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毕业设计（论文）-二甲苯对小鼠肾组织损伤的研究 二甲苯对小鼠肾组织损伤的研究摘要本试验以小鼠为试验动物，通过腹腔注射二甲苯染毒建立试验模型，测定小鼠肾组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛MDA含量，以及制作组织切片进行病理学观察，从而分析评价二甲苯对小鼠的损伤程度。将小鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，Ⅰ组为对照组（注射生理盐水），其他三组分别用不同浓度的二甲苯（用药剂量分别为0125ML/KG、025ML/KG、05ML/KG）经腹腔注射小鼠染毒15天，15天后处死、剖解小鼠，观察肾组织的大体变化并制作肾组织切片。使用SOD、MDA试剂盒测定不同试验组小鼠的肾组织匀浆中SOD的活力和MDA的含量。结果显示，Ⅳ组染毒小鼠的SOD活力较其他三组下降极显著（P5，参照蓄积系数分级标准，可知，经呼吸道吸人的挥发性有机化合物对小鼠的蓄积作用极弱。同时也不排除小剂量反复接触挥发性有机化合物混合物可能对机体产生一定耐受性的可能。该结果可为迸一步开展慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。14SOD和MDA的测定意义超氧自由基（O2）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（SUPEROXIDEDISMUTASE），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2），生成H2O2和O2。H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。因此，超氧化物歧化酶（SOD）是机体天然的自由基清除剂，保护组织免受超氧自由基的攻击。SOD是生物体内最有效的氧自由基清除系统，能清除生物体内有氧代谢的中间产物超氧负离子自由基，是抗氧自由基损伤的第一道防线。在防御氧的毒性、抗氧化损伤、预防衰老以及防治肿瘤和炎症等方面有重要意义。另外研究认为外源性SOD的保护作用主要通过以下几方面起保护作用加强清除自由基，并减少细胞内游离多胺的耗损，降低细胞对辐射的敏感性；提高鸟氨酸脱梭酶ODC活性；增强细胞内多胺的生物合成等，降低细胞对辐射的敏感性，从而提高细胞的生存率；减少细胞DNA的损伤抑制细胞凋亡；激活BCL2MRNA的过度表达，延迟细胞内DNA的断裂。SOD是体内特异性超氧阴离子自由基的抗氧化酶，它的作用是将氧自由基歧化，生成氧气和过氧化氢，从而阻断毒性更强的羟自由基的产生。通过对SOD活力的测定，可以间接反映出细胞的氧化损伤程度5。机体内氧化自由基的生成使SOD活性下降，导致膜脂质发生过氧化损伤，生成大量丙二醛（MALONDIALDEHYDE，MDA），使细胞进一步遭到损伤。MDA是体内重要的脂质氧自由基，为未饱和脂肪代谢产物，毒性强，可与蛋白质和核酸结构上氨基、巯基等发生交联作用，从而破坏蛋白质和核酸的正常结构，并使之丧失原有功能；还可使细胞间隙增大，通透性增高，加速细胞进一步损伤。测试MDA含量常常可以反映机体内脂质过氧化的程度，MDA含量的变化可间接反映运动中自由基的生成量和体内物质的代谢情况，间接的反映出细胞损伤的度程5。15本试验研究的目的及意义二甲苯主要通过经呼吸道、消化道及皮肤吸收，并最终进入血液循环。而人接触过量二甲苯则会引起中枢神经系统麻醉，出现头痛、恶心、胸闷、乏力和意识模4糊，严重者可致昏迷以致呼吸循环衰竭而死亡；动物长期接触二甲苯则会出现明显的形态学变化6。本试验通过用不同浓度的二甲苯感染小鼠并对其进行跟踪观察，记录其肾脏组织的病理变化和生化指标（SOD、MDA）的改变，并通过制作组织切片，观察中毒后小鼠肾组织结构的变化，对二甲苯的致病机理进行深入的研究。通过试验初步研究二甲苯染毒对小鼠肾脏组织的毒性及其致毒作用机制，为进一步探讨二甲苯的毒性效应提供参考，为综合评价二甲苯的安全性和室内环境污染研究提供理论依据。2材料与方法21试验材料211试验动物选取20D龄体重20G左右的健康，发育良好，体重相近的断奶小鼠96只（购自河南省实验动物中心），雌雄各半。