子宫内膜薄怎么办？9 大法宝要用好
作者：柳先廉 东莞市第三人民医院生殖中心
在辅助生殖技术中，我们对子宫内膜的要求除了内膜厚度外，还要看内膜的分型。什么是子宫内膜的分型？我们利用阴道超声来内膜形态进行分型：以典型三线型或者多层子宫内膜，其中外层和中央回声线较强，外层和宫腔中线之间回声较低或者为暗区为 A 型；以均一中等强度的回声，宫腔强回声中线断续不清为 B 型；以均质强回声，没有宫腔中线回声为 C 型 [1]。A 型子宫内膜B 型子宫内膜C 型子宫内膜研究者对子宫内膜的研究包括子宫内膜厚度、形态、子宫内膜的容积、内膜蠕动波、内膜下血流及血流动力学参数，但临床上在辅助生殖技术中的临床应用主要集中在子宫内膜厚度、形态，目前比较公认的观点是 HCG 日子宫内膜厚度&8 mm 时，子宫内膜容受性明显下降，且不存在子宫内膜厚度上限值，A 型较 C 型子宫内膜临床妊娠率显著增高。当发现 HCG 子宫内膜未达到公认标准时，我们有什么方案来改善子宫内膜呢？对于内膜厚度方面，我们通过学习常亚杰 [2]等学者的文章来了解改善子宫内膜的方案。对因治疗对于怀疑对宫腔粘连、子宫内膜结核等导致内膜薄者，首先予解除病因治疗。宫腔镜下宫腔粘连切除术成为治疗宫腔粘连的标准方法，术后应用大剂量雌激素周期（戊酸雌二醇 2～3 mg/次，每日 3 次）治疗来预防粘连复发及刺激子宫内膜的生长，加速裸露区上皮化，使之不相互重新粘连有利于新生内膜的生长，以达到改善月经情况及促内膜修复的效果。Bahadur 等[3]通过抗结核治疗（感染科医生协助诊治）联合宫腔镜瘢痕粘连电切术治疗内膜结核致内膜受损者，可基本恢复宫腔正常形态并增加子宫内膜厚度，有利于进一步助孕措施的进行。低剂量阿司匹林对使用大剂量雌激素（戊酸雌二醇 2-5 mg/次，每日 2～3 次）治疗的患者，因考虑雌激素对血流的影响，联合应用阿司匹林（100 mg）减少血栓的风险是有所裨益的，可以一起使用至妊娠 8 周。己酮可可碱联合维生素 E己酮可可碱为非特异性外周血管扩张药，其代谢产物具有改善血液黏度和改善微循环作用，可改善红细胞变形能力并抑制中性细胞黏附与激活，增加局部血流。维生素 E 具有促进女性雌激素分泌功能，还是一种很重要的血管扩张剂，具有抗氧化保护机体细胞免受自由基的毒害等作用。多项研究表明己酮可可碱联合维生素 E 治疗可显著改善内膜厚度及局部血流。用法：己酮可可碱，400 mg/次，每日 3 次；维生素 E 50～100 mg，每天一次。枸橼酸西地那非用法：经阴道给予西地那非 100 mg/d 治疗后子宫内膜厚度明显改善。颗粒细胞集落刺激因子颗粒细胞集落刺激因子 (granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF) 是重要的促细胞增殖及定向分化的细胞因子，人子宫内膜上存在 G-CSF 及其受体，并随月经周期变化。月经周期中子宫内膜间质的炎性细胞的数量及密度呈周期性变化，通过合成相关细胞因子、水解酶而参与子宫内膜的修复和生长。巨噬细胞等炎性细胞做为化学趋化因子诱导白细胞进入内膜间质中，协助内膜血管的形成。用法：G-CSF 30 mU(300 mg/ml) 进行宫腔灌注。生长激素生长激素 (growth hormone，GH) 为脑垂体远侧部腺垂体合成并分泌的单链蛋白质类激素，通过与其受体或诱导胰岛素样生长因子 1(insulin．1ike growth facter，IGF-1) 的生成而调节生殖功能，可能改善子宫内膜。皮下注射：4U，每天 1 次或隔天一次。