具有很强的还原性， 最显著的特点是：在体内可被氧化为Ｌ．脱氢抗坏血酸，通过还原作用，Ｌ．脱氢抗坏血酸２第一章绪论可转化为Ｌ抗坏血酸。在此可逆的氧化－还原体系中（如图ｌ－４），两种物质均为有活性的抗 坏血剂，这种体系是抗坏血酸的基本生理活性及技术应用的基础【２１１。ＩＩＩＩＨ。｛］Ｈｊ＿ｊＨ－Ｃ――Ｊ－２Ｈ ＋２Ｈ筘门ｌｌＯ＝Ｃｌ６ｌｉｌ ：ＵＩ Ｈ―Ｃ―一Ｉ ｌ６ＨｚＯＨ Ｌ．脱氢抗坏纽酸ｌ图ｌ－４ ｖｃ可逆氧化―还原体系Ｆｉｇ．１－４ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ－ｄｅｏｘｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｖｃ作为食品抗氧化剂，Ｖｃ具有的作用【捌主要有：清除氧，抑制对氧敏感的食物成分的 氧化：将系统的氧化还原电势移向还原的范围；产生酚类或脂溶性的抗氧化剂；维持巯 基以．ＳＨ形式存在；对螯合剂起增效作用，还原不受欢迎的氧化产物。 １．１．３吻 ＶＥ又称生育酚，是一类具有生物活性的、化学结构相似的酚类化合物的总称。ＶＥ 是一种天然的脂溶性抗氧化剂，广泛存在于粮食种子和各种植物油中。通常为淡黄色的 油状液体，无臭；混合浓缩物为黄至褐色透明黏稠液体，可有少量微晶体蜡状物，几乎 无臭；几乎不溶于水，易溶于乙醇，可与丙酮、氯仿、乙醚、植物油混溶；热稳定性好，在较高温度（２２０。Ｃ）下仍有较好抗氧化效果；耐光，耐紫外线，耐放射性较科２２１。但生育酚混合浓缩物在空气中及在光照下，会缓慢地氧化变黑。 生育酚的化学结构如图１．５，ＶＥ结构的一个重要特征就是叶绿基链中有３个手性Ｃ，Ｒ，ｍＲ２生育酚Ｒｔ Ｒ，Ｑ１３ＨＴＨ ＣＨｎ６ Ｈ ＨＣＨ３－ＣＨ３ ＣＨ３图１．５生育酚的化学结构Ｆｉｇ．１―５Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｓ可形成８种立体异构体。这些异构体的生物学功能是不同的，其中ａ．生育酚的活性最高，分布最广且最具代表性，尤其是Ｄ，ａ．生育酚具有最高生物活性，通常被作为另外７种类型维生素的生物效价比较的标准㈣。３江南大学硕士学位论文ＶＥ可作为自由基吸收剂来保护膜免受自由基的伤害【２４１。当有自由基存在时，ＶＥ的 抗氧化历程如图１．６所示：通过苯并二氢吡喃环上酚羟基的Ｈ与自由基结合来清除体内的 自由基，生育酚（Ｉ）则转化成生育酚自由基（Ⅱ苯并二氢吡喃自由基）。由于电子的离域 作用（Ｐ．氕共轭效应）这个自由基相当稳定。生育酚自由基（ＩＩ）能被氧化成生育醌（ＩＩＩ），此 时苯并二氢吡喃头部的一个环打开。生育醌又可被还原成氢化生育醌（Ⅳ），这是一个极 好的抗氧化剂。来自人体的实验表明，氢化生育醌可转化为生育酚【２５１。ｍＩ－１０ 皇，／／ⅢＩＶｌ ｏ一生育酚ＩＩＱ吐育酚自由基Ⅲｏ一生育醌１７氢化醌图１＿６ ａ．生育酚的氧化扣再生Ｆｉｇ．１－６ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｂｉｒｔｈ ｏｆ ａ―ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｓ１．１．４荼多酚 茶多酚（ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ，简称ＴＰ）是一类存在于茶叶中的多羟基酚类有机物质及其 衍生物的总称【２６】，在茶叶中的含量一般在１５％－－－，２０％。 纯茶多酚一般为白色无定型粉末，通常为棕黄、淡黄或淡黄绿色粉末，具有涩味， 略有吸潮性，在潮湿的空气中能被氧化成棕色产物，易溶予水，可溶于甲醇、乙醇、丙 酮、乙酸乙酯等有机溶剂，水溶液的ｐＨ值在３＂－＇４之间，微溶于油脂，但不溶于氯仿。对 热、酸较稳定，ｐＨ值２～８稳定，ｐＨ＞８时光照易氧化聚合，遇铁变绿黑色络合物［２７１。 在茶多酚各组成份中以黄烷醇类为主，黄烷醇类又以儿茶素类物质为主，儿茶素含 量占茶多酚总量的６０％－－－－８０％［２８１。儿茶素包括非酯型儿茶素和酯型儿茶素，是多种结构 的混合物，各结构如图１．７。茶叶中含量最高的儿茶素为ＥＧＣＧ，其次为ＥＣＧ，再次为ＥＧＣ。Ｈ０ Ｈ ０Ｈｌ／卜同兰舌嗣瓦甲：Ｌ－ＥＣ．－Ｒｌ＝Ｈ，Ｒ２＝ＨＬ－ＥＧＣ－喁ＲＩ＝一ｎ，ＯＨＬ－ＥＣＧＬ吨ＧｃＧ：Ｒ，＝。Ｈ，Ｒ：＝０’百璐６图１－７儿荼素各结构式４ＩＲ，＝Ｈ，’Ｒ已堪ＯＨ２＝一Ｃ叫、卜第一章绪论儿茶素类化合物在Ｂ环和Ｃ环上的酸性酚羟基具有很强的供氢能力，能与脂肪酸中的游 离基相结合而中断脂肪酸氧化的连锁反应，从而抑制氢过氧化物的形成起到抗氧化作用。其过程为，ａ）供氢过程：Ｈ０ＨＯＨ＋ＲＬ以ｌ＝毋。 ｍ价。一乒ｏＩ＋――＇吣．儿、一，Ｊ―ｏＨ、２一Ｒｂ）抑制过程：ＲＯＯ?（过氧化自由基）＋ＲＨ２（抗氧化剂）一ＲＯＯＨ＋Ｒ Ｈ?Ｈ?＋ＨＲ一２Ｒ＋Ｈ２茶多酚是卫生部批准的天然抗氧化食品添加剂，可用于油脂、肉制品、饼干、饮料 等食品中，能够延长贮存期，防止食品褪色，提高纤维素稳定性，有效保护食品各种营 养成份。同时作为一种优良的氢或中子的给予体，可以和生物体在氧化还原反应中生成 的过量自由基反应生成酚氧自由基从而保护生物体免遭自由基的损伤【２９１，是人体自由基的清除剂。Ｉ．Ｉ．５迷迭香提取物 迷迭香提取物是从迷迭香植物中提取的具有抗氧化活性的一系列物质构成的混合 物【３１】，主要成分是二萜酚类、黄酮类和少量的三萜类化合物。至今，已从迷迭香茎、叶 中分离鉴定了２９个黄酮类化合物；十二种二萜酚类化合物如迷迭香酚（ｃｒｏｓｍａｍ０１）、鼠 尾草酚（ｃａｍｏｓ０１）等；三种二萜醌类化合物；从根中分离鉴定了五种二萜和二萜醌类化合 物。双酚类二萜为迷迭香中的油溶性高效抗氧化物质【３们。迷迭香提取物主要化学成分的 结构如图１－９，从它们的结构分析，均具有抗氧化活性。ＲＯＨＲ：０１１鼠尾孳酸ｃａｒｎｏｓｉｃａｃｉｄ迷迭香酸ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ雠ｉｄＲ。＆Ｈ ０ＨＲ：ｌｌ鼠尾节酚ｃａｒｎｏｓｏｌ迷达香研ｒｏｓｍａｎｏｌ图１－８迷迭香提取物主要化学成分的结构Ｆｉｇ．１－８Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ ｒｏｓｅｍａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔｓ工业生产的迷迭香提取物其外观有多种形式，如粉状和液状。对于不同形态的产品，５江南大学硕士学位论文其质量指标要求也不一样，但一般均是以有效成分的含量来衡量。国外相关迷迭香抗氧 化剂的主要质量指标，一般要求水溶性产品的迷迭香酸含量大于６％，而脂溶性产品的 有效成分（酸酚总量）则可分为大于１５％、２５％和６０％等不同级别。 研究表明，迷迭香的非挥发性成分具有明显的抗氧化作用，除黄酮外主要是鼠尾草 酚、鼠尾草酸、迷迭香酸和迷迭香酚，它们都具有双酚二萜的活性部位。此外，迷迭香 中还含有迷迭香二酚、迷迭香醌等多种不同的酚类，这些酚类物质之间以加合作用来表 现整体的抗氧化性【３们。这些成分都不容易挥发，具有良好的热稳定性。 目前，国外对迷迭香的研究与应用主要集中在食品工业、化妆品工业和医药卫生方 面。迷迭香抗氧化剂被直接用于油脂中以防止油脂变质。一般迷迭香抗氧化剂在油脂中 的添加量是０．０２％＇－－＇０．０４％。对于油脂中使用迷迭香抗氧化剂的研究报道较多，几乎所 有关于迷迭香提取方法的实验，都同时做其抗氧化性能的实验，有的还对其中的单一主要成分与合成抗氧化剂做了对比实斟３２。３５】。迷迭香抗氧化剂不但是一种自由基终止剂，而且是一种单线态氧抑制剂。１．１．６ｆｌ－胡萝卜素Ｂ．胡萝卜素（１３一ｃａｒｏｔｅｎｅ）是类胡萝卜素的一种，在人体内可以转化为ＶＡ，故又称它维 生素Ａ原，人体所需的ＶＡ有６０％＇－－７０％来自于Ｂ一胡萝卜素。Ｂ．胡萝卜素为红紫色至暗 红色的结晶性粉末，略有异臭、异味，熔点１７６～１８０℃，易溶于己烷、四氯化碳、苯、 二硫化碳，可溶于醚、石油醚、植物油，难溶于甲醇、乙醇，不溶于丙二醇和水、甘油， 对光、热、氧不稳定，不耐酸但在弱碱性时较稳定，不受ＶＣ等还原物质的影响，重金 属尤其是铁离子能促其褪色。稀溶液呈橙黄至黄色，浓度大时呈橙红色，因溶剂的极性 可能稍带红色【２２】。 Ｂ一胡萝卜素分子式为Ｃ４０Ｈ５６，其分子为反向对称的化学结构【３６－３７］如图１－９，两端是Ｂ． 