212试验试剂二甲苯、乙醇、蒸馏水、甲醛、石蜡、甲醛固定液、苏木精伊红（HE）、梯度酒精（30％，50％，75％，80％，85％，90％，95％，100％）、05％盐酸酒精分化液、中性树胶等。主要试剂的配制方法甲醛固定液的配制多聚甲醛40G溶于500ML蒸馏水NAH2PO412H2O71632G溶于1000ML水NAH2PO42H2O31200G溶于1000ML水取NA2HPO412H2O810ML和NAH2PO42H2O190ML与配制好的多聚甲醛溶液混合均匀，即为所需的甲醛固定液。伊红溶液的配制（醇溶性）伊红5G75酒精1000ML加几滴冰醋酸至半透明状。苏木精溶液的配制苏木精1001G无水乙醇10ML钾明矾（硫酸铝钾）2010G蒸馏水200ML5高锰酸钾试验器材饲养鼠笼，1ML注射器，冰箱，超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（购自南京建成生物科技有限公司），丙二醛（MDA）测定试剂盒（购自南京建成生物科技有限公司），各种型号微量移液器、载玻片、镊子、盖玻片、标签、记号笔。22试验方法221试验分组采取随机分组法分为四组，雌雄各半。Ⅰ组为对照组，Ⅱ组为低剂量组，Ⅲ组为中剂量组，Ⅳ组为高剂量组。动物购回后进行一周的试验前饲养，使小鼠适应试验环境。表1试验组注射剂量分组二甲苯含量（ML/KG）Ⅰ组0Ⅱ组0125Ⅲ组025Ⅳ组05对四组小鼠进行二甲苯的腹腔注射。222临床观察内容分别在预饲期和正饲期间记录各组试验小鼠的采食、饮水、精神、粪便、可视黏膜、被毛、姿势与运动、行为、体格等临床表现。23检测指标与检测方法染毒15D后处死小鼠，解剖取Ⅱ组，Ⅲ组，Ⅳ组，Ⅰ组试验的肾组织。取出的肾组织一部分制备组织匀浆。然后用超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，丙二醛分光光度计（7230G）上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂数显恒温水浴（HM6）金坛晓阳电子仪器厂台式离心机（800型）上海浦东物理光学仪器厂KDT电脑生物组织摊烤片机KDBM生物组织包埋机LEICARM2016切片机OLYMPUSCX21型显微镜6（MDA）测定试剂盒进行两项指标的测定。余下肾组织保存于甲醛固定液中进行切片前的固定。231SOD活力的测定方法按照试剂说明书进行实际的配制，而试剂的添加则按表2进行，然后按照以下公式进行计算组织匀浆中SOD活力对照管吸光度－测定管吸光度/对照管吸光度÷50﹪反应也总体积/取样量÷组织中蛋白含量表2SOD试剂的添加步骤试剂（ML）测试管对照管试剂一样品蒸馏水试剂二试剂三试剂四1050ΜLΜL010101用漩涡混匀器充分混匀置37℃恒温水浴40MIN显色剂22混匀，室温放置10MIN于波长550NM处测量（蒸馏水调零）其中组织匀浆的浓度为1232MDA含量的测定按照试剂说明书进行实际的配制，而试剂的添加则按表3进行，然后按照以下公式进行计算组织匀浆中MDA含量对照管吸光度－测定管吸光度/（标准管吸光度－对照管吸光度标准品浓度÷组织中蛋白含量标准品浓度为10NMOL/ML表3MDA试剂的添加步骤标准管标准空白管测定管测定空白管10NMOL/ML标准品（ML）无水乙醇（ML）测试样品（ML）试剂一（ML）017混匀（摇动几下试管架）试剂二（ML）试剂三（ML）15050冰醋酸（ML）00015其中组织匀浆的浓度为5漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40MIN，取出后流水冷却，然后转／分，离心10MIN，取上清液，532NM处，1CM光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。233组织中蛋白含量测定按照考马斯亮蓝法测得各剂量组组织中的蛋白含量（MGPROT／ML）。24石蜡切片的制作241切片的制备取材材料新鲜，取材组织愈新鲜愈好，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。组织块的大小，所取组织块较理想的体积为20CM15CM03CM，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同1。用于固定组织的固定液是4的中性甲醛。固定液的量一般为组织体积的5～10倍。一般情况下，小标本的固定时间为4～6H，大标本的固定时间为18～24H或更久1。