仿生物电刺激生物电刺激脉冲可改善盆腔局部环境及循环，目前已广泛应用于妇科疾病中，如特发性慢性盆腔、痛经等，并取得良好的临床预后。干细胞治疗目前已将骨髓间质干细胞（BMSCs）、子宫内膜干细胞（EDSCs）、人胚胎干细胞（h ESCs）、人脐带华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）、羊膜干细胞应用于薄型子宫内膜治疗，但暂处于研究阶段 [4、5]。对于内膜容受性方面孙家珍 [6]研究表明：于排卵前 2 d 及排卵日分别给予 hCG500 IU 宫腔灌注 1 次，可以更有效地提高复发性流产（RSA）患者的临床妊娠率。马淳 [7]也进一步验证了孙家珍的研究结果。刘杰等 [8]发现，在月经第 3～4 天，于 Gn 启动日行子宫内膜轻创术能显著提高 IVF-ET 周期临床妊娠率、胚胎种植率和活产率；Neelam 等 [9]进行 Meta 分析发现，宫腔镜检查及子宫内膜诊刮、活检可改善反复种植失败患者的妊娠结局。庄燕燕 [10]研究表明：宫腔镜检查联合子宫内膜轻创术可以提高 FET 周期的临床妊娠率、胚胎种植率。宫腔异常的患者经宫腔镜治疗后可改善子宫内膜的容受性。子宫内膜轻创术具体操作有如下几种方法：1. 用 4 号刮匙轻轻搔刮整个宫腔 1～4 次，刮出组织送常规病理检查，排除内膜病变 [10]；2. 在 B 超引导下，由专人用特小号刮匙表浅地搔刮宫腔各面并取内膜活检 [11]；3. 用探针探子宫深度，以 5 号小刮匙轻柔搔刮子宫腔内膜各面一圈，刮出子宫内膜标本送病理检查 [8]。GnRH-a[12]降调节（1.8-3.75 mg）联合雌（补佳乐 3-5 mg/次，2 次/日）、孕激素周期用于冷冻胚胎移植的子宫内膜的准备，适用于子宫腺疾病、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合症、不明原因的反复种植失败、薄型子宫内膜、盆腔手术史、月经期高孕酮等。广东省有些专家总结子宫内膜的处理方案用了六个字，我再扩充一下总结十个字，就是：吃吃（雌激素、阿司匹林、维生素 E 等）、灌灌（宫腔灌 HCG、颗粒细胞集落刺激因子等）、刮刮（子宫内膜轻创术、活检术等）、电电（盆底生物电治疗）、针针（生长激素、GnRH-a 等），这也便于大家进行记忆。参考文献[1]中华医学会．临床诊疗指南-内分泌及代谢性疾病分册．北京：人民卫生出版社，2005：6．[2]常亚杰; 粱晓燕. 辅助生殖技术周期中薄型子宫内膜的相关机制及临床对策．实用妇产科杂志．)：820-823.[3]Bahadur A，Malhotra N，Mittal S，et a1．Second-look Hysteroscopy after antitubercular treatment ininfertile women with genital tuberculosis undergoing artificial reproductive therapy[J]．Int J Gynaecol Obstet，)：128-131．[4]余璐萍; 刘英. 干细胞治疗薄型子宫内膜的研究进展．国际生殖健康/计划生育杂志．)：331-334.[5]张燕燕; 许慕慧; 马玲璇; 刘桂香; 徐成康; 李玺. 羊膜干细胞用于修复损伤子宫内膜的动物实验研究．现代医院．)：.[6]孙家珍; 陈帆; 南燕; 申素芳. 排卵期宫腔灌注 hCG 对复发性流产患者子宫内膜胞饮突及临床妊娠率的影响. 广东医学．)：.[7]马淳; 田莉. 排卵期宫腔灌注 hCG 对复发性流产患者子宫内膜胞饮突及临床妊娠率的影响．