紫罗蓝酮环（Ｂ１环和Ｂ２环），中间为四个异戊二烯［ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）一ＣＨ＝ＣＨ２】。‘彝‘环＇ 图１－９Ｆｉｇ．１－９ｆｌ－胡萝卜素结构ｓｔｒｕｃｔｕｒｅＭｏｌｅｃｕｌａｒｏｆ ｆｌ－ｃａｒｏｔｅｎｅＢ．胡萝卜素的抗氧化作用【３明是基于它分子中的多个共轭多烯双键的特殊结构。这种 结构使它能与含氧自由基发生不可逆性反应，生成非常稳定的以碳为中心的自由基 １３－ｃａｒ?，这个碳核自由基可以迅速可逆地与氧反应生成一种新的带链的过氧化自由基１３．ｃａｒ－ＯＯ．ｏＢ－胡萝卜素具有较强的抗氧化作用，能清除体内含氧自由基以及淬灭单线态氧。它的抗氧化作用能有效地预防多种疾病的发生发展，尤其是对某些肿瘤和心血管疾病。 １．１．７番茄红素６第一章绪论番茄红素（１ｙｃｏｐｅｎｅ）是一种重要的类胡萝卜素，是由１１个共轭及２个非共轭碳－碳 双键组成的直链型碳氢化合物‘３们，分子式为Ｃ４０Ｈ５６，其结构式如图１．１０，主要存在于番 茄、西瓜、南瓜等果蔬中。天然植物中的番茄红素绝大部分为热力学较稳定的反式结构， 而人体中顺式的比例却高得多【删。图ｌ－ｌＯ番茄红素分子结构式Ｆｉｇ．１－１０Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ ｌｙｃｏｐｅｎｅ番茄红素为红色粉末或红色液体，其较稀油状液体呈黄橙色。作为脂肪烃不溶于水， 难溶于甲醇等极性有机溶剂，可溶于乙醚、石油醚、己烷、丙酮，易溶于氯仿、二硫化 碳、苯、油脂等；具有良好的热稳定性，耐碱性较好，耐氧化还原性较强，但不耐光；能耐Ｋ＿、Ｎ矿、Ｍ矿、Ｆｅ２＋等离子，但不耐Ｆｅ３＋和ｃｕ２＋等离子【３９１。盐酸对番茄红素有破坏作用。当分子从反构变为顺构时颜色变浅，溶点降低。 由于番茄红素强效的抗氧化作用使得其在防治与氧化损伤相关的心脑血管疾病、机 体衰老、疲劳和皮肤损伤等方面均有潜在的应用价值【４１１。目前，番茄红素有以下几种用 途：（１）食品着色剂，同时其良好的自由基淬灭活性使其成为优良的食品抗氧化剂；（２） 基于已经证明的防治疾病功能，番茄红素可被用来制造功能性食品以及营养补充剂。１．２油脂氧化油脂的氧化主要包括三种类型，分别是油脂的自动氧化，光氧化和酶氧化【４２】。 １．２．１油脂的自动氧化 油脂的自动氧化是活化的含烯底物（如不饱和油脂）和空气中的氧在室温下，未经 任何直接光照，未加任何催化剂等条件下的完全自发的氧化反应。电子旋转共振光谱仪 （ＥＳＲ）可以直接地测出自动氧化过程中自由基的存在，验证了自动氧化是一个自由基链 锁反应，它一般是按游离基反应的机理进行的。油脂的变质，绝大部分是由于脂类的自动氧化造成的。１．２．１．１诱导期 将氧化速度非常缓慢的一段时间定义为诱导期。在这个阶段，通过金属催化剂与脂 类化合物直接反应和氢过氧化物的分解两种方式开始生成自由基，所产生的自由基会被 抗氧化剂有效地清除掉。然而一段时间以后，由于抗氧化剂被耗掉，自由基的传播进程 逐渐加快。当油脂开始有酸败味时，就标志着诱导期的结束或传播期的开始，这以后氧化速度猛增。实际工作中，最有意义的是油脂氧化过程中诱导期的确定。油脂的诱导期是油脂质 量最为重要的指标之一。诱导期可由油脂吸收氧的速度随时间的变化或通过测定过氧化 值或由Ｒａｎｃｉｍａｔ仪来确定。简单反应式如下：７（ＲＯＯ?，Ｈ?，Ｒ?，ＲＯ?代表自由江南大学硕士学位论文基，ＲＯＯＨ为氢过氧化物）ＲｏｏＨ乓――＞ＲＯＯ?＋Ｈ? ＲＯＯＨ∈――≥ＲＯ? ＋?ｏＨ ＲＯＯ?＋Ｈ２０２ＲＯＯＨ＜－－－－－－＞ＲＯ?＋１．２．１．２传播期 这是自由基的传递过程。在这个过程中，已生成的游离基夺取别的脂类分子上的氢原子，形成氢过氧化物和新的自由基，依此往复循环。Ｒ?＋０２＜－－－－－＞ＲｏＯ? Ｒ００?＋Ｒ’Ｈ∈――＞ＲＯｏＨ＋Ｒ’?１．２．１．３终止期当自由基不断聚集到一定的浓度则相互碰撞的频率大大增加，两个游离基能有效碰 撞生成一个双聚物。自由基的碰撞结合反应的发生，最终导致反应终止。ＲＯＯ?＋Ｒ７ｏＯ?《――＞Ｒｏｏ Ｒ ７＋０２ＲＯ?＋Ｒ‘＜－－－－＞ＲＯＲ’１．２．１．４二次产物的形成分解和进一步聚合反应在进行，形成低分子产物如醛、酮、酸、醇和高分子化合物。 １．２．２油脂的光氧化 光氧化作用也是油脂氧化作用的组成部分。氧分子有两种存在能量状态，一是单线 态，即激发态氧分子（１０２）；另～是三线基态氧分子（３０２）。油脂中的色素会强烈吸收邻近 的可见光或紫外光，发生光氧化作用【４３】，这也包括有光敏剂存在下与氧的反应所引起的 氧化反应。１．２．３油脂的酶氧化酶氧化则是由脂氧酶参加的氧化反应。脂氧酶催化的过氧化反应主要发生在生物体内以及未经加工的植物种子和果实中。脂氧酶有几种不同的催化特性：一种脂氧酶催化甘三酯的氧化，而另一种只能催化脂肪酸的氧化。在脂氧酶的活性中心含有一个铁原子，而必需脂肪酸是他们主要的氧化底物，因此这些酶能选择性地催化多不饱和脂肪酸的氧化反应【４４１。 １．２．４影响油脂氧化的因素影响油脂氧化速度的因素很多，主要与油脂的脂肪酸组成、温度、氧气、光和射线、 水分及重金属离子催化剂等因素有关。 油脂中的脂肪酸分为饱和脂肪酸（ＳＦＡ）、单不饱和脂肪酸（ＭＵＦＡ）和多不饱和脂肪酸（ＳＵＦＡ）。一般饱和脂肪酸是最稳定的，油脂的氧化变质是从不饱和脂肪酸的氧化开始的，油脂酸败所需要的时间也接近于各不饱和脂肪酸氧化所需要的时间【４３１。 食用油脂通常含有微量的金属离子催化油脂的氧化。这些金属离子的来源，一是含 金属的活化酶或其分解产物；二是在食油炼制、食油氢化及食品加工中接触金属容器。８第一章绪论温度的影响是较显著的。温度每提高１０℃油脂的氧化速度加快一倍。高温时（８０＇ｃ 以上），脑磷脂的存在能使酚类和醌类抗氧化剂的抗氧化性能大大地增加。 少量的水分（Ｏ．２％）被认为有益于油脂的稳定性，水能水化金属离子，降低其催化活 性。Ｏ．２％的水能防止亚油酸的氢过氧化物分解产生自由基【４５１。任何一种光线（如漫射阳 光或人造灯光）存在，都能触发光氧化作用。 １．２．５油脂氧化的危害 油脂氧化是导致食品品质变坏的重要原因之一，特别是对于油脂及含油食品来说更 是如此。油脂氧化除使食品中的油哈败外，还会使食品发生褪色、褐变、维生素破坏， 降低食品品质和营养价值，甚至产生有害物质引起食物中毒。研究发现：油脂氧化产生 的氢过氧化物呈现毒性【４６１。当用过氧化物含量极高的氧化油喂养小鼠时发现导致肝、肾、 肺的病变症状，小肠病变症状尤为突出。人体食用氧化油后也会产生不良后果。油脂的 脂质过氧化还会对膜、酶、蛋白质造成破坏，甚至可以导致老年化的很多疾病还可以致 癌，严重危害人体健康。因此，防止油脂及食品中油脂的过氧化就成为关系到人体健康 的大事。１．３自由基与疾病、衰老１．３．１自由基 原子或分子外的电子都在一系列能级不同的轨道上运动。根据分子轨道理论，每一 轨道上可容纳两个自旋相反的电子，自由基（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）是指那些独立存在的有一个或几 个不配对电子的原子或基团【４ ７１。自由基具有不配对电子，因此具有极高的化学活性，能 从邻近的分子夺取一个电子以弥补它自身的外层轨道而变得稳定。氧所形成的自由基统 称为活性氧，无论在正常代谢或病理变化中均极为重要。这些活性氧包括超氧阴离子、 羟自由基、过氧化氢分子、氢过氧基、烷氧基、烷过氧基、氢过氧化物和单线态氧【４８１。 超氧阴离子自由基不仅具有重要的生物功能，与多种疾病有密切的关系，而且它还 是所有氧自由基中的第一个自由基，可经过一系列反应生成其它氧自由基，因此具有特别重要的意义【４ ７１。羟基自由基则是已知氧化性最强的氧自由基，可以进攻细胞成分，膜脂、蛋白质、酶和核酸等，这是自由基生物学和医学的重要内型４９１。１．４．１氧自由基毒性 自由基是生物体生命活动过程中由其机体生物化学反应所产生的中间产物，自由基 参与的很多反应对机体是有益的。在正常细胞的代谢过程也有氧自由基产生，但体内还 存在一个清除氧自由基的体系，主要包括一些抗氧化酶和抗氧化剂，使得体内氧自由基 的产生和清除处于一个平衡状态。 但在日光、紫外线、电离辐射、化学反应、药物等外界物理化学因子的作用下，或 在某些病理情况下，机体发生氧化应激反应，将产生大量高反应活性的氧自由基【５０１。