梯度乙醇脱水60％、70％、75％、80％、85乙醇各15～2H，85％乙醇最好过夜，90％、95％Ⅰ、95％Ⅱ、100％Ⅰ、100％Ⅱ乙醇各40～50MIN，乙醇的容积应为组织块总体积的5～10倍以上；透明先用50％二甲苯酒精溶液透明5MIN，再用纯二甲苯透明，透明时间视效果而定，一般组织材料出现黄色透明现象时即可停止透明，本试验用纯二甲苯透明时一般透明4MIN左右，二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上；浸蜡将透明好的组织放入65℃恒温箱中的装有石蜡的烧杯里浸蜡1H，温度为60℃～62℃，然后放入第二个烧杯里再浸蜡1H，温度为60℃～62℃，石蜡容积为组织总体积的5～10倍以上；包埋将组织块放入包埋用的金属盒中，用包埋机进行包埋。切片将蜡块安装固定在推拉式切片机上，将切片刀装在刀架上，调整刀刃与蜡块至合适位置，使刀刃与蜡块呈5°～10°夹角。先将切片机切片厚度调整为10ΜM，修切组织块表面，直到全部暴露组织块切面为止。然后将切片机切片厚度调整为5ΜM，进行连续切片1。展片、捞片和贴片将切好的蜡片用毛笔托起轻轻放到45℃的水面上，待其完8全展平后，用预先准备好载玻片轻轻捞出。每切完一个蜡块后，必须认真清理水面，不得遗留组织碎片，以防造成污染；捞片时应注意蜡片位置（放在载玻片左或右2/3处中央），蜡片与载玻片之间应无气泡，捞起切片后，立即写上编号。烤片将已放置了蜡片的载玻片呈45°斜置片刻，待载玻片上的水分流下后插入切片架中，放入烤箱内烘烤，一般在60℃烤箱内烤2H。242切片脱蜡二甲苯Ⅰ8MIN→二甲苯Ⅱ8MIN→梯度乙醇（100％Ⅰ，100％Ⅱ，95％，85％，75％）各3MIN→切片置蒸馏水浸泡1MIN243染色置苏木精中染色10～15MIN→自来水冲洗30S→05％盐酸酒精分化20～40S，自来水冲洗30S（苏木精染色较重时应做分化）→伊红染液复染2～3MIN→自来水速洗244脱水、透明、封片梯度乙醇脱水（85％，95％Ⅰ，95％Ⅱ，100％Ⅰ，100％Ⅱ乙醇各3～5MIN）→透明（二甲苯Ⅰ5MIN，二甲苯Ⅱ5MIN）→晾干，中性树胶封片1245镜检观察在显微镜下进行镜检，找出清楚的病变并进行拍照取证。3结果31二甲苯染毒小鼠肾脏组织的大体观察染毒过程中小鼠采食、饮水未见明显异常。染毒5天后Ⅳ组小鼠注射二甲苯后半小时出现角弓反张现象，小鼠后肢瘫软无力，行走困难、左右摇摆，约半小时后恢复正常。7天后未出现此现象。攻毒15D后处死小鼠，解剖观察染毒组小鼠肾组织见有不同程度的出血点和肿胀现象。Ⅳ组小鼠肾组织的出血点多于Ⅱ组和Ⅲ组；Ⅲ组与Ⅱ组的肾组织未见明显区别。Ⅳ组小鼠解剖时腹腔脏器出现黏连现象，不容易分离；Ⅲ组也出现脏器黏连现象，但相对于Ⅳ组情况较轻。32二甲苯对小鼠肾脏组织中SOD活力的影响由表4可以明显看出染毒组小鼠肾脏组织中SOD活力均低于Ⅰ组，Ⅳ组相对于Ⅰ组差异极显著（P001），Ⅱ组、Ⅲ组相对于Ⅰ组差异显著（P005）。Ⅳ组小鼠肾脏组织中SOD活力低于Ⅲ组，差异显著（P005）。Ⅲ组高于Ⅱ组，但差异不显著。表4试验组小鼠肾组织中SOD活力二甲苯染毒分组组织中SOD的活力水平（U/MGPROT）9注与对照组比较,表示相对于对照组差异显著P005，表示相对于对照组差异极显著P001。32二甲苯对小鼠肾脏组织中MDA含量的影响由表5可以明显看到染毒组小鼠肾脏组织中MDA含量均高于Ⅰ组，但Ⅳ组相对于Ⅰ组的差异极显著（P001），Ⅱ组、Ⅲ组相对于Ⅰ组差异不显著。Ⅳ组小鼠肾脏组织中MDA含量均高于Ⅲ组、Ⅱ组，且差异显著（P005），Ⅲ组MDA含量高于Ⅱ组，差异不显著。表5试验组小鼠肾组织中MDA含量二甲苯染毒分组组织中MDA的含量（NMOL/MGPROT）Ⅰ组302±0079Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组注与对照组比较,表示相对于对照组差异显著P005，表示相对于对照组差异极显著P001。Ⅰ组1Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组SOD活力用药剂量ML/KGⅠ组对照组Ⅱ组0125Ⅲ组025Ⅳ组051033二甲苯染毒小鼠的肾脏组织的切片观察肾脏是机体的排泄器官，它可以将机体内的废物读毒物排出体外。而二甲苯属于有毒物质，当二甲苯进入机体后会经循环进入肾脏进行排泄，可能会造成肾脏组织的损伤4。Ⅱ组肾组织肾近曲小管细胞之间边界模糊不清，但病变不是很明显（见图3、图4）。