实用临床医药杂志．)：69-71.[8]刘杰; 郑洁; 雷亚兰; 孙虹; 李薇; 夏敏; 章汉旺. 子宫内膜轻创术对体外受精-胚胎移植治疗结局的影响．实用医学杂志．)：748-750.[9]Neelam P，Tarek G，Luciano GN，et a1．Endometrial injury to overcome recurrent embryo implantation failure：a systematic review and meta-analysisf [J]．Reproductive Biomedicine Online，)：561-571.[10]庄燕燕; 夏飞; 周卫琴; 何琦; 茅彩萍; 华月琴; 吴志南. 冷冻胚胎移植前应用宫腔镜检查联合子宫内膜轻创术的意义．实用妇产科杂志．)：520-523.[11]黄晓阳; 陈莉; 杨海燕; 许培箴; 邢宝玲 ．子宫内膜轻创术对子宫内膜容受相关因子表达的影响．陕西医学杂志．2013(10)：.[12]韩笑; 陈圆辉; 张少娣; 徐晓航; 张翠莲. GnRH-a 降调节方案用于冻融胚胎移植内膜准备的适宜人群简．生殖医学杂志．
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骨髓间充质干细胞移植治疗薄型子宫内膜的实验研究
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value="第一章大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定　　目的:建立一种简便稳定的体外分离、扩增及鉴定Sprague-Dawley(SD)大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。　　方法:采用全骨髓细胞贴壁培养法体外分离、培养和扩增雄性SD大鼠的BMSCs，应用MTT方法检测其生长曲线，流式细胞仪检测BMSCs表面标记，向骨细胞、脂肪细胞定向诱导分化，对培养、纯化的BMSCs进行鉴定，并冻存和解冻BMSCs，观察生长状态。　　结果:全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs可贴壁生长，原代细胞呈椭圆形，集落式生长，经过传代，细胞形态趋于一致，呈纤维细胞样生长。P1，P3，P5 BMSCs生长曲线呈S型，生长迅速;细胞表面抗原CD90表达为阳性，CD34，CD45表达为阴性;在适宜的诱导条件下，BMSCs可成功分化为骨细胞、脂肪细胞;经过冻存复苏后的BMSCs生长特点与未冻存BMSCs无明显差异。　　结论:全骨髓贴壁法分离培养的BMSCs体外扩增能力强，纯度高，可用于进一步研究，是获得BMSCs的简便高效的方法。　　第二章 SD大鼠薄型子宫内膜模型的建立和鉴定　　目的:建立并鉴定大鼠薄型子宫内膜模型，为临床开展干细胞移植提供实验基础。　　方法:　　1.220-280g未交配雌性SD大鼠12只随机分为两组。造模组用无水乙醇宫腔内注射约5min，对照组给予生理盐水。　　2.于术后三个动情周期，行HE染色观察子宫内膜组织形态变化，测量子宫内膜厚度，免疫组化检测子宫内膜细胞标志蛋白角蛋白、波形蛋白及子宫内膜容受性标志蛋白整合素γ3的表达情况。　　结果:　　1.造模组大鼠子宫内膜腺体稀疏，基质水肿，部分区域肉芽组织样增生，厚度明显薄于对照组。　　2.子宫内膜细胞角蛋白，波形蛋白，子宫内膜容受性标志蛋白整合素β3表达明显低于对照组。　　