这 些过量的氧自由基具有广泛的病理学效应，可引起脂质过氧化作用的发生，导致对生物９江南大学硕士学位论文膜（包括细胞膜、线粒体膜、微粒体膜、溶酶体膜等）、小动脉和中枢神经系统的损伤。 这些损伤会形成小动脉的纤维性变化，加快动脉硬化以及其它心血管疾病的发生。同时，自由基和脂质过氧化产物可以引起ＤＮＡ的氧化破坏或交联，使核酸变性，结果导致ＤＮＡ 发生突变，热稳定性的改变、单链断裂等，从而影响了它们传递信息的功能以及转录与复制，导致蛋白质合成能力下降和合成差错。而当蛋白质合成能力下降时，可引起记忆力减退，智力障碍以及肌肉萎缩；蛋白质的合成差错，可以引起多种生物酶的减少与失活，或虽有活性但遇热不稳定；尤其是ＲＮＡ或统管信息的酶合成差错的进行性积累，会影响蛋白质合成的准确性，甚至危及整个机体的蛋白质合成，从而更加严重的造成机体 的损伤，严重干扰机体正常的生命活动，并加快机体的衰老与死亡【５ｌ】。因此机体适当地补充外源性抗氧化剂，清除体内过剩的氧自由基，将对生物体产生有益的作用。１．４抗氧化剂作用机理及研究方法１．４．１抗氧化剂作用机理有效抑制氧化是使用抗氧化剂之目的所在，由于受自身结构及性质影响，抗氧化剂发挥作用的途径是多样的，其作用机理可以概括为以下四种‘５２，５３］：清除自由基：多数抗氧化剂，包括目前常用的ＶＥ、ＴＰ等都是有效的自由基终止剂， 它们主要作为氢的给予体与脂类自由基反应，使自由基转变为非活性的或较为稳定的化合物，从而干扰或延滞链反应中的链增长步骤，达到抑制氧化的目的【５４－５６１。螯合金属离子：许多氧化过程是在金属离子的参与下进行的。金属离子在价态发生 变化过程中起传递电子的作用，可缩短链引发期的时间，从而加快了脂类化合物氧化的 速度。柠檬酸、磷酸衍生物等能与金属形成隋性的ｓ．络合物，抑制了氢过氧化物的分解，从而起到了抗氧化的目的‘５７，５８】。应指出的是金属离子螯合剂通过螯合引发链反应的物质抑制自由基生成，不能直接与自由基结合，起到的是间接抗氧化作用，因此单独使用时 的抗氧化效果往往不佳，故常常与其它抗氧化剂混合使用。 清除氧：此类抗氧化剂主要通过试剂本身的氧化还原反应来抑制氧化。如Ｖｃ由于分 子２、３位上存在两个相邻的烯醇式羟基，具有较强的还原性，可以有效地还原油脂中的过氧化物，消耗油脂中的氧，从而抑制氧化反应的发生【５９棚】。 作用于与自由基有关的酶：抗氧化剂在体内可以抑制导致自由基产生的酶的活性， 从而表现出抗氧化作用。如ＴＰ能够有效抑制细胞中ＮＡＤＰＨ．细胞色素还原酶及细胞色素 Ｐ．４５０的活性【６２。。１．４．１抗氧化研究方法 科学工作者在天然抗氧化剂的抗氧化性研究方面做了大量的工作，归纳起来研究体系主要为油脂体系，体外清除自由基体系；研究内容可归纳为两方面：单一抗氧化和抗 氧化剂间的协同作用。 抗氧化剂活性的评估与具体的测试体系相关，要客观、全面地反映抗氧化剂的活性 需要多种体系互相补充。目前用来测定抗氧化活性的常见方法包括：碘量法【６３舶】、二苯１０第一章绪论代苦味肼基自由基（ＤＰＰＨ?）比色、法【６７．７４】、硫代巴比妥酸反应物（ＴＢＡＲＳ）ｉ９４ｔＪ定澍７５。８１】。 １．５立题依据与研究内容１．５．１立题依据及意义 天然抗氧化剂因其无毒无害无副作用等优点越来越受到青睐。除了作为食品添加剂 延长食品保质期外，天然抗氧化剂还因能够清除人体内自由基而具有延缓衰老预防癌 症、冠心病和心血管等各种疾病的作用。 现在我国市场销售的小包装桶装油，绝大多数使用合成抗氧化剂ＴＢＨＱ、ＢＨＡ等 作为油脂抗氧化剂，主要因为其性质稳定，价格相对便宜。但从健康的角度出发，鉴于 合成抗氧化剂对人体潜在的危害性，迫切需要寻找相对经济、安全的物质替代合成抗氧化剂。目前，人们对多种天然抗氧化剂的抗氧化活性已进行了深入的评价研究，取得很多 成果，但对几种天然抗氧化剂的综合比较研究较少，且以往对抗氧化活性的测定大多是 在不同体系中进行的，由于抗氧化活性与具体的测试体系有很大关系，故不同体系中测 得的结果间可比性较差，这给正确评价比较多种抗氧化剂的抗氧化活性造成困难。另外， 食品及生命体中通常有多种抗氧化剂并存，单一活性成分的抗氧化效果往往弱于混合 物，研究其协同作用有助于深入了解各种抗氧化剂的相互作用。 基于此，本文选取了有代表性的天然抗氧化剂Ｖｃ、ＶＥ、ＴＰ、迷迭香提取物、１３． 胡萝卜素、番茄红素以合成抗氧化剂ＴＢＨＱ为对照，采用不同方法比较研究了它们在不 同体系中的单一抗氧化性，并研究了它们在油脂中的协同作用，希望对天然抗氧化剂的 合理应用有一定的指导意义。 １．５．２研究内容 本论文研究的主要内容是： （１）在精炼菜籽油、大豆油、猪油三种油脂体系中比较研究几种天然抗氧化剂的抗 氧化性及其在大豆油中抗氧化影响因素研究 （２）在体外清除自由基的评价体系中比较研究几种天然抗氧化剂的抗氧化性 （３）在菜油中研究几种天然抗氧化剂的协同抗氧化作用江南大学硕士学位论文第二章在油脂体系中抗氧化及影响因素比较研究２．１引言 油脂是人类三大营养素之一，是很好的热能营养素，在人体内具有重要的生理功能。 油脂氧化是影响油脂品质的一个重要因素。油脂氧化所产生的产物对食用油脂的风味、 色泽以及组织都会产生不良的影响，以至于缩短货架期降低油脂的营养品质。 由于合成抗氧化剂给人们带来不安全感，因而天然抗氧化剂应运而生，天然抗氧化 剂的开发利用已成为食品添加剂的热点。近几十年来天然抗氧化剂的研究已日益成熟， Ｖｃ、ＶＥ、茶多酚、迷迭香提取物已列入ＧＢ２７６０（含１９９７．２００６增补）食品添加剂抗氧 化剂之内，并规定其最大添加量。 在研究抗氧化性方面，科学家们已经做了大量工作建立了许多测定油脂稳定性及油 脂抗氧化剂活性的方法【８２＇８３】主要有以下几种： 经典的烘箱贮存法［８４１，以其简便易行、不需特殊仪器、结果可靠的优点成为美国 ＡＯＣＳ官方认可的标准方法之一，但此法比较费时费力。 活性氧法（ＡＯＭ），与烘箱贮存法的基本原理一致，都是人为的加速油脂的氧化。 该法是世界上公认的衡量各种油样氧化的相对容易的方法，与烘箱贮存法具有相关性， 比烘箱法耗时少，但需要特殊的ＡＯＭ仪，费用高。 Ｒａｎｃｉｍａｔ仪法是９０年代投入使用的方法【８５】，是Ｈａｄｏｍ和Ｚｕｒｃｈｅｒ根据油脂氧化产 生的大部分挥发性产物是甲酸的事实对ＡＯＭ法进行了改进而得的。此法在１００℃和１ｌｏ ℃实验温度下得到的结果与ＡＯＭ结果线性相关性很好，实验过程中仪器不需监视，可 同时测定５－６个样品，比ＡＯＭ法耗费少。另外还有色谱法、Ｂ．胡萝卜素共氧化法【８６】等 方法。 评定油脂质量指标还有其它一些化学方法，如硫代巴比妥酸法（ＴＢＡ）、测定碘值 （Ⅳ）、甲氧基苯胺值（ＡＶ）、氧代二烯值（ＯＶ）、共轭氧化产物（ＣＯＰ）等方法。 其中硫代巴比妥酸法【８ ７】是近年来较为常用的测定油脂氧化指标的化学方法，但其反映的 是不饱和脂肪酸自动氧化过程中产生丙二醛（ＭＤＡ）的量［８７】，不能准确反映油脂的整体 氧化情况，故本试验不采用。 经过对多种方法的比较，结合实验条件和样品特点，本章选用经典的Ｓｃｈａａｌ烘箱法 ［８８，８９］，并按ＧＢ／Ｔ５５３８―１９９５用经典的ＫＩ．Ｎａ２Ｓ２０３测定油脂体系的过氧化值（ＰＶ）来直 观的反映油脂的氧化情况，进而求出各抗氧化剂抗氧化活性。本章选用大豆色拉油、精炼菜籽油、自制猪油三种油脂体系，比较研究了几种抗氧化剂在三种油脂中的抗氧化性能；另外考虑影响油脂氧化的因素，以大豆色拉油为体系， 对影响因素与抗氧化的关系进行了初步比较研究。１２第二章在油脂体系中抗氧化及影响因素比较研究２．２材料与仪器２．２．１原料与试剂ＴＢＨＱＶｃ ＶＥ ＴＰ９９．８３％ ９９．７％１０００ ＩＵ／ｇ盐城捷阳精细化工提供 国药集团化学试剂美国Ｓｉｇｍａ公司９５％ ９０％ ９０％无锡世纪生物科技公司提供 石家庄华北制药集团提供 石家庄华北制药集团提供 贵州红星发展都匀绿友公司提供 东海粮油公司提供 东海粮油公司提供 市售新鲜猪板油熬制Ｂ．胡萝卜素番茄红素迷迭香提取物含鼠尾草酸和鼠尾草酚７０％ 大豆油 精炼菜籽油 自制猪油 重铬酸钾 三氯甲烷 冰乙酸 碘化钾 硫代硫酸钠 可溶性淀粉 其它均为分析纯 ２．２．２仪器与设备 ＧＣ－－２０１０型气相色谱仪 １０１．０型电热鼓风干燥箱 ８１２型磁力恒温搅拌器 ＸＷ－８０Ａ旋涡混合器 ＡＢ２０４．Ｎ电子分析天平优级纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯（未添加抗氧化剂） （未添加抗氧化剂）上海浦江化工厂 国药集团化学试剂 国药集团化学试剂 国药集团化学试剂 国药集团化学试剂 国药集团化学试剂日本岛津公司 上海沪南科学仪器厂 上海曹县行无线电元件厂 上海琪特分析仪器厂 梅特勒一托利多仪器有限公司２．