Ⅲ组肾组织肾近曲小管细胞之间边界模糊不清，细胞排列紊乱，脱落到管腔中，相对于Ⅱ组病变较明显见图5、图6。Ⅳ组见皮质区部分近端肾小管上皮细胞刷状缘脱落，有部分出现肾小球破裂、出血见图7），部分近髓处小管上皮细胞肿胀，伴有空泡变性（见图8）。MDA含量用药剂量（ML/KG）Ⅰ组对照组Ⅱ组0125Ⅲ组025Ⅳ组05图1对照组肾组织（HE400）图2对照组肾组织（HE100）11图5中剂量组肾组织细胞排列紊乱，脱落到管腔中（HE400）图6中剂量组肾组织细胞排列紊乱（HE100）图7高剂量组肾组织肾小球破裂、出血（HE400）图8高剂量组肾组织出血（HE100）图3低剂量组肾组织近曲小管细胞之间边界模糊不清（HE400）图4低剂量组肾组织（HE100）124讨论与分析41二甲苯对小鼠肾脏组织中SOD活力的影响SOD是动物体内广泛存在的重要的抗氧化酶，其活力的大小反应了机体内脂质过氧化的程度，间接地反应出细胞受损的程度。SOD是体内特异性超氧阴离子自由基的抗氧化酶，它的作用是将氧自由基歧化，生成氧气和过氧化氢，从而阻断毒性更强的羟自由基的产生。因此，SOD可以清除体内的自由基，有广泛的抗氧化作用，可以保护组织免受自由基的攻击。本试验用二甲苯对小鼠进行腹腔染毒发现，二甲苯可以使机体产生大量的自由基，最终导致SOD活力降低从而引起组织损伤。试验发现Ⅳ组的小鼠肾组织SOD活力较Ⅰ组显差异极显著（P001），Ⅲ组、Ⅱ组较Ⅰ组SOD活力差异显著（P005）；Ⅳ组较Ⅲ组、Ⅱ组差异显著（P005），Ⅲ组、Ⅱ组差异不显著。试验结果中SOD活力降低与染毒剂量呈明显的量效关系，即随着二甲苯染毒剂量的增加SOD活力降低。这一结果与杨巧媛等的研究结果相吻合5。这进一步说明，随着染毒剂量的增加，组织中的自由基数量也增加，而消除自由基的SOD活力降低，使组织损伤的程度也增加。Ⅳ组自由基数目显著增多，致使SOD活力降低极显著，引起肾组织损伤的程度也较为明显。42二甲苯对小鼠肾脏组织中MDA含量的影响MDA的测定常和SOD的测定相互配合进行,SOD的活力间接反映了机体清除自由基的能力,而MDA的含量又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度5。MDA是体内重要的脂质氧自由基，为未饱和脂肪代谢产物，毒强性，可与蛋白质和核酸结构上氨基、巯基等发生交联作用，从而破坏蛋白质和核酸的正常结构，并使之丧失原有功能；还可使细胞间隙增大，通透性增高，加速细胞进一步损伤。本试验用二甲苯对小鼠进行腹腔染毒发现，二甲苯可以机体产生大量的自由基，使SOD的活力降低从而产生大量的MDA。试验发现Ⅳ组的小鼠肾组织MDA含量较Ⅰ组增加极显著（P001），Ⅲ组、Ⅱ组MDA含量增加与Ⅰ组差异显著（P005）；Ⅳ组与Ⅲ组、Ⅱ组差异显著（P005），Ⅲ组与Ⅱ组差异不显著。随着二甲苯染毒剂量的增加，SOD活力降低，进一步引起MDA含量的增加。这说明，随着染毒剂量的增加，组织中的自由基数量也增加，而消除自由基的SOD活力降低，使得MDA含量增加，组织损伤的程度也增加。Ⅳ组自由基的数量明显增加，SOD活力降低显著，导致MDA含量增加显著，引起肾组织损伤的程度也较为明显。43二甲苯对小鼠肾脏的组织学影响本试验通过制作肾脏的组织切片，对染毒小鼠的肾脏进行组织学观察，进一步探讨二甲苯对小鼠的致病作用。肾脏的血流量占心脏每分钟射血量的25％，血液在肾脏流经肾小球及肾小管周13围毛细血管网二套毛细血管系统；通过“逆流倍增”，经肾小球滤过和肾小管重吸收至尿液中的物质，若不能很好地被吸收，肾小管中的浓度可达血液中浓度的数倍，直接损伤肾小管上皮细胞。此外，二甲苯进机体内后可以经生物代谢酶，尤其是在肾小管上皮细胞转化为有毒性的代谢产物。这些因素使得肾组织中以肾小管首先受损2。切片观察四组的试验小鼠肾脏组织发现Ⅱ组肾组织肾近曲小管细胞之间边界模糊不清，但病变不是很明显；Ⅲ组肾组织肾近曲小管细胞之间边界模糊不清，细胞排列紊乱，脱落到管腔中，相对于Ⅱ组病变较明显；Ⅳ组见皮质区部分近端肾小管上皮细胞刷状缘脱落，有部分出现肾小球破裂、出血，部分近髓处小管上皮细胞肿胀，伴有空泡变性2。这一结果与蒋灵芝等报道的相一致4。且与SOD和MDA对组织损伤作用的规律相吻合，说明随着二甲苯剂量的增加，自由基的数量也增加，SOD活力降低，MDA含量增加，所引起的组织损伤程度也增加。5结论小鼠二甲苯急性中毒后肾组织见有不同程度的出血点和肿胀现象。