结论:无水乙醇宫腔内注射可成功有效建立薄型子宫内膜薄型，建模成功率100％。　　第三章骨髓间充质干细胞移植对薄型子宫内膜的作用及其机制　　目的:探讨BMSCs移植对薄型子宫内膜的治疗作用及可能的作用机制。　　方法:　　1.联合采用BrdU体外标记和大鼠性别决定基因Sry对移植细胞进行体内示踪。选择健康性成熟雌性SD大鼠72只，随机分为正常对照组（正常大鼠不予任何处理，n=12），PBS对照组（模型鼠给予PBS移植，n=12），静脉早移植组（于建立模型6-8小时后经尾静脉移植BMSCs1×107/只，n=12），宫腔早移植组（于建立模型6-8小时后宫腔原位移植BMSCs1×107/只，n=12），静脉晚移植组（于建立模型12天后经尾静脉移植BMSCs1×107/只，n=12），宫腔晚移植组（于建立模型12天后宫腔原位移植BMSCs1×107/只，n=12）。于移植后12天处死大鼠并留子宫内膜组织标本。　　2.HE染色检测子宫内膜组织结构，测量子宫内膜厚度;免疫组化方法及免疫印迹法检测子宫内膜细胞标志蛋白角蛋白、波形蛋白和CD34的表达，以及子宫内膜容受性标志蛋白整合素αvβ3和LIF的表达。　　3.免疫组织化学法及免疫印迹法检测各组子宫内膜BrdU的表达，PCR技术检测子宫内膜Sry基因的表达情况;RT-PCR检测VEGFmRNA、bFGFmRNA、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、IL-6mRNA的表达。　　结果:　　1.BMSCs移植后12天子宫内膜HE观察与PBS对照组相比，各细胞移植组的子宫内膜均不同程度增厚，腺体数目增多，基质均一，水肿程度减轻，但仍未达到正常对照组水平。　　2.BMSCs移植后12天子宫内膜厚度测量与PBS对照组相比，其余5组子宫内膜显著增厚，差异均有统计学意义;其中宫腔早移植组，静脉晚移植组稍薄于正常对照组，差异无统计学意义，而静脉早移植组，宫腔晚移植组的子宫内膜显著薄于正常对照组，差异有统计学意义;各细胞移植组相比，差异无统计学意义。　　3.BMSCs移植后12天子宫内膜角蛋白的表达免疫组化结果示:各细胞移植组角蛋白平均光密度值均显著大于PBS对照组，但小于正常对照组，各细胞移植组间的角蛋白平均光密度值无明显差异。　　免疫印迹结果示:各细胞移植组角蛋白灰度值均大于PBS对照组，而小于正常对照组;灰度值在静脉早移植组、静脉晚移植组、宫腔早移植组，宫腔晚移植组依次升高，但组与组之间两两比较，差异无统计学意义。　　4.BMSCs移植后12天子宫内膜波形蛋白的表达免疫组化结果示:各组波形蛋白平均光密度值均明显高于PBS对照组;四个细胞治疗组相比，静脉晚移植组小于其余三组，其余三组两两相比，差异无意义。　　免疫印迹结果示:四个细胞移植组均明显高于PBS对照组，而显著小于正常对照组;灰度值在宫腔早移植组，静脉早移植组，宫腔晚移植组，静脉晚移植组依次升高，但差异无统计学意义。　　5.BMSCs移植12后子宫内膜CD34的表达免疫组化结果示:各细胞移植组平均光密度值高于正常对照组，除静脉晚移植组与其比较无差异外，其余三组与之比较均有统计学差异。与PBS对照组相比，宫腔晚移植组和静脉早移植组明显升高，而静脉晚移植组和宫腔早移植组平均光密度值降低，差异无统计学意义。　　免疫印迹结果示:各细胞移植组灰度值高于正常对照组;其中宫腔晚移植组和静脉早移植组显著高于正常对照组和PBS对照组，同时也高于静脉晚移植组和宫腔早移植组，但差异无统计学意义。　　