３实验与方法２．３．１油脂成分分析 用气相色谱法对实验中采用的大豆油、精炼菜籽油、自制猪油进行脂肪酸组成分析。色谱条件为：色谱柱ＢＰＸ．７０（１２０ ｍ×Ｏ．２５ｎ＇ｌｎｌｉ．ｄ．×Ｏ．２５ｕｍ，法国ＳＧＥ公司）。采取程序升温法：１５０℃保持５ ｍｉｎ，然后以３。Ｃ／ｍｉｎ的升温速率将温度升至２２０℃，在此 温度下保持２０ ｍｉｎ。柱前压：３６６．３ ｋＰａ；进样口温度：２５０℃；检测器温度：２５０℃；空气压力：５０ ｋＰａ；氢气压力：６０ ｋＰａ；氮气压力：１００ ｋＰａ。分流比：２０：１；进样量：１ｕＬ。峰面积归一化法计算ＣＬＡ的浓度。２．３．２各抗氧化剂的添加量及添加方法１３江南大学硕士学位论文根据ＧＢ２７６０中规定各抗氧化剂的最大使用量，选定０．０２％为实验中各抗氧化剂的添加量。抗氧化剂添加方法：用精确度为０．０００１ ｇ的电子分析天平准确称取Ｏ．１０００ ｇ各抗氧 化剂，加入到１０ ｇ油中并混匀得高浓度的母液，然后取１ ｇ母液加入到４９９同样的油脂 中，使各抗氧化剂的添加量为油重的０．０２％。 ２．３．３实验及测定方法 采用未添加抗氧化剂的油脂体系，将各抗氧化剂以一定添加量加入到盛有５０９油的 具塞三角瓶中，混匀，于烘箱中恒温（６０℃±１℃）下强制氧化并按ＧＢ／Ｔ５５３８．１９９５每４ｄ测定ＰＶ值。根据ＰＶ－ｔ曲线按式（１．１）求防护因子ＰＦ２０，衡量抗氧化剂的抗氧化活加抗氧化剂油样的ＰＶ值达至ｌＪ２０所需时间 空白油样的ＰＶ值达到２０所需时间性大小【８９１。。。Ｔ２０…。Ｔ２００２．３．４油脂中的抗氧化能力比较研究分别在新鲜精炼菜籽油、大豆油、自制猪油三种油脂体系中比较各抗氧化剂的抗氧 化性。２．３．５大豆油中抗氧化影响因素比较研究根据影响油脂氧化的因素并参考大量文献［９０，９¨，选高温８０。Ｃ、Ｏ．２％水分、２ｍｇ／ｋｇＦｅ３＋、０．２ｍｇ／ｋｇｒｒ’ｎ＝＝一＝一?１．１ １ “。７ ｆ，．．、Ｃｕ２＋为改变条件，以大豆油为油脂体系，比较研究各抗氧化剂的抗氧化与影响因素间的关系。具体实验如下： ２．３．５．１温度对抗氧化性影响按２．３．３中方法，只将温度改变为８０℃下强制氧化，其他条件不变，与６０℃下的各 抗氧化剂对大豆油的抗氧化性比较。 ２．３．５．２水分对抗氧化性影响 按２．３．３中方法，其它条件不变，向各油样中加入ｏ．２％水分，研究其对各抗氧化剂 豆油中抗氧化性的影响。２．３．５．３ｖｄ＋对抗氧化性影响按２．３．３中方法，其它条件不变，向各油样中加入２ｍｇ／ｋｇ Ｆｅ３＋，研究其对各抗氧化 剂豆油中抗氧化性的影响。２．３．５．４Ｃｕ２＋对抗氧化性影响按２．３－３中方法，其它条件不变，向各油样中加入０．２ｍｇ／ｋｇ Ｃｕ２＋，研究其对各抗氧化剂豆油中抗氧化性的影响。２．４结果与讨论２．４．１油脂组成分析结果 由附图１，２，３得出三种油的主要脂肪酸组成如表２．１所示。由表可知自制猪油中饱 和脂肪酸含量较高，棕榈酸、硬脂酸两项的含量近４０％；精炼菜籽油中不饱和脂肪酸含１４第二章在油脂体系中抗氧化及影响因素比较研究量达到了９０％，其中油酸含量最高；大豆油中不饱和脂肪酸含量达到了８０％，亚油酸含 量最高，其次为油酸。精炼菜籽油和大豆油的主要脂肪酸组成存在一定差异。表２．１三种油的主要脂肪酸组成（％）Ｔａｂ．２．１ Ｔｈｅ ｍａｉｏｒ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｏｉｌ ａｎｄ ｆａｔｓ ｌ－＿－＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿－＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿－－●－＿－－＿＿－●＿－－●●＿＿＿＿＿■●■＿＿＿＿＿＿●●■＿＿＿＿■■＿＿■＿＿＿■一 ＿＿＿＿＿●■■■＿＿＿＿＿＿＿●●＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿－●＿－●＿＿＿＿●＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿一Ｉ主要脂肪酸 组成棕榈酸Ｃ１６－０硬脂酸Ｃ１８－０油酸Ｃ１８：ｌ亚油酸Ｃ１８：２亚麻酸Ｃ１８：３２．４．２对不同油脂的抗氧化能力比较 ２．４．２．１对精炼菜籽油的抗氧化性比较结果∞ 加 ∞ ∞ 加一∞善黑、人ｄ如 ∞ ｍＯ ０ １００ ２００ ３００――卜空白―――◆一Ｖ｜ｃ一??▲＿??１Ｐ时间／ｈ――－｜?一ＴＢＨＱ－－－－－－－）４－－－－－、，色――｝一迷迭香提取物―斗＿Ｂ．胡萝卜素…ｏ…番茄红素图２－１不同抗氧化剂对菜籽油的抗氧化效果Ｆｉｇ ２－１ Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｆｍｉｎｇ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ定期测定各油样的过氧化值ＰＶ，得图２。１。由图２．１中各氧化曲线可看出在菜籽油 体系中合成抗氧化剂ＴＢＨＱ的抗氧化效果最好，其次为ＴＰ、迷迭香提取物、番茄红素， 再次为Ｖｃ、ＶＥ、Ｂ．胡萝Ｉ－素。进一步对各抗氧化剂的抗氧化性做定量分析，由图２－１ＰＶ－ｔ曲线按式（１．１）求出防护因子ＰＦ２０，并比较添加各抗氧化剂对油的感官性状的影响如 表２―２。ＴＢＨＱ性质稳定，加入到菜油中能很好的溶解且不会对菜油的感官性状产生影 响；研究的几种天然抗氧化剂中ＴＰ对菜油的抗氧化性最好，其抗氧化防护因子为５．５４ 不到ＴＢＨＱ的一半。ＴＰ为水溶性，随着氧化过程的进行逐渐会有部分ＴＰ沉降到油底 部，这会影响到ＴＰ的抗氧化效果和油的感官性状；另外因为ＴＰ为褐色粉状物，加入 到油脂中会加深油的颜色，影响油的感官性质。迷迭香提取物能很好的溶解到菜油中， 但因为它本身为黄绿色使菜油呈黄绿色。Ｖｃ为水溶性，大部分不能溶解到菜油中，故 静置出现白色沉淀；而Ｂ．胡萝卜素和番茄红素本身既是抗氧化剂又是天然色素，故添加 了两者的菜油呈很鲜亮的红色，随着实验的进行番茄红素的红色褪去较明显。报道称【９２，９３】１５江南大学硕士学位论文番茄红素在体内有很好的抗氧化性，但在豆油中表现却一般，一方面因为番茄红素性质 不稳定，受热、光、氧影响较大；另一方面可能是因为实验中采用加速油脂氧化的高温 更加速了其自身的氧化失效，所以番茄红素对菜油的抗氧化性不佳。ＶＥ有八种同分异 构体，其中Ｑ型的生物活性最好，但其对油脂的抗氧化能力则最差，本实验中ＶＥ为混 合型，其在油脂中的抗氧化结果进一步说明它不适用于油脂抗氧化。表２．２各抗氧化剂抗菜油氧化活性大小及对菜油性状影响Ｔａｂ．２－２ Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｎｏｉｌ’ｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ２．４．２．２对大豆油的抗氧化性比较结果一∞芒寸Ｑ邑／人山∞踮∞∞∞∞∞加ｍＯ Ｏ ｌｏｏ ２００ ３００ ４００时间／ｈ ―崎卜一空白―――Ｏ―一Ｖｃ――目―一ＴＢＨＱ ――爿卜一Ｖｅ…６…ＴＰ…－口…，Ｂ一胡萝卜素…ｏ…迷迭香提取物 …＋．．番茄红素图２－２不同抗氧化剂对大豆油的抗氧化效果Ｆｉｇ ２－２ Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ同理得图２．２和表２．３，可知实验条件下对大豆油的抗氧化能力：ＴＢＨＱ＞ＴＰ＞迷 迭香提取物＞番茄红素＞Ｖｃ≈Ｂ．胡萝卜素≈ＶＥ，其中ＴＰ与迷迭香提取物的抗氧化能力 较强，ｖＣ、Ｂ．胡萝卜素、ＶＥ三者的抗氧化能力接近且最弱。ＴＰ在大豆油中的抗氧化防护因子ＰＦ２０为４．４０，迷迭香提取物的ＰＦ２０为２．０２，低于它们在菜油中的抗氧化性；另外因为两种油的初始感官性状基本相同，添加各抗氧化剂对大豆油的感官性状影响和菜油基本相同。１６第二章在油脂体系中抗氧化及影响因素比较研究 表２－３各抗氧化剂抗豆油氧化活性大小及对豆油性状影响Ｔａｂ．２－３ Ｔ――ｈ――ｅ――――ａ―ｎ―ｔｉｏｘ――ｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｎｏｉｌ＇ｓ ｃｈａｒ―ａ―ｃｔｅｒｓ添加物Ｔ２０／ｈＰＦ２０油样性状２．