解剖时腹腔脏器出现黏连现象，不容易分离；且用药剂量越高，出血和黏连现象越明显。病理变化主要表现在近端小管上皮细胞刷状缘脱落，细胞排列紊乱，肾小管上皮细胞的崩解、坏死、脱落至管腔。部分近髓处小管上皮细胞肿胀，伴有空泡变性。中毒小鼠肾组织中SOD活性随着二甲苯染毒剂量的增加而逐渐降低，MDA含量随着二甲染毒剂量的增加呈上升趋势，这表明小鼠体内肾脏的损害程度随着二甲苯含量的增加而加剧，即二甲苯对小鼠肾组织损伤的程度与染毒剂量有明显的量效关系。参考文献1罗艳蕊石蜡切片帖片法的改良J生物学杂志,秦卫松,刘志红,芦怡舟,等有机溶剂肾损害的动物试验研究J与透析肾移植杂志,223沈霞芬家畜组织学与胚胎学（第三版）M中国农业出版社,20024蒋灵芝,熊平,谢穗贤,等二甲苯对小鼠染毒后肝肾某些形态学变化J毒理学杂志,175杨巧媛,雷毅雄,凌艺辉室内空气中挥发性有机化合物对小鼠的一般毒性J境与健康杂志,5146穆进军,王扬勇,麻日升急性甲苯、二甲苯中毒86例临床分析J中国工业医学杂志,07杨秀平．动物生理学M北京高等教育出版社,丁剑冰,王士,黄增迅小鼠脾发育分化的组织学及组织化学观察J解剖学杂志,039内蒙古农牧学院,安徽农学院家畜解剖学M第二版北京中国农业出版社，马仲华家畜解剖学与组织胚胎学M第三版北京中国农业出版，范明,秦继山急性二甲苯中毒19例抢救体会J现代医药卫生,12王取南,魏凌珍,孙美芳混苯对大鼠肝肾功能影响的研究J工业卫生与职业病,4813吕丹瑜,刘雅琼,刘宁,等二甲苯对妊娠小鼠及胚胎发育的毒性作用J解剖学报,914屠晓钢,乔凌,卢静银杏黄酮对卡铂所致大鼠肾氧化损伤的保护作用及其机制J解放军预防医学杂,715王家骏,徐兆发,贺安宁,等沙棘油和亚硒酸钠对汞诱导的大鼠肝肾氧化损伤的影响J毒理学杂志,816葛淑玲,刘淑波肝等实质性脏器脱水透明时间的探讨J四川解剖学杂志,2817吕丹瑜,刘雅琼,刘宁,等二甲苯对妊娠小鼠及胚胎发育的毒性作用J解剖学报,5918穆进军,王沄,周金兰,等急性甲苯中毒诊断标准修订的研究J中国职业医学,9陈隆典成功救治重症口服二甲苯中毒一例J江苏医药杂志,0周沧海,吴成秋,李梓民,等甲醛与苯系物对人胚肺细胞联合毒性的作用J南华大学学报医学版,1021赵肃,王任群,王灿,等大气混合污染物致大鼠肺氧化损伤作用J中国公共卫生,8222张豪杰,王国民,孙立安,等大鼠活体供肾切取模型中C02气腹与热缺血联合作用对肾氧化损伤的影响J中华试验外科杂志,叶力克西,王平早期肾损伤系列临床检测的选择及应用J检验医学与临床,WEISSLHISTOLOGY,CELLANDTISSUEBIOLOGYM5THEDNEWYORKELSEVIERSCIENCEPUBLISHINGCOINC,5DALESR,RAIZENNEMRESIDENTIALEXPOSURETOVOLATILEORGANICCOMPOUNDSANDASTHMAJJOURNALOFASTHMA,70致谢感谢各位老师和同学们和我一起度过短暂而又美好的大学时光值此论文完成之际，我深深地感谢李梦云老师对论文的细心指导，和热心关怀。从论文的选题、设计、实施试验到完成倾注了导师大量的心血，同时她还给予学生充分的设计自由度和灵活的运作能动性，充分调动思维，避讳懒惰之嫌，整个试验中导师严谨的治学态度，渊博的知识，精益求精的科学态度以及孜孜不倦的育人精神对我影响至深，它必将激励我迎接人生的种种挑战，定使我受益终身。时光如梭，毕业将近，反躬自问，师恩如海在此，谨向张自强、位兰、王宏伟等多位老师致以崇高的敬意和最衷心的感谢在试验实施过程中得到了王宁、16孟培培、王保迪、徐镨文等等同学的热心帮助在此一起致以深深的谢意。最后，再次向对我完成论文提供过帮助的各位老师，同学和朋友给予的支持和帮助表示最衷心的感谢；同时也向为我提供无限机遇的河南科技大学及为之真情付出的人们致以我最诚挚的谢意；谨以此论文献给你们，略表寸心。于菲日外文资料译文芸香苷对缺血/再灌注诱导大鼠肾损伤的保护作用活性氧被证实参与缺血/再灌注（I/R）对肾脏损伤。本研究旨在探讨的芸香苷在生物类黄酮对I/R肾损伤的影响，大白鼠切除单侧肾脏，2W后，左肾蒂3H后缺血再灌注45MIN。要么芸香苷（1G/KG）或生理盐水给药（IP）的1H前是缺血。在再灌注期结束后，取肾样本作肾丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平，锰17超氧化物歧化酶活性和组织学检查。血清肌酐，尿素氮（BUN）和乳酸脱氢酶（LDH）浓度的肾功能测量评价。