6.BMSCs移植后12天子宫内膜容受性标志物整合素αvβ3的表达免疫组化结果示:PBS对照组平均光密度值最小，正常对照组最大，宫腔晚移植组稍高于PBS对照组，其余组均显著高于PBS对照组;与正常对照组相比，各组的平均光密度值显著降低。宫腔晚移植组，宫腔早移植组，静脉早移植组依次升高，两两比较均有显著差异。　　免疫印迹结果示:整合素αv+β3的灰度值在PBS对照组中最低，正常对照组最高;与PBS对照组相比，其余各组值均显著增高;细胞移植组的灰度值均小于正常对照组，差异有统计学意义;四组细胞移植中，整合素αv在静脉晚移植，静脉早移植，宫腔晚移植组，宫腔早移植组依次降低，两两比较具有显著性差异。　　整合素β3灰度值在静脉晚移植组，宫腔早移植组，宫腔晚移植组，静脉早移植组依次降低，其中后两者相比无统计学差异，其余各组比较均有显著性差异。　　7.BMSCs移植后12天子宫内膜容受性标志物LIF的表达免疫组化结果示:与PBS对照组相比，其余各组平均光密度值显著升高;各细胞移植组平均光密度均小于正常对照组，但差异无统计学意义;四个细胞移植组之间相比，差异均无统计学意义。　　免疫印迹结果示:LIF灰度值在正常对照组中最高，PBS对照组最低;灰度值在宫腔晚移植组，静脉晚移植组，宫腔早移植组，静脉早移植组依次降低，各组之间比较，差异有统计学意义。　　8.BMSCs移植后12天子宫内膜BMSCs的示踪和定位Sry基因表达:提取各组子宫内膜组织细胞的总DNA，用PCR技术检测子宫内膜中Sry的表达，结果示在各组大鼠子宫内膜组织中均未检测到Sry基因的表达。　　BrdU的表达:BrdU在宫腔早移植组，静脉早移植组，宫腔晚移植组，静脉晚移植组依次增强，静脉晚移植组显著强于宫腔早移植组，而与静脉早移植组和宫腔晚移植组之间的差别无统计学意义，PBS对照组和正常对照组大鼠子宫内膜组织中未能检测到BrdU染色阳性细胞。　　9.BMSCs移植后12天子宫内膜组织中VEGFmRNA、bFGFmRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、IL-6mRNA的表达VEGFmRNA RT-PCR结果示:宫腔晚移植组表达最低，静脉晚移植组表达最高，其次为PBS对照组，静脉早移植组，正常对照组，宫腔早移植组，但组与组相比，差异无统计学意义。　　bFGFmRNA RT-PCR结果示: bFGFmRNA在PBS对照组和静脉晚移植组表达相似，显著高于其他各组，其次为宫腔晚移植组，静脉早移植组，宫腔早移植组，正常对照组。静脉早移植组和宫腔早移植组表达无差异。　　IL-1βmRNA RT-PCR结果示:正常对照组表达最低，PBS对照组表达最高，IL-1βmRNA在静脉早移植组和宫腔早移植组子宫内膜中表达低于晚移植组，差异有统计学意义。在早移植或晚移植细胞组内，不同移植途径之间IL-1βmRNA的表达无明显差异。　　TNF-αmRNA RT-PCR结果示:TNF-αmRNA在宫腔晚移植组，正常对照组，静脉晚移植组，PBS对照组，静脉早移植组，宫腔早移植组依次增强，但差异无统计学意义。　　IL-6mRNA RT-PCR结果示:正常对照组表达最低，PBS对照组其次，四个细胞移植组IL-6mRNA表达高于正常对照组和PBS对照组，差异有统计学意义。　　结论:　　1.BMSCs移植于薄型子宫内膜大鼠体内，在不同程度上可促进子宫内膜细胞再生，修复子宫内膜组织，改善子宫内膜容受性，提示BMSCs移植治疗薄型子宫内膜是可行的。　　2.经两个移植途径和两个移植时机移植BMSCs对薄型子宫内膜均有不同程度的治疗效果，还需进一步的研究来选择最佳移植途径和移植时机。　　3.子宫内膜组织中有BrdU阳性表达细胞，BMSCs移植后可迁移归巢到损伤局部组织，可能是治疗薄型子宫内膜的机制之一。　　4.BMSCs移植后大鼠子宫组织中生长因子VEGFmRNA、bFGFmRNA及抑炎因子IL-6mRNA表达上调，而促炎因子TNF-αmRNA、IL-1βmRNA的表达下调，提示移植入体内的BMSCs可能通过自身分化或旁分泌或免疫调节机制促进薄型子宫内膜的修复。"/>