４．２．３对自制猪油的抗氧化性比较结果 由图２．３可以看出，猪油的氧化情况比较缓慢，这主要和猪油的饱和脂肪酸含量高 有关。一般饱和脂肪酸是最稳定的，猪油中含有大量的Ｃ１６：０与Ｃ１８：０脂肪酸，稳定性 较高。因为耗时太长，实验中部分ＰＶ值未达到Ｔ２０，所以不再用各抗氧化剂的ＰＦ２０进 行分析。鲫 加 ∞ Ｑ 卯善莹≥山∞ ∞ 加ｍＯＯ１００２００３００４００５００―◆－空白 ――＿’÷一Ｖｃ?一一△＿一－ＴＰ时间／ｈ ――－ｈ―ＴＢＨＱ―ｊ卜Ｖｂ―扣迷迭香提取物…＋．－番茄红素－－－＋．－－Ｂ一胡萝卜素图２－３不同抗氧化剂对猪油的抗氧化效果Ｆｉｇ．２－３ Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｌａｒｄ实验测定时间内，ＴＢＨＱ、ＴＰ、Ｖｃ、迷迭香提取物的对猪油抗氧化效果显著，它们 对应猪油的ＰＶ值分别达到了３．２６、６．３７、９．６７、１２．２４ ｍｅｑ／ｋｇ；添加ＶＥ、番茄红素的猪油的ＰＶ值分别达到了３２．２８、３５．４９ ｍｅｑ／ｋｇ；而添加Ｂ一胡萝卜素的猪油的过氧化值较高，说明Ｂ一胡萝卜素对猪油的抗氧化能力较弱。 ２．４．２．４综合比较分析 综合以上结果，可知各抗氧化剂在精炼菜籽油、大豆油中的抗氧化大小顺序基本相 同，ＴＢＨＱ＞ＴＰ＞迷迭香提取物＞番茄红素＞Ｖｃ≈Ｂ一胡萝卜素≈ＶＥ；而在猪油中抗氧１７江南大学硕士学位论文化效果则有些不同：除了ＴＢＨＱ、ＴＰ、迷迭香提取物外，Ｖｅ也表现出很好的抑制猪油 氧化效果，说明六种天然抗氧化剂中ＴＰ、迷迭香提取物对三种油脂均有很好抗氧化能 力，而Ｖｅ只对猪油有更好的抗氧化能力。另外比较表２．２和表２．３可知同样的时间内 精炼菜籽油的氧化程度低于大豆油的，各抗氧化剂在精炼菜籽油中的ＰＦ２０高于在大豆油 中的，这可能和两种油的脂肪酸组成不同有关。因为油脂的氧化变质是从不饱和脂肪酸的氧化开始的，油脂酸败所需要的时间也接近各不饱和脂肪酸氧化所需要的时洲４引。油脂的氧化作用主要发生在油脂分子中的不饱和键上，而且油脂分子的不饱和程度越高， 氧化作用发生越明显，多不饱和脂肪酸的不稳定性大于单不饱和脂肪酸。而由表２．１知 菜油中油酸占６０．４２％，豆油中亚油酸占５３．８５％，亚油酸的不饱和度大于油酸的，所以 豆油的氧化更快，使得抗氧化剂对豆油的防护因子小于对菜油的。 由以上结果可推断，ＴＰ和迷迭香提取物可应用于食用油的抗氧化，并使其达到一 定的货架期。出于经济方面的考虑，目前在我国大陆地区，茶多酚的提取最为成功，由 于在工艺上、设备上有所突破，茶多酚生产成本大幅度下降，目前茶多酚的价格和合成 抗氧化剂相接近【９５１，所以将茶多酚应用于食用油的抗氧化有一定可行性。迷迭香提取物 的价格则相对较高，在应用上有一定局限。当然为了使食用油达到更好的感官性状，还 应用合理的改性技术使ＴＰ变为油溶性，如用溶剂法、乳化法、分子修饰法等方法，这 方面的技术已有较多研究【９４】。当然ＴＰ除了直接应用到市售食用油外，还可以用于二级 油脂等不直接面对消费者的油脂抗氧化，达到很好的抗氧化效果。实验中用６０＊Ｃ杰ＩＩＪ速油 脂氧化，为更好的指导抗氧化剂应用，按温度每升高ＩＯ＊Ｃ油脂氧化速度加快一倍计算得， 室温下０．０２％茶多酚能使新鲜菜油的保质期达到约２４０天。２．４．３大豆油中抗氧化影响因素比较研究２．４．３．１温度对各抗氧化剂的抗氧化性影响儡善曼 主∞∞加∞∞∞∞∞ｍ０ ０ ４ ８ １２ １６…△．??空白时间／ｄ…伊－?ＴＢＨＯ――●卜一ＴＰ――氆ＰＶｅ―和Ｖｅ―和迷迭香―扣Ｂ一胡萝卜素―斗＿番茄红素图２－４ ８０℃下各抗氧化剂在豆油中抗氧化效果Ｆｉｇ．２－４Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ ａｔ ８０℃１８第二章在油脂体系中抗氧化及影响因素比较研究由图２－４可看出８０℃时ＴＢＨＱ、ＴＰ、迷迭香提取物对豆油的抗氧化能力显著降低。 与６０℃相比，氧化时间相同时空白豆油的ＰＶ值略高，但变化不是很大，说明８０℃和 ６０℃温度对空白豆油的氧化影响不大；但８０℃下，添加了ＴＢＨＱ、ＴＰ、迷迭香提取物 的豆油的ＰＶ值随时间延长显著增加，说明三者的抗氧化能力在８０℃下明显降低，进而 可知三种抗氧化剂在８０℃的稳定性减弱；而Ｖｃ、ＶＥ、Ｂ．胡萝卜素、番茄红素的抗氧化 能力在８０℃也有不同程度的降低，但与６０℃相比变化不大，说明它们在８０℃和６０℃ 的稳定性相差不大。由表２．４中８０℃下ＰＦ２０与表２．３中６０℃下ＰＦ２０相比可知，８０℃高 温能显著降低ＴＢＨＱ、ＴＰ、迷迭香提取物在大豆油中的抗氧化能力。表２－４ ８０℃各抗氧化剂抗豆油氧化活性大小Ｔａｂ．２－４ Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ ａｔ ８０℃２．４．３．２０．２％水分对各抗氧化剂的抗氧化性影响图２．５中各分图分别为各抗氧化剂的不加水分与加Ｏ．２％水分的对照图。由各分图可 看出０．２％水分对Ｂ．胡萝卜素的抗氧化性有显著的增强作用，但对其它各抗氧化剂在豆 油中抗氧化性影响较小。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）四图中加入Ｏ．２％水分的豆油的ＰＶ值均略高 于不加水分的，说明Ｏ．２％水分对ＴＢＨＱ、Ｖｃ、ＶＥ、ＴＰ在豆油中的抗氧化性有负影响， 结合抗氧化剂的性质和实验中油样的表观现象分析原因可能为Ｖｃ、ＴＰ溶于少量水中随 重力沉降造成其在油中分散不均，降低其抗氧化效果；而ＴＢＨＱ、ＶＥ两者为油溶性但 ０．２％水分使其抗氧化性略有降低，查阅相关文献未见有可信解释，可能是实验操作中的 误差引起。（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）可看出０．２％水分对迷迭香提取物、Ｂ．胡萝ｉ－素、番茄红素在豆 油中的抗氧化性有正影响，可能因为三者均为油溶性物质，水分对其在油中的均匀分散 无影响，但可通过水解作用钝化某些促进油脂氧化的金属离子，从而增强三者在油脂中 的抗氧化性。 另外，可以注意到此实验中添加Ｖｃ、ＶＥ、Ｂ．胡萝卜素的豆油的ＰＶ值明显大于前部 分实验，主要因为此部分实验中采用的豆油的初始ＰＶ值较前部分大，说明油脂氧化的 链反应引发期已经开始，添加三种抗氧化剂已不能起到好的抑制豆油氧化的作用，油脂 氧化迅速增加，所以抗氧化剂应在油脂的初始ＰＶ值越小时添加越好，采取有效措施保 证原料油的新鲜度对油脂保质也很重要。１９江南大学硕士学位论文 １４０¨￡ｊ ｍ８ ６ １２０蛩１００ 吕８０一∞《ＦＱ邑，人山薹篡２０ ０ ０ Ｏ ｌＯ ２０ ３０ ５ １０ １５ ２０４ ２ Ｏ时间／ｄ―◆一Ｖｃ０―●一Ｖｂｏ．２＋ＴＢＨＱＯ＋Ⅱ潮ＱＯ．２（ａ）ｌ １ １ １ ２０时间／ｄ（ｂ）儡１５芒叮莹１０一∞）ｌ／ｂａｇｙ，人山 ≥山５∞∞加∞踮∞∞加ｏＯ ５ １０ １５ ２００◆Ｖｅｏ时间生ｖｅｏ．２（ｃ）６０ ５０ １２０ １００Ｏ５ｌＯ１５２０时间／ｄ―◆一ＴＰＯ―●｝一ＴＰｏ．２（ｄ）篁４０要３０豪２０１０ Ｏ ０誊８０ 叮苎６０主４０２０＋迷迭香０ ＋迷迭香０．２（ｅ）８０５ｌＯ１５２０＋Ｂ－胡萝卜素０＋Ｂ．胡萝卜素０．２时间／ｄ（ｆ）儡６０＿叮兰４０≥厶２００ ０ ５ １０ １５ ２０十番茄红素０＋番茄红素０．２（ｇ） 图２．５ Ｏ．２％水分对各抗氧化剂在豆油中抗氧化的影响Ｆｉｇ．２－５ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ时间／ｄ０．２％ｗａｔｅｒｏｎｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ２０第二章在油脂体系中抗氧化及影响因素比较研究２．４．３．３ ２ ｍｇ／１（ｇＦｅ３＋对各抗氧化剂的抗氧化性影响∞ ∞ ∞ 加 儡善∞ ∞ 的 如 加ｍＯ ０ ２ ４ ６ ８ｌＯ童 茇…▲．一空白――卜ＴＢＨＱ――■一Ｖｃ――６一Ｖｅ时间／ｄ?一×．一ＴＰ―扣迷迭香提取物―扣§一胡萝卜素―＋＿番茄红素图２－６２ ｍｇ／ｋｇＦｅ抖Ｘｆｆ各抗氧化剂在豆油中抗氧化性影响Ｆｉｇ．