缺血/再灌注引起的谷胱甘肽水平和化酶活性伴随着肾组织中MDA的水平增加而显著下跌。同样，在I/R组对照组中，血清尿素氮和肌酐水平，以及乳酸脱氢酶明显升高。用芸香苷预处理大鼠（1G/KG/IP）肾功能不全明显减轻，减少MDA的上升水平，并恢复了贫化酶活性和GSH水平。在这些有益的生化指标变化对应着相应的组织病理变化的现象。这些发现说明ROS在缺血/再灌注诱导大鼠肾损害起着互为因果的作用，芸香苷表现出对肾脏的保护作用，可能是制约ROS和抗氧化剂的活性。关键词缺血再灌注，芸香苷，黄酮类化合物，活性氧，丙二醛，谷胱甘肽，活性氧化酶，小鼠肾脏引言肾缺血是由动脉闭塞或器官移植是引起的，而动脉闭塞或器官移植也是肾细胞死亡、急性肾功能衰竭（ARF）和在移植时的移植肾功能延迟或排斥反应等的常见原因。再灌注加剧了损伤的恶化。这种机制可以解释I/R损伤包括缺氧，活性氧（ROS）的释放，如过氧根（O2），过氧化氢（H2O2）和羟基在再灌注，中性粒细胞聚集，和另外的活性氧和酶裂解后的释放。活性氧与生物大分子发生化学反应，如细胞膜脂质以及蛋白质、碳水化合物、核酸和硫醇有机自由基的形成，18导致脂质过氧化、酶失活、谷胱甘肽氧化和细胞破坏的结果。几项研究表明，活性氧在I/R损伤，尤其是通过脂质过氧化具有重要作用。他们可以导致攻击细胞膜的细胞损伤，通过多不饱和脂肪酸，过氧化膜既可以改变膜的结构和线粒体、溶酶体和质膜功能。细胞对氧化损伤的防御是由几个机制构成的。如超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、过氧化氢酶（CAT）的抗氧化酶，以及非酶化合物，如原型谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸（AA）和维生素E都有助于抵抗潜在损害的作用。谷胱甘肽存在于所有哺乳动物细胞，特别是在肾细胞、肝细胞和红细胞中。活性氧的增加是I/R损伤，和内源性抗氧化剂的消耗的结果。在这种情况下，细胞需要外源性抗氧化剂保护它们来自活性氧引起的损伤。芸香苷（槲皮素3鼠李糖甙）是一种在荞麦，许多蔬菜、水果中、植物源性饮料如茶、酒的黄酮苷类物质。芸香苷也被称为维生素P，它具有抗血小板，抗病毒，抗高血压的属性，以及强化毛细血管，这是它的高活性和清除自由基抗氧化能力的结果。此外，降血脂，细胞保护，止痉挛和抗癌作用也已报告。这些属性有利于对预防疾病和保护遗传物质的稳定性。微核（MN）的检测是诊断在细胞基因组不稳定性的高效率生物标志物。费内奇指出微核频率可以正常化或减少芸香苷、维生素E、抗坏血酸特定营养素的补充，并有一个微量营养素摄入量的减少基因损伤率的最佳水平。此外，香格里拉卡萨清楚地表明，芸香苷大大减少胃粘膜而引起的坏死性胃内灌注剂生产，增加GPX活性。ROBAK和格雷格莱夫斯基表明，芸香苷是超氧化物歧化酶敏感自由基的清道夫，它们引起黄嘌呤氧化酶的活性。杜加斯等测量了一对生成的过氧自由基的抗氧化活性的黄酮类化合物，在他们的研究中，最活跃的化合物是槲皮素，芸香苷其次通过。他们认为，对含有芸香苷和槲皮素食物摄入的降低与自由基介导的疾病有关的某些病理生理学风险潜在作用。也有研究显示一剂量抑制低密度脂蛋白（LDL）的反应过氧化作用的芸香苷17，18此外，米尔德等提出芸香苷中的黄酮由于其对抑制低密度脂蛋白氧化可以减少动脉粥样硬化。尽管如此，还没有任何研究使设计调查芸香苷对大鼠缺血/再灌注肾损害的作用。因此，本研究的目的在于通过确定生化指标和组织学检查，探讨芸香苷在雄性大鼠缺血/再灌注所诱导的急性肾功能衰竭中的作用。1材料与方法11材料芸香苷、NA2EDTA、三氯醋酸、氯化钾、对硝基苯甲酸、十二烷基和来自SIGMAALDRICH公司的1,1,3,3磷酸三乙酯、醋酸、甲醇、乙醇、二甲苯。购自BIORAD公司实验室的蛋白检测试剂盒。所有其他化学品均为分析纯和当地商业来源购买。1912实验动物在这项研究中，使用40只重250～300G的雄性大白鼠。实验的大白鼠来自土耳其安卡拉哈西德佩大学实验动物生产中心。所有的实验程序都符合国家研究理事会准则20进行处理和实验动物保健。此外，所有实验动物的使用程序和确认通过了哈斯特帕大学道德委员会的批准。所有动物均饲养于不锈钢覆盖的聚碳酸酯笼在空调房中（12H光/暗周期，温度为21℃±4℃和相对湿度为50％±10％）。实验的动物于实验开始前的一周进行饲养。在整个实验期间，所有动物提供任意采食，自来水和标准大鼠颗粒食物（KORKUTELIM饲料厂，阿菲永，土耳其）。