第一章大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定　　目的:建立一种简便稳定的体外分离、扩增及鉴定Sprague-Dawley(SD)大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。　　方法:采用全骨髓细胞贴壁培养法体外分离、培养和扩增雄性SD大鼠的BMSCs，应用MTT方法检测其生长曲线，流式细胞仪检测BMSCs表面标记，向骨细胞、脂肪细胞定向诱导分化，对培养、纯化的BMSCs进行鉴定，并冻存和解冻BMSCs，观察生长状态。　　结果:全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs可贴壁生长，原代细胞呈椭圆形，集落式生长，经过传代，细胞形态趋于一致，呈纤维细胞样生长。P1，P3，P5 BMSCs生长曲线呈S型，生长迅速;细胞表面抗原CD90表达为阳性，CD34，CD45表达为阴性;在适宜的诱导条件下，BMSCs可成功分化为骨细胞、脂肪细胞;经过冻存复苏后的BMSCs生长特点与未冻存BMSCs无明显差异。　　结论:全骨髓贴壁法分离培养的BMSCs体外扩增能力强，纯度高，可用于进一步研究，是获得BMSCs的简便高效的方法。　　第二章 SD大鼠薄型子宫内膜模型的建立和鉴定　　目的:建立并鉴定大鼠薄型子宫内膜模型，为临床开展干细胞移植提供实验基础。　　方法:　　1.220-280g未交配雌性SD大鼠12只随机分为两组。造模组用无水乙醇宫腔内注射约5min，对照组给予生理盐水。　　2.于术后三个动情周期，行HE染色观察子宫内膜组织形态变化，测量子宫内膜厚度，免疫组化检测子宫内膜细胞标志蛋白角蛋白、波形蛋白及子宫内膜容受性标志蛋白整合素γ3的表达情况。　　结果:　　1.造模组大鼠子宫内膜腺体稀疏，基质水肿，部分区域肉芽组织样增生，厚度明显薄于对照组。　　2.子宫内膜细胞角蛋白，波形蛋白，子宫内膜容受性标志蛋白整合素β3表达明显低于对照组。　　结论:无水乙醇宫腔内注射可成功有效建立薄型子宫内膜薄型，建模成功率100％。　　第三章骨髓间充质干细胞移植对薄型子宫内膜的作用及其机制　　目的:探讨BMSCs移植对薄型子宫内膜的治疗作用及可能的作用机制。　　方法:　　1.联合采用BrdU体外标记和大鼠性别决定基因Sry对移植细胞进行体内示踪。选择健康性成熟雌性SD大鼠72只，随机分为正常对照组（正常大鼠不予任何处理，n=12），PBS对照组（模型鼠给予PBS移植，n=12），静脉早移植组（于建立模型6-8小时后经尾静脉移植BMSCs1×107/只，n=12），宫腔早移植组（于建立模型6-8小时后宫腔原位移植BMSCs1×107/只，n=12），静脉晚移植组（于建立模型12天后经尾静脉移植BMSCs1×107/只，n=12），宫腔晚移植组（于建立模型12天后宫腔原位移植BMSCs1×107/只，n=12）。于移植后12天处死大鼠并留子宫内膜组织标本。　　2.HE染色检测子宫内膜组织结构，测量子宫内膜厚度;免疫组化方法及免疫印迹法检测子宫内膜细胞标志蛋白角蛋白、波形蛋白和CD34的表达，以及子宫内膜容受性标志蛋白整合素αvβ3和LIF的表达。　　