２－６ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ２ ｍｇ］ｋｇ Ｆｅ３＋ｏｎ ｔｈｅ ａｎｆｉｏｘｉｄａＵｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ由图２－６中可看出添加了各抗氧化剂的豆油的ＰＶ值在８天的时间内急剧增加，与 无Ｆｅ３＋的各抗氧化剂豆油相比，添加Ｖｃ、ＶＥ、Ｂ．胡萝卜素的豆油的氧化情况基本无变化，说明２ ｍｇ／ｋｇ Ｆｅ３＋对三者的抗氧化性影响很小；但添加ＴＢＨＱ、ＴＰ、迷迭香提取物、番茄红素的豆油的ＰＶ值较无Ｆｅ３＋时显著增大，说明２ｍｇ／ｋｇＦｅ３＋能显著降低四者的抗氧化性，所以在使用这四种抗氧化剂时应尽量避免引入Ｆｃ３＋。这一方面因为Ｆｅ”有很强的 促进油脂氧化的作用；另一方面Ｆｅ”也会影响抗氧化剂的稳定性，使其部分失去活性。 如实验中可明显的观察到添加ＴＰ的油样中有黑色物质生成，即为ＴＰ遇Ｆｅ”变黑。２．４．３．４ ０．２ ｍｇ／ｋｇＣｕ２＋对各抗氧化剂的抗氧化性影响由图２．７可看出在豆油中Ｏ．２ ｍｇ／ｋｇＣｕ２＋对番茄红素的抗氧化性有很大负作用，而对ＴＰ、ＴＢＨＱ的抗氧化有较小负影响，对其它基本无影响。主要因为番茄红素对Ｃｕ２＋很不稳定。食用油脂通常含有微量的金属离子，来源一是含金属的活化酶或其分解产物；二是 在食油炼制、食油氢化及食品加工中接触金属容器。重金属，特别是那些具有两价或更 高价态且在它们之间有合适的氧化还原电势（例如钴、铜、铁、镁等）的金属，可缩短链 反应引发期的时间，加快脂类化合物氧化的速度。因此在油脂的贮存和加工过程尽量避 免引入一些金属离子对防止油脂的氧化非常重要。２１江南大学硕士学位论文舳衙 ∞∞∞ 一∞芒叮ｏＳ芒匠 ∞ 加ｍｏ ０ ３ ６ ９ １２一巾一空白 ――嗣一ｖｃ …Ｘ??ＴＰ图２－７Ｆｉｇ．２－７ ０．２时间／ｄ．一?一．１ｒＩｍＱ?．－－．－－－－ａ－－－－－－Ｂ－－胡萝卜素――－１曾一Ｖｂ ―扣迷迭香 ―＋．番茄红素ｍｇ／ｌ【ｇ Ｃｕ２●对各抗氧化剂在豆油中抗氧化性影响Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｏ．２ ｍｇ／ｋｇ Ｃｕｚ＋ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｆｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｏｆｆ２．５本章小结本章用经典的烘箱实验比较研究了各抗氧化剂在新鲜精炼菜籽油、大豆油、自制猪 油中的抗氧化性，结果表明在菜籽油和大豆油中抗氧化顺序基本相同：ＴＢＨＱ＞ＴＰ＞迷 迭香提取物＞番茄红素＞Ｖｃ≈Ｂ．胡萝Ｉ－素≈ＶＥ，ＴＢＨＱ、ＴＰ、迷迭香提取物抗氧化效 果好；而在猪油中：除了ＴＢＨＱ、ＴＰ、迷迭香提取物，Ｖｃ也表现出很好的抑制猪油氧 化的能力，说明天然抗氧化剂中ＴＰ、迷迭香提取物对三种油脂均有很好抗氧化能力， 而Ｖｃ只对猪油有更好的抗氧化能力。茶多酚应用于食用油的抗氧化有一定可行性。 同样方法研究了抗氧化的影响因素，结果表明：８０℃高温能显著降低ＴＢＨＱ、ＴＰ、 迷迭香提取物在大豆油中的抗氧化能力，说明高温显著减弱三者的抗氧化稳定性；０．２％ 水分对Ｂ．胡萝ｉ－素的抗氧化效果有显著的增强作用，但对其它各抗氧化剂在豆油中抗氧 化效果影响较小；２ ｍＭ，ｇ Ｆｅ３＋会明显降低ＴＢＨＱ、ＴＰ、迷迭香提取物、番茄红素在豆 油中的抗氧化性，它们使用时油脂中应避免引入Ｆｅ”；Ｏ．２中的抗氧化性有很大负作用。ｍ眺ｇ Ｃｕ２＋对番茄红素在豆油第三章体外清除自由基的比较研究第三章体外清除自由基的比较研究３．１引言 天然抗氧化剂的抗氧化性还集中在清除自由基能力的研究上。自由基与机体的许多 功能障碍和疾病的发生密切相关，因此研究自由基的检测方法并测定物质对自由基的清 除作用具有重要的意义。机体内环境复杂，研究相对困难，故大多在离体实验体系中研 究自由基清除能力。由于大多数自由基非常活泼，浓度低、存在的寿命短，因此在涉及 自由基的研究中，测定方法就显得特别重要。国内外对清除自由基的测定方法有多方面 的研究报道，目前研究天然物质清除自由基的方法大概有以下几种： 电子自旋共振【ｌｓ】是目前测定羟基自由基最为准确的方法。该方法利用自旋捕捉剂与 自由基反应生成相对稳定的自旋加合物，根据加合物的ＥＳＲ谱图进行自由基的定性和定 量。高效液相色谱法也是测定羟基自由基最为常用的方法，此法利用高效液相色谱分离 测定羟基自由基氧化芳环类化合物如：水扬酸、苯丙氨酸、苯酚生成的羟基化产物。但 由于方法本身所需的仪器和试剂较为昂贵，限制了两种方法的普遍使用。 化学发光法（ＣＬ）操作简便，不需昂贵设备，测定快速。宋俊梅，丁霄霖［９６】采用化学 发光法研究了自首乌对超氧阴离子自由基的清除作用；许申鸿，杭瑚【９７】用化学发光法证 明了鲜葡萄、葡萄皮、干葡萄籽抗自由基活性依次下降。但化学发光法到目前为止其分 析选择性和可信度并不很令人满意。另外，分光光度法具有仪器简单、操作方便的优点， 易于被一般实验室所采用。国内受仪器条件和经费的限制，有相当一部分测定自由基的 工作是由此法来完成的。 虽然目前已建立了多种测定清除自由基能力的分光光度法，国内外也有大量的文献 对其进行报道，但大多只是针对一种或一类物质的清除自由基能力测定，且方法迥异， 难以统一，给正确评价比较抗氧化性造成困难。报道的文献中只有ＤＰＰＨ法较为通用。 ＤＰＰＨ?是一种稳定的有机自由基，其溶液具有特征的紫红色团吸收峰，当存在自由基 清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子数 成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析。１９５８年，Ｂｌｏｉｓ［６７】将其应用于抗氧化剂 的筛选，此后国外又有许多学者用此法研究了羟基黄酮、单宁和类黄酮等的抗氧化作用 ［６８－７２］。在国内，许申鸿、杭瑚等［７３，７４１对该法进行了灵敏性及可靠性分析，并测定了天然 抗氧化物的活性。目前，ＤＰＰＨ?法已被广泛用于自由基清除剂的筛选工作中。 由于超氧阴离子自由基、羟自由基对人体的危害，研究抗氧化性实验大都测定对超 氧自由基和羟自由基的清除能力。但文献中没有用同一种方法同时比较几种不同性质的 抗氧化剂清除超氧和羟自由基能力的报道，鉴于此，本章参考大量的文献并根据实验室 条件，选用了ＤＰＰＨ（１，１－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ，ｌ，１．二苯代苦肼基）法［９８，９９】、ＰＭＳ． ＮＡＤＨ体系还原ＮＢＴ法【１００，１０１】、邻二氮菲一Ｆｅ２＋分光光度法【１０２１分别对选取的几种天然抗 氧化剂清除ＤＰＰＨ自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基进行了评价研究，以检验方法 的通用性及测定各抗氧化剂对不同自由基的清除能力。江南大学硕士学位论文３．２材料与仪器３．２．１原料与试剂 ＴＢＨＱ、Ｖｃ、ＶＥ、ＴＰ、迷迭香提取物、Ｂ．胡萝卜素、番茄红素同２．２．１中所示 １，１一二苯代苦肼基（ＤＰＰＨ）吩嗪硫酸甲酯（ＰＭＳ） 还原型辅酶Ｉ（ＮＡＤＨ）９９％美国Ｓｉｇｍａ公司 Ｆｌｕｋａ公司生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 分析纯分析纯国药集团化学试剂 国药集团化学试剂 国药集团化学试剂国药集团化学试剂 国药集团化学试剂氯化氮蓝四唑（ＮＢＴ） 邻二氮菲（１。１０．菲哕啉） 硫酸亚铁?七水 ３０％过氧化氢 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 其它试剂均为分析纯分析纯分析纯国药集团化学试剂 国药集团化学试剂３．２．２仪器与设备ＵＶ２０００紫外可见分光光度计 ＸＷ－８０Ａ旋涡混合器 ＨＨ．４数显恒温水浴锅 ＡＢ２０４．Ｎ电子分析天平 梅特勒３２０．Ｓ酸度计 上海尤尼柯仪器有限公司 上海琪特分析仪器有限公司 常州荣冠实验分析仪器厂 梅特勒一托利多仪器有限公司 梅特勒一托利多仪器有限公司３．３实验与方法３．３．１各样液的配制 分别配制不同浓度的ＴＢＨＱ、ＶＥ、ＴＰ、迷迭香提取物的乙醇溶液，Ｂ一胡萝卜素、 番茄红素的二氯甲烷溶液，Ｖｃ的水溶液，溶液浓度以ｍｇ／ｍＬ或ｐｇ／ｍＬ计。 ３．３．２清除ＤＰＰＨ自由基能力的测定 准确称取１０ｍｇ ＤＰＰＨ?溶于１００ ｍＬ无水乙醇得储备液，冰箱避光保存。