2实验组和外科手术的缺血/再灌注按以下的实验组（每个组10只），进行研究1组（假手术操作，SHAM）动物麻醉，右侧肾蒂切开不执行肾切除术。2组（右侧肾切除术的操作，SHAMNP）动物的进行右侧肾切除术，但左肾蒂并不闭塞。3组（右肾切除缺血/再灌注组，NPIR）动物单方面接受45分钟的化学处理和3小时的再灌注。4组（右肾切除芸香苷缺血/再灌注组，NPRUIR）动物接受同NPIR一样的处理方式，但是用芸香苷（1G/KG，腹腔）治疗的1小时前是缺血的状态。所有的老鼠被允许恢复的2周前，3组和4组均进行了缺血/再灌注损伤的处理。手术的两个星期后，NPIR组（3组）的动物缺血前1H用05ML生理盐水治疗，然后将左侧肾蒂阻断45MIN以诱导缺血，其次是3小时再灌注。NPRUIR组（4组）的动物缺血前1H用05ML生理盐水稀释芸香苷（1G/KG,IP）进行治疗。余下的实验步骤与3组相同。在肾切除后的第15天大鼠禁食过夜。缺血前1H内，只有05ML生理盐水腹腔注射，或用芸香苷（1G/KG,IP）在05ML生理盐水分别注射第3组和第4组的大鼠。这些动物在手术前和大鼠腹部剃毛用聚维酮碘溶液消毒前用70MG/KG克他命和10MG/KG甲苯噻嗪进行肌肉注射麻醉。手术后的准备，老鼠被放在热桌上以保持恒温。做一中切口将左肾蒂分离。左肾动脉和静脉用防止血管损伤的磁夹造成闭塞45MIN以诱导缺血随后进行3小时再灌注。闭塞证实了肾脏的显着苍白的颜色变化，再灌注后逐渐恢复红色。手术后，这些动物用2ML09％（WT/VOL）的生理盐水冲洗腹腔，然后中线切口缝合后局部应用聚维酮碘溶液处理。在再灌注期结束时，动物颈椎脱位进行安乐死。收集的血液和血清标本存放在20℃至血清中的尿素氮（BUN），肌酐和乳酸脱氢酶（LDH）的测定完成。肾组织样本成两份，立即按照布安对组织学评估解决方案放置或存放在–80℃中为以后测定丙二醛20（MDA），锰超氧化物歧化酶（MNSOD）和原型谷胱甘肽（GSH）的水平做准备。21评估肾功能和血清乳酸脱氢酶水平血清样本用血尿素氮，血肌酐，血清乳酸脱氢酶的标准诊断试剂盒进行检测（审计诊断，软木有限公司，爱尔兰）。肾功能评估包括血清肌酐，尿素氮浓度。血清乳酸脱氢酶浓度用作坏死组织标志。22估计脂质过氧化脂质过氧化的最终产物丙二醛（MDA），是在测定硫代巴比妥酸反应物质形式（TBARS）的21。总之，反应混合物包括81％的SDS，调整PH值35的NAOH溶液，15ML的08％，115％的硫代巴比妥酸水溶液和02ML组织匀浆水溶液（20IN115KCL）。添加蒸馏水使混合液总量达4ML，在沸水浴保存60分钟。在用自来水冷却，混合物在2500转4℃离心10MIN。取出上清液，粉红色的颜色强度在分光光度计532NM处进行测量。巴比妥使用量化的消光系数为CM1和表示为每毫克蛋白质中TBARSS的NMOL量。根据制备1,1,3,3氯化四乙铵的标准曲线计算MDA的浓度。MDA水平表示了每毫克蛋白质中MDA的毫摩尔量。23肾组织蛋白浓度的估算组织蛋白浓度估计使用标准诊断试剂盒（酶标仪实验室。加利福尼亚州）。该法是根据蛋白质与碱性酒石酸铜溶液和福林试剂反应类似证据充分的劳里法22。蛋白质作用的福林试剂按损失的1,2或3氧原子减少了，从而生产一种或几种可能减少的物种，有一个特点，在750NM的最大吸收蓝色的。24还原型谷胱甘肽的估算谷胱甘肽（GSH）是一种亲核的降低性能的自然产生的三肽，在代谢中发挥核心作用的方法途径，以及在大多数需氧细胞的抗氧化系统也发挥重要的作用。在肾组织中GSH含量可测定非蛋白巯基的根据塞德拉克和LINDSAY的描述23。新鲜组织立即均匀的放在冰冷的002M乙二胺四乙酸二钠中。等分的组织匀浆加入50％（WT/VOL）三氯乙酸然后，在室温孵育温度为15分钟，离心。上清液加入PH值89的TRIS缓冲液和55二硫代双（2硝基苯甲酸）（DTNB法）。混合后的溶液，在412NM波长处测定吸光度在5MIN增加的硝基苯甲酸并与空白管作对照。谷胱甘肽是用作外部标准。谷胱甘肽水平用ΜMOL/GPROT表示。25估计锰超氧化物歧化酶（MNSOD）歧化酶是利用开曼测定超氧化物歧化酶检测试剂盒（开曼化学公司，密歇根州安阿伯）。这个化酶检测试剂盒原理是基于细胞色素C还原法用1MM氰化钾所描述的麦科德和FRIDOVICH24。2126组织学分析切除后，每半肾固定布安的解决方案和石蜡包埋。然后，组织包蜡切成5微米薄片，脱水，苏木与伊红染色。