3.免疫组织化学法及免疫印迹法检测各组子宫内膜BrdU的表达，PCR技术检测子宫内膜Sry基因的表达情况;RT-PCR检测VEGFmRNA、bFGFmRNA、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、IL-6mRNA的表达。　　结果:　　1.BMSCs移植后12天子宫内膜HE观察与PBS对照组相比，各细胞移植组的子宫内膜均不同程度增厚，腺体数目增多，基质均一，水肿程度减轻，但仍未达到正常对照组水平。　　2.BMSCs移植后12天子宫内膜厚度测量与PBS对照组相比，其余5组子宫内膜显著增厚，差异均有统计学意义;其中宫腔早移植组，静脉晚移植组稍薄于正常对照组，差异无统计学意义，而静脉早移植组，宫腔晚移植组的子宫内膜显著薄于正常对照组，差异有统计学意义;各细胞移植组相比，差异无统计学意义。　　3.BMSCs移植后12天子宫内膜角蛋白的表达免疫组化结果示:各细胞移植组角蛋白平均光密度值均显著大于PBS对照组，但小于正常对照组，各细胞移植组间的角蛋白平均光密度值无明显差异。　　免疫印迹结果示:各细胞移植组角蛋白灰度值均大于PBS对照组，而小于正常对照组;灰度值在静脉早移植组、静脉晚移植组、宫腔早移植组，宫腔晚移植组依次升高，但组与组之间两两比较，差异无统计学意义。　　4.BMSCs移植后12天子宫内膜波形蛋白的表达免疫组化结果示:各组波形蛋白平均光密度值均明显高于PBS对照组;四个细胞治疗组相比，静脉晚移植组小于其余三组，其余三组两两相比，差异无意义。　　免疫印迹结果示:四个细胞移植组均明显高于PBS对照组，而显著小于正常对照组;灰度值在宫腔早移植组，静脉早移植组，宫腔晚移植组，静脉晚移植组依次升高，但差异无统计学意义。　　5.BMSCs移植12后子宫内膜CD34的表达免疫组化结果示:各细胞移植组平均光密度值高于正常对照组，除静脉晚移植组与其比较无差异外，其余三组与之比较均有统计学差异。与PBS对照组相比，宫腔晚移植组和静脉早移植组明显升高，而静脉晚移植组和宫腔早移植组平均光密度值降低，差异无统计学意义。　　免疫印迹结果示:各细胞移植组灰度值高于正常对照组;其中宫腔晚移植组和静脉早移植组显著高于正常对照组和PBS对照组，同时也高于静脉晚移植组和宫腔早移植组，但差异无统计学意义。　　6.BMSCs移植后12天子宫内膜容受性标志物整合素αvβ3的表达免疫组化结果示:PBS对照组平均光密度值最小，正常对照组最大，宫腔晚移植组稍高于PBS对照组，其余组均显著高于PBS对照组;与正常对照组相比，各组的平均光密度值显著降低。宫腔晚移植组，宫腔早移植组，静脉早移植组依次升高，两两比较均有显著差异。　　免疫印迹结果示:整合素αv+β3的灰度值在PBS对照组中最低，正常对照组最高;与PBS对照组相比，其余各组值均显著增高;细胞移植组的灰度值均小于正常对照组，差异有统计学意义;四组细胞移植中，整合素αv在静脉晚移植，静脉早移植，宫腔晚移植组，宫腔早移植组依次降低，两两比较具有显著性差异。　　整合素β3灰度值在静脉晚移植组，宫腔早移植组，宫腔晚移植组，静脉早移植组依次降低，其中后两者相比无统计学差异，其余各组比较均有显著性差异。　　7.BMSCs移植后12天子宫内膜容受性标志物LIF的表达免疫组化结果示:与PBS对照组相比，其余各组平均光密度值显著升高;各细胞移植组平均光密度均小于正常对照组，但差异无统计学意义;四个细胞移植组之间相比，差异均无统计学意义。　　