用时稀释４倍得６．５ｘ１０。５ｍｏｌ／ＬＤＰＰＨ?溶液，另将待测抗氧化剂配制成系列溶液，按表３．１加样， 反应１０ ｍｉｎ后１ ｃｎｌ比色皿５１７ ｎｌｎ下测定吸光值。重复测定３次，结果取平均值。然 后按式（３．１）计算ＤＰＰＨ自由基清除率：清除率（％）＝［１一（Ａｉ―Ａｊ）／Ａｏ】×１００％ （３－１）抗氧化剂清除自由基能力采用清除ＤＰＰＨ?的ＩＣ５０值表示，即ＤＰＰＨ自由基清除率 为５０％时所对应的抗氧化剂溶液浓度。第三章体外清除自由基的比较研究 表３－１ ＤＰＰＨ实验加样表Ｔａｂ．３－１ ＤＰＰＨ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓａｍｐｌｅ ｔａｂｌｅ吸光值加样量２．５ ｍＬ ２．５ ｍＬ ２．５ ｍＬ空白凡Ａｉ６．５ｘ１０。５ＤＰＰＨ?乙醇溶液＋０．５ ｍＬ空白溶剂 ６．５ｘ１０’５ＤＰＰＨ?乙醇溶液＋０．５ ｍＬ样液 无水乙醇＋Ｏ．５ＡｊｍＬ样液３．３．３清除超氧阴离子自由基能力的测定 在吩嗪硫酸甲醋（ＰＭＳ）．ＮＡＤＨ体系中，ＮＡＤＨ氧化产生超氧阴离子，超氧阴离子 可还原氮蓝四唑（ＮＢＴ）为蓝色产物。这是一个超氧阴离子的非酶产生体系。 本研究采用磷酸盐缓冲液（Ｏ．１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＵＴ．４）的超氧阴离子产生体系。用磷酸盐缓冲 液分别配制４６８１．ｔｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＨ，１ ５０ ｐｒｎｏｌ／Ｌ ＮＢＴ，６０ Ｉ．ｔｍｏｌ／ＬＰＭＳ，取三试剂各１ ｍＬ以及Ｏ．５ ｍＬ不同浓度的试样，按ＮＡＤＨ、ＰＭＳ、试样、ＮＢＴ的顺序依次加入试管中混匀，加样时间控制在３ Ｓ以内，室温下反应６ ｍｉｎ，在５６０ ｎｌＴｌ测定吸光值。超氧阴离子与ＮＢＴ的颜色反应以试样的溶剂作空白。每样平行测３次取平均值。抑制率以式（３．２）计算：抑制率舭）＝（Ａ―Ａ１）／Ａｘｌ００％其中Ａ为空白体系的吸光值，Ａｌ为含试样体系的吸光值 ３．３．４清除羟自由基能力的测定 Ｈ２０２／Ｆｅ２＋体系可通过Ｆｅｎｔｏｎ反应产生羟自由基，总反应可用下式表示：Ｆｅ２＋＋Ｈ２０２―－Ｆｅ３＋＋ＯＨ一＋ＯＨ?（３．２）邻二氮菲―Ｆｅ２＋水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲―Ｆｅ３＋后，其５３６ ｎｌＴＩ最大吸收峰消失。 根据上述原理，以Ａ５３６变化反映羟自由基的氧化作用。取１ 乙醇溶液于试管中依次加入２剂，充分混匀后，加入１ｍＬ ５ｍＬ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ邻二氮菲无水ｍＬ ｐＨ７．４０的０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲溶液和１ ｍＬ样液的溶ｍＬｍｍｏｌ／Ｌ硫酸亚铁溶液（ＦｅＳＯａ），混匀后加入１Ｏ．１％双氧水（Ｈ２０２），于３７。Ｃ水浴６０ ｍｉｎ后，在５３６ ｎｎｌ测其吸光值，即损伤管的吸光值Ａ（损）。 未损伤管以１ ｍＬ蒸馏水代替损伤管中１ ｍＬＯ．１％的双氧水（Ｈ２０２），样品管以１ ｍＬ样品 溶液代替损伤管中的１ ｍＬ样液的溶剂，其它同损伤管，测得未损伤管的吸光值Ａ（未） 及样品管的吸光值Ａ（样）。按式（３．３）计算清除率：清除率Ｉ（％）＝筹鬻×ｌｏ。％（３－３）３．４结果与讨论３．４．１清除ＤＰＰＨ咱由基 结合图３．１并计算得ＩＣ５０对应的各抗氧化剂样液的浓度Ｖｃ为１３．５ ｐｇ／ｍＬ，ＶＥ为４６．５ｐｇ／ｍＬ，ＴＰ为９ ｐｇ／ｍＬ，迷迭香提取物为３２ ｐｇ／ｍＬ，ＴＢＨＱ为１ ３ ｐｇ／ｍＬ，番茄红素为５５Ｉｔｇ／ｍＬ，Ｂ．胡萝卜素大于１００肛ｇ／ｍＬ。得对ＤＰＰＨ?清除能力：ＴＰ＞ＴＢＨＱ＞Ｖｃ＞迷迭香提取物＞ＶＥ＞番茄红素＞Ｂ一胡萝卜素。ＴＰ、ＴＢＨＱ、Ｖｃ三者则小有差异，可认为三者江南大学硕士学位论文清除ＤＰＰＨ?的能力相当。据实验观察，加入ＴＰ样液后ＤＰＰＨ溶液的吸光值会不断减 小，而加Ｖｒｃ的吸光值则变化很慢并在５ ｍｉｎ内趋于稳定，说明ＴＰ的活性更强，能不断 的给出氢与自由基结合，其对自由基的清除能力更持久，是一种优良的氢或中子的给予 体；Ｂ．胡萝卜素清除ＤＰＰＨ?的能力较弱，当Ｂ．胡萝卜素溶液的浓度为１００ ｐｇ／ｍＬ时其 清除率仅达到２０％，故将它的清除率和其它抗氧化剂的清除率统一到一张图上则Ｂ．胡萝 卜素的清除曲线不完整。综上，ＴＰ、Ｖｃ对ＤＰＰＨ?清除效果最好。 大多数自由基化学性质极为活泼，寿命极短，然而少数自由基的化学性质十分稳定， 即使在室温溶液中也很安定，ＤＰＰＨ?就是其中之一。它的稳定性主要来自共振稳定作 用及三个苯环的空间障碍，使夹在中间氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成 对作用。ＤＰＰＨ?的稳定性为准确测定物质对自由基的清除能力提供了可靠的保证。ＤＰＰＨ 法简便易行，结果稳定，重现性好，受外界影响小，通用性好。１００８０鋈６０｛》｛卜冀加２０ ０Ｏ ｌＯ ２０ ３０ ４０ ５０ ６０７０踟鲫ｌＵ【ｌ样液浓彪（呜／Ｉ岫―＊一ＴＢＨＱ―＋一ｖｃ――卜Ｖｅ―－１｝一ＴＰ―扣迷迭香…ｏ…番茄红素－－－－ｂ－－－６－胡萝卜素图３－１各抗氧化剂对ＤＰＰＨ?的清除能力Ｆｉｇ．３－１Ｔｈｅ ＤＰＰＨ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ３．４．２清除超氧阴离子自由基 超氧阴离子自由基是生物体内某些生理生化反应常见的中间产物，作为活性氧的一 种，能促进脂肪氧化，促使生物体衰老，诱发炎症和肿瘤。在正常的生理条件下，体内 ＳＯＤ的生物合成量可以及时满足清除氧自由基的需要，但当人体衰老或病态时，氧自由 基的产生和消除就会失去平衡，常造成有机体的损伤，此时补充外来抗氧化物就显得极为重要。 ３．４．２．１ＴＢＨＱ由图３―２中乙醇空白曲线的吸光值变化情况可以看出ＰＭＳ与ＮＡＤＨ反应产生超氧阴离子自由基不断还原ＮＢＴ为蓝色，使５６０ ｎｌｎ吸光值随时间不断增加，６ ｍｉｎ时趋于 稳定。空白ｌ和空白２两曲线基本重合，说明同样操作条件下反应的重现性较好。以不同浓度的ＴＢＨＱ乙醇溶液代替乙醇空白加入反应体系后，吸光值有变化，但由图可看出， 溶液浓度高时体系的吸光值接近或超过空白值，Ｏ．２５ ｍｇ／ｍＬ时吸光值最低，浓度继续２６第三章体外清除自由基的比较研究Ｏｌ２３４５６’７时间／ｍｉｎ－－．ｏ－－－乙醇空白１…白…乙醇空白２…×．??４ｒｎｇ／ｍＬ样 …十??２ｒｎｇ／ｍＬ样 ――呐ｒ－一ｌｍｇ／ｍＬ样――｛卜一０．５ｎ－ｇ／ｍ１．样――勺一０．２５ｒｎｇ／ｍｔ样一＊一０．１２５ｍｇ／ｍＬ样ＴＢＨＱ图３．２ ＴＢＨＱ清除超氧阴离子自由基效果Ｆｉｇ．３－２ Ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ减小时吸光值反而增大。进一步实验，无ＮＡＤＨ时４０ ｍ＃ｍＬ、４ ｍ＃ｍＬ、２ ｍｇ／ｍＬ的 ＴＢＨＱ乙醇溶液与ＰＭＳ、ＮＢＴ体系的吸光值变化曲线如图３―３所示。４０ ｍｇ／ｍＬ的吸光 值很快增大，可能是ＰＭＳ氧化ＴＢＨＱ产生某种物质使ＮＢＴ变蓝；低浓度的吸光值很小， 对体系基本无影响。但由图３―２仍可看到加入４ ｍ＃ｍＬ样后的吸光值仍超过了乙醇空白 值，说明ＮＡＤＨ、ＰＭＳ、ＴＢＨＱ之间产生了更复杂的作用增加了ＮＢＴ变蓝的程度。Ｏ．５ ０．４ 。０．３是ｏ．２Ｏ．１ ０ ０―――◆一――－｛｝一…Ａ－’?２ｍｇ／１１１ｌ?４０ｍｇ／ｍ时ｌ间生４ｍｇ／ｍｌｌ２３４５６７图３－３无ＮＡＤＨ时体系吸光值Ｆｉｇ．３－３ Ｔｈｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ＮＡＤＨ总之，此体系中ＴＢＨＱ一方面有清除作用，另一方面有使ＮＢＴ增色的副作用，两 种作用叠加得到图３．２中的结果，按式（３．２）计算０．２５ ｍｇ／ｍＬ样液的清除率为２４．１％，结果偏低达不到５０％。３．４．２．２ Ｖｃ２７江南大学硕士学位论文０ ３０ ２Ｏ ｌ０ Ｏ ２ ４ ６ ８ ｌＯ时间／ｒａｉｎ…令一水空白――●一０．３ｍｇ／ｍｌ ―ｊ卜Ｏ．０５ｍｇ／ｍｌ――●卜一０．５ｍｇ／ｍｌ―――圣ｒ＿一０．１ｍｇ／ｍｌ――爿｝―一０．