光学显微镜观察切片，并作出病理组织学评价，一个病理学家不能盲目的治疗收到动物。从控制和治疗组的肾脏切片观察肾小管上皮细胞，发现肾小管扩张，充血和坏死的上皮。从对10个不同部位的肾组织切片进行了观察，对严重程度的变化进行评估。变化被记录如下无损害（－），轻度损害（），中度损害和重度损害。27统计分析数据表示为手段±扫描电镜单向方差分析（ANOVA）后由邦费罗尼测试用于计算各群体之间的统计意义。P＜005被认为是统计学意义。3结果31肾功能的研究在肌酐、尿素氮和LDH水平列于表1。SHAMNP组与SHAM组比较，并未改变肌酐、尿素氮、和LDH的水平。SHAM组与SHAMNP组比较，动物接受缺血／再灌注明显表现出在血清肌酐浓度增加P005，暗示出现很大程度的肾功能障碍。这反映了在血清血尿素氮明显增加P005，也说明了肾缺血／再灌注导致的肾功能不全。肾缺血／再灌注也导致血清中LDH明显增加P005，这是作为一个肾坏死和肾功能的指标。与芸香苷治疗的大鼠（1G/KGIP）的肌酐，尿素氮和血清乳酸脱氢酶的显着减少。32肾氧化应激表2显示了MDA和GSH含量的化酶在所有实验组肾组织的活动水平。SHAM组与SHAMNP组比较，肾缺血／再灌注导致MDA水平增长。另一方面，NPI/R组用芸香苷治疗的大鼠肾缺血／再灌注导致产生了丙二醛水平获得显著降低。SHAM组与SHAMNP组比较，肾缺血／再灌注的损伤导致组织GSH水平明显减少。芸香苷与处理的I/R组NPRUI/R，谷胱甘肽的浓度在SHAM组与SHAMNP组中并没有明显的不同。在NPI/R组中，MNSOD活性明显高于SHAM组与SHAMNP组。另一方面，在芸香苷治疗的I/R组肾组织中MNSOD水平明显降低，在SHAM组与SHAMNP组中并没有发现不同。表1肌酐、尿素氮和LDH水平分组BUNMG/DLCREATININEMG/DLLDHU/L22SHAM?，Ξ043±002?,Ξ1+,?,ΞSHAMNP?，Ξ053±001?,Ξ2,?,ΞNPIRNPRUIR1,+,Ξ,+,?196±002,+,Ξ102±004,+,?4,+,Ξ2,+,?注值表示为±SEMP005对应SHAMGROUP+P005对应SHAMNPGROUP?P005对应NPIRGROUPΞP005对应NPRUIRGROUP32组织学结果病理变化被分组总结在表3。SHAM组和SHAMNP组并没有显示形态学变化（分别见图1A和B）。相比之下，从获得的未经处理的动物肾脏中显示了未经肾缺血/再灌注治疗的动物出现严重的急性肾小管损伤（分别见图1C和D）。这些功能包括肾小管上皮细胞脱落，充血，肾小管扩张，以及中度至重度坏死。与芸香苷治疗保留了正常的肾脏的肾小球及（图1E）肾小管上皮细胞轻度水肿的形态。4讨论由缺血/再灌注造成的急性肾功能衰竭是一个临床与实验综合征肾功能不全的特点，广泛的肾小管损伤，肾小管上皮细胞坏死，肾小球损伤25,26。活性氧被认为是在肾缺血/再灌注中发挥核心作用，除了几个因素，如中性粒细胞，血小板活性氮物种，凝血系统和黄嘌呤氧化还原酶酶系统。活性氧对肾组织产生许多有害的影响27，因为它们与蛋白质，膜脂，并在肾细胞核酸反应28。我们目前的结果表明，肾切除术与非肾切除的大鼠相比，并未改变肾功能参数（血清肌酐、尿素氮、乳酸脱氢酶、氧化应激和病理特征）。另一方面，肾缺血/再灌注导致大鼠肾功能障碍，氧化应激和病理特征的恶化。在这项研究报告里，我们计划通过测量MDA含量、GSH浓度和MNSOD活性确定在肾脏缺血/再灌注所造成的氧化损伤。脂质过氧化，由活性氧介导的，被认为是一种破坏和损坏细胞膜的重要原因29。随着活性氧的增加，肾脏MDA水平也显着增加，表明由于I/R损伤，脂质过氧化作用增强30。在本研究中，我们发现与SHAM组和SHAMNP相比，MDA含量在肾组织的I/R组中增加。其中在内源性机制中最重要的内源性抗氧化剂是GSH。这种三肽尤其在肾细胞中高浓度的存在。GSH可以清理超氧自由基和保护的巯基氧化蛋白。在肾缺血/再灌注的一个时期后，谷胱甘肽水平下降。随着GSH水平下降，氧化应激增加，23随后，发生细胞损伤32。同样，我们观察到在缺血/再灌注肾损伤中GSH含量明显下降，这与以往的研究相同。除了这个，在本研究报告中随着对肾脏缺血/再灌注的应用，肾脏MNSOD活性明显下降。MNSOD活性的损失导致线粒体中氧化剂含量增加，这可能导致其他线粒体蛋白质氧化或硝化。换句话说，
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