免疫印迹结果示:LIF灰度值在正常对照组中最高，PBS对照组最低;灰度值在宫腔晚移植组，静脉晚移植组，宫腔早移植组，静脉早移植组依次降低，各组之间比较，差异有统计学意义。　　8.BMSCs移植后12天子宫内膜BMSCs的示踪和定位Sry基因表达:提取各组子宫内膜组织细胞的总DNA，用PCR技术检测子宫内膜中Sry的表达，结果示在各组大鼠子宫内膜组织中均未检测到Sry基因的表达。　　BrdU的表达:BrdU在宫腔早移植组，静脉早移植组，宫腔晚移植组，静脉晚移植组依次增强，静脉晚移植组显著强于宫腔早移植组，而与静脉早移植组和宫腔晚移植组之间的差别无统计学意义，PBS对照组和正常对照组大鼠子宫内膜组织中未能检测到BrdU染色阳性细胞。　　9.BMSCs移植后12天子宫内膜组织中VEGFmRNA、bFGFmRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、IL-6mRNA的表达VEGFmRNA RT-PCR结果示:宫腔晚移植组表达最低，静脉晚移植组表达最高，其次为PBS对照组，静脉早移植组，正常对照组，宫腔早移植组，但组与组相比，差异无统计学意义。　　bFGFmRNA RT-PCR结果示: bFGFmRNA在PBS对照组和静脉晚移植组表达相似，显著高于其他各组，其次为宫腔晚移植组，静脉早移植组，宫腔早移植组，正常对照组。静脉早移植组和宫腔早移植组表达无差异。　　IL-1βmRNA RT-PCR结果示:正常对照组表达最低，PBS对照组表达最高，IL-1βmRNA在静脉早移植组和宫腔早移植组子宫内膜中表达低于晚移植组，差异有统计学意义。在早移植或晚移植细胞组内，不同移植途径之间IL-1βmRNA的表达无明显差异。　　TNF-αmRNA RT-PCR结果示:TNF-αmRNA在宫腔晚移植组，正常对照组，静脉晚移植组，PBS对照组，静脉早移植组，宫腔早移植组依次增强，但差异无统计学意义。　　IL-6mRNA RT-PCR结果示:正常对照组表达最低，PBS对照组其次，四个细胞移植组IL-6mRNA表达高于正常对照组和PBS对照组，差异有统计学意义。　　结论:　　1.BMSCs移植于薄型子宫内膜大鼠体内，在不同程度上可促进子宫内膜细胞再生，修复子宫内膜组织，改善子宫内膜容受性，提示BMSCs移植治疗薄型子宫内膜是可行的。　　2.经两个移植途径和两个移植时机移植BMSCs对薄型子宫内膜均有不同程度的治疗效果，还需进一步的研究来选择最佳移植途径和移植时机。　　3.子宫内膜组织中有BrdU阳性表达细胞，BMSCs移植后可迁移归巢到损伤局部组织，可能是治疗薄型子宫内膜的机制之一。　　4.BMSCs移植后大鼠子宫组织中生长因子VEGFmRNA、bFGFmRNA及抑炎因子IL-6mRNA表达上调，而促炎因子TNF-αmRNA、IL-1βmRNA的表达下调，提示移植入体内的BMSCs可能通过自身分化或旁分泌或免疫调节机制促进薄型子宫内膜的修复。
摘要： 第一章大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定　　目的:建立一种简便稳定的体外分离、扩增及鉴定Sprague-Dawley(SD)大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。　　方法:采用全骨髓细胞贴壁培养法体外分离、培养和扩增雄性SD大鼠的BMSCs，应用MTT方法检测其生长曲线，流式细胞仪检测BMSCs表面标记，向骨细胞、脂肪细胞定向诱导分化...&&
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