０１ｍｇ／ｍｌ图３一ｌｖｃ清除超氧阴离子自由基效果Ｆｉｇ．３－４ Ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｖｃ由图３―４可以看出水空白的吸光值在６ ｍｉｎ内也不断增加并逐渐稳定。含Ｏ．５ Ｖｃ水溶液的体系吸光值前期有明显的减小，后期又不断增加，说明Ｏ．５ｍｇ／ｍＬｍｇ／ｍＬＶｃ开始能很好的抑制还原ＮＢＴ的反应，但后期又存在某种缓慢反应使ＮＢＴ变蓝。Ｏ．５ ０．４ Ｏ．３ ０．２ Ｏ．１ Ｏ ０ ２时间／疵４６８１０…◆?－ａ――｛．＿一ｂ图３－５Ｖｃ的副反应Ｆｉｇ．３－５ Ｔｈｅ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｖｃ图３―５中ａ曲线代表Ｖｃ水溶液浓度５ ｍｇ／ｍＬ时，只含有Ｖｃ和ＮＢＴ的体系的吸光 值变化，初期会缓慢增加，６ ｍｉｎ后增速加快；而ＰＭＳ、Ｖｃ、ＮＢＴ三者都存在时，体系 的吸光值会迅速增大如图３．５中ｂ曲线。这说明一方面Ｖｃ可能直接缓慢还原ＮＢＴ为蓝 色，另一方面Ｖｃ与ＰＭＳ作用产生某种中间物质快速还原ＮＢＴ为蓝色。Ｖｃ水溶液浓度为Ｏ．５ ｍｇ／ｍＬ时，上述两体系吸光值几乎为零，说明低浓度时上述副反应对清除体系无 大影响。按式（３－２）计算得Ｏ．０５ ｍｇ／ｍＬＶｃ的清除率为２０．１％，０．５ ｍｇ／ｍＬＶｃ清除率为 ３９．４％，而由以上分析可知Ｏ．５ ｍｇ／ｍＬ Ｖｃ的实际清除率应略大于３９．４％，但实验无法准 确的反映出实际的清除率。３．４．２．３ ＶＥ２８第三章体外清除自由基的比较研究Ｏ ８ Ｏ ７ Ｏ ６ Ｏ ５ Ｏ４ Ｏ３ Ｏ２ Ｏ ｌ ０ ０ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７―＋＿乙醇空白―卜０．２５ｍｇ／ｍｌ …矗…０．０２５ｍｇ／ｎａ――●卜一０．］２５ｒｎｇ／Ｉｒｄ时间／ｎ＇ｉｎ…×．??０．０１２５ｍｇ／ｍｌ――蔫卜Ｏ．００５ｍｇ／ｍｌ…｝．．ａ――＿｜｝―一ｂ图３＿６ ｖＥ清除超氧阴离子自由基效果Ｆｉｇ．３－６ Ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｖｚ图３－６中ａ曲线为Ｏ．２５ ｍｇ／ｍＬＶＥ与ＮＢＴ反应体系的吸光值，ｂ曲线为Ｏ．２５ ｍｇ／ｍＬＶＥ＋ＰＭＳ＋ＮＢＴ的吸光值，两者缓慢同步增加说明低浓度时ＶＥ能直接还原ＮＢＴ为蓝色，所以加入Ｏ．２５ ｍｇ／ｍＬ、Ｏ．１２５ ｍｇ／ｍＬ ＶＥ乙醇溶液的吸光值远远大于空白的吸光值。计算０．００５ｍｇ／ｍＬＶＥ乙醇溶液的清除率只有１３．４％。ＶＥ不能很好的清除该体系产生的超氧自由基。３．４．２．４ ＴＰ图３．７中Ａ曲线为１ ｍｇ／ｍＬ ＴＰ＋ＰＭＳ＋ＮＢＴ的反应，其吸光值恒定在０．１０且与１ｍｇ／ｍＬＴＰ的清除曲线的吸光值相近，说明ＴＰ对ＮＢＴ没有副作用，同时其它浓度ＴＰ的 清除曲线的吸光值变化也很明显，并在６ ｍｉｎ内恒定，可知不同浓度的ＴＰ乙醇溶液对ＰＭＳ－ＮＡＤＨ体系产生的超氧自由基有很好的清除作用。计算０．１ ｍｇ／ｍＬ、Ｏ．０１ ｍｇ／ｍＬ、０．００５ ｍｇ／ｍＬＴＰ对应的清除率分别为７４．２％、５６．９％、３５．１％。Ｏ５ Ｏ４ ０ ３ ∞ｑｖ ０ ２ Ｏ ｌ Ｏ ０ Ｉ ２ ３ ４ ５ ６ ７―卜乙醇空白―＋＿ｌｒｎｇ／ｍｌ――卜Ｏ．００５ｍｇ／ｍｌ…Ｏ??‘Ａ一士一０．１ｒｎｇ／ｍｌ――＊一０．０１ｍｇ／ｍｌ图３．７ ＴＰ清除超氧阴离子自由基效果Ｆｉｇ．３－７ Ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＴＰ时间／ｍｉｎ２９江南大学硕士学位论文３．４．２．５迷迭香提取物Ｏ?５ Ｏ．４ ０．３∞罨ｏ．２Ｏ?１ ０ ０ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７时间／ｍｉｎ―．＿乙醇空白－－‘Ａ．’－Ｏ．８ｎｗｏ／ｎ正―――●―一ｌｍｇ／ｍｌ――＇卜一０．５吲珊…十??Ｂ――号÷一０．６ｍｇ／ｎ【１ｌ――＿‘卜―一０．１ｍｇ／ｍｌ图３－８迷迭香提取物清除超氧阴离子自由基效果Ｆｉｇ．３－８ Ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｏｓｅｍａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔｓ图３．８中Ｂ曲线为１ ｍｇ／ｍＬ迷迭香＋ＰＭＳ＋ＮＢＴ的反应，其吸光值恒定在Ｏ．１０左右， 说明迷迭香提取物对ＮＢＴ没有副作用，同时其它浓度迷迭香的清除曲线的吸光值变化也很明显，并在６ ｍｉｎ内恒定，可知不同浓度的迷迭香提取物乙醇溶液对ＰＭＳ－ＮＡＤＨ体系产生的超氧自由基有很好的清除作用。计算０．８０．１ｍｇ／ｍＬ、０．６ ｍｇ／ｍＬ、０．５ ｍｇ／ｍＬ、ｍｇ／ｍＬ迷迭香提取物对应的清除率分别为５７．５％、３４．７％、２０．２％、１２．６％。 综上，由ＰＭＳ－ＮＡＤＨ体系产生超氧阴离子还原ＮＢＴ的方法适合用来测定ＴＰ、迷３．４．２．７比较分析迭香提取物对体系中产生的超氧阴离子的清除能力，且Ｏ．０１ｍｇ／ｍＬ ＴＰ、０．８ｍｇ／ｍＬ迷迭香的清除率分别为５６．９％、５７．５％，说明本体系中ＴＰ的清除能力远远大于迷迭香提取 物；而ＴＢＨＱ、Ｖｃ、ＶＥ均不同程度地与体系中的物质发生作用，影响清除率的正确测 定；Ｂ．胡萝卜素、番茄红素对此体系超氧阴离子自由基的清除效果不明显；故此法不能 用来完全评价选取的几种抗氧化剂清除超氧阴离子的能力。 ３．４．３清除羟自由基能力 图３－９为各抗氧化剂不同浓度样液对应的羟自由基清除率，结合图迸一步计算得 ＩＣ５０对应样液浓度分别为Ｖｃ为Ｏ．５６ ｍｇ／ｍＬ，ＶＥ为１．２１ ｍｇ／ｍＬ，ＴＰ为０．３２ ｍｇ／ｍＬ，ＴＢＨＱ为１．０９ ｍｇ／ｍＬ，迷迭香提取物、Ｂ．胡萝卜素、番茄红素的则无法读出。由此得Ｖｃ和ＴＰ对羟自由基的清除能力强于其它，但实验中加入ＴＰ液浓度＞Ｏ．６ ｍｇ／ｍＬ时，反应液在 保温一段时间后会出现褐色沉淀，振荡后沉淀基本溶解，放置又会出现絮凝，严重影响 吸光值的测定。这可能因为茶多酚分子中的邻苯二酚结构鳌合铁离子，形成无活性的绿 黑色铁复合物¨州，在ＴＰ液浓度＜Ｏ．６ ｍｇ／ｍＬ时，此复合物会在一定程度上加深反应液 的颜色影响吸光度。迷迭香酸的分子中也有邻苯二酚结构【１０５１，故实验中加入迷迭香提 取物的反应液也出现绿黑色沉淀，影响实验结果。Ｖｃ反应液的颜色正常，只是在浓度第三章体外清除自由基的比较研究∞∞摹褂 裂 蜓出ｏ∞ ∞ 加ＯＯ ｏ．５ ｌ １．５ ２样液浓度／（１玛／呻―÷卜一ＴＢＨＱ―●卜一Ｖｃ＋迷迭香 十Ｂ一胡萝卜素＞１―●卜一Ｖｅ―■ｒ―ＴＰ＋番茄红素图３－９各抗氧化剂对ＯＨ?的清除能力Ｆｉｇ．３－９ Ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｍｇ／ｍＬ时，样品管的红色比未损伤管深，使得清除率超过了１００％出现异常。Ｂ一胡萝卜素、番茄红素的溶液浓度接近ｌｍｇ／ｍＬ时，样液本身的颜色影响吸光值的测定，故 其在高浓度的清除率无法准确测出。综上，邻二氮菲一Ｆｅ２＋分光光度法不能准确测定ＴＰ、 迷迭香提取物、Ｂ．胡萝卜素、番茄红素对羟自由基的清除能力，并且此方法在测定Ｖｃ 清除羟自由基能力时有一定适用浓度范围，浓度太高测定结果不可信。 羟自由基是目前所知活性氧中对生物体毒性最强，危害最大的一种自由基，它可以 通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、 蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变，因此研究清除?ＯＨ活性 物质具有重要意义。目前测定羟自由基的方法除邻二氮菲一Ｆｅ２＋分光光度法外，还有电 子自旋共振（ＥＳＲ）法、高校液相色谱（ＨＰＬｃ）法、生物化学发光法等，这些方法大 都利用Ｆｅｎｔｏｎ反应体外模拟羟自由基的产生，反应如下：Ｆｅ２＋＋Ｈ２０２―－Ｆｅ３十＋ＯＨ一＋ＯＨ?从原理分析，体系中的Ｆｅ”会与茶多酚形成铁黑色复合物，所以本章未用其它方法测定 茶多酚清除羟自由基能力。此外，也有报道用Ｃｕ２＋代替Ｆｅｎｔｏｎ反应中的Ｆｅ３＋产生羟自由基，以后实验可以进行尝试。３．５本章小结本章研究各抗氧化剂单一抗氧化性在离体实验体系中对不同自由基的清除能力，评 价比较