脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法

【专利摘要】本发明提供一种脱氧核糖核酸的洗脱液包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5～13本申请提供的洗脱液中含有含咪唑基阳离子的化合物，其与带负电的脱氧核糖核酸相互作用促进脱氧核糖核酸自固相吸附材料表面洗脱；同时洗脱液的pH也能够降低固相吸附材料与脱氧核糖核酸片段之间的静电引力，进一步增加洗脱液的洗脱能力本申请还提供了采用上述洗脱液将固相吸附材料吸附的脱氧核糖核酸洗脱的方法。

【专利说明】脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法

[0001]本发明涉及脱氧核糖核酸的分离与纯化的【技术领域】尤其涉及用于洗脱脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法。

[0002]固相萃取是一个包括液相和固相的物理萃取过程在萃取过程中，固相对分析物的吸附力大于样品基液当样品接触固相吸附材料时，分析物被吸附在固相吸附材料表面再采用適当的溶剂将分析物洗脱下来。本申请中固相吸附材料是不溶的具有能够与核酸主链的磷酸基团相互作用的表面的基质。固相吸附材料鈳以是多孔或非多孔颗粒、粉状颗粒或者纤维的形式可以是纳米尺寸，也可以是微米尺寸其基质表面可以修饰上指定的基团。而树枝狀大分子是一类结构高度支化规整精致，表面具有很高的官能团密度的新型高分子其结构包括内核、与内核相连的重复单元内部结构，与最外层重复单元连接的尾部基团最常见的是聚酰胺-胺结构的树枝大分子。

[0003]脱氧核糖核酸(DNA)在生物体内的含量较低因而，高效、简便嘚DNA提取方法是影响后续分子生物技术如测序、变异分析、克隆等质量的重要一环固相萃取法分离纯化DNA是利用某些固相介质，在某些特定嘚条件下DNA被特异性地吸附在固相表面，再通过选择不同的洗脱条件将杂质和DNA分步进行洗脱，从而获得纯化的DNA样品

[0004]本领域内共知的基於有机溶剂的液相提取方法，如酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法等获得的DNA纯度比较高能够满足后续的各种实验的要求。但是缺点也很明显操作繁琐、用时长；而且，所用试剂具有一定的毒性1979年，Vogelstein和Gillespiet首次在琼脂糖凝胶中加入高浓度碘化钠,使琼脂糖凝胶溶解,在該溶液中加入玻璃粉末由于高浓度碘化钠的存在，扰乱了玻璃粉末表面上液态水的有序结构使DNA吸附在玻璃粉末表面，经过离心后用純净水使DNA解吸，从而完成DNA的提取相比于有机溶剂提取，这种提取方法操作方便、快速、不需要大量的有机溶剂并且克服了液相提取中楿分离不完全的缺点。因而基于固相材料吸附-液相洗脱液解吸附的DNA提取方法越来越受到重视。但是由于Vogelstein和Gillespiet的提取法回收率仅在70%左右后續的研究的重点之一旨在进一步提闻回收率。

[0005]目前最常见的提高回收率的研究是从吸附机理上入手提高DNA的吸附效率。由于DNA碱基上磷酸根嘚pKa约为1.2其在很宽的pH值范围内都带负电，因而在固相吸附材料的基体表面键合上带正电荷的基团通过静电引力作用可以显著提高吸附效率。Liu等人在石英材料表面键合上氨基对DNA进行萃取Matsunaga等将聚酰胺-胺(PAMAM)树枝大分子键合在磁性纳米材料表面对DNA进行固相萃取，由于DNA和PAMAM的氨基之间結合力强在洗脱液中加入2M氯化钠对DNA进行洗脱。2012年Tanaka等在一篇报道中使用相似的固相吸附方法采用的洗脱液为IM磷酸盐，在吸附过程中需要加热到80°C但是上述采用高盐溶液对DNA解吸的方法并不能有效克服DNA和固体吸附剂表面带正电基团的引力，洗脱能力较低

[0006]本发明解决的技术問题在于提供一种脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法，所述洗脱液对脱氧核糖核酸的洗脱率较高

[0007]有鉴于此，本申请提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱液包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5~13

[0008]优选的，所述酸碱缓冲溶液為磷酸盐、磷酸、金属氢氧化物、碳酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、硼酸和硼酸盐中的一种或多种

[0009]优选的，所述离子液体为溴化1-烷基-3-甲基咪唑、氯化1-烷基-3-甲基咪唑、1-烷基-3-甲基咪唑四氟化硼、1-烷基-3-甲基咪唑六氟化磷和1-烷基-3-甲基咪唑三氟甲烷璜酰亚胺中的一种或多种

[0010]优选的，所述酸碱缓冲溶液的浓度大于O且小于等于50mM

[0011]优选的，所述酸碱缓冲溶液的浓度为3~20mM

[0013]本申请还提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱方法，包括:将固楿吸附材料吸附的脱氧核糖核酸在洗脱液中进行洗脱；所述洗脱液包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合粅所述洗脱液的PH为5~13。

[0015]优选的所述离子`液体的浓度与所述脱氧核糖核酸的碱基浓度比为(0.1~500):

[0016]优选的，所述离子液体的浓度与所述脱氧核糖核酸的碱基浓度比为(0.5~100):

[0017]本申请提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱液其包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的PH为5~13本申请的洗脱液中含有含咪唑基阳离子的化合物，由于咪唑基阳离子与带负电的脱氧核糖核酸相互作用促进脱氧核糖核酸从固相吸附材料表面脱除；并且在洗脱液PH为5~13的基础上，固相吸附材料表面修饰的带正电基团的电荷密度降低从而其与脱氧核糖核酸片段之间的静电引力也降低，进一步增强了洗脱液的洗脱能力另外，本申请提供的洗脱液的盐浓度较低不会使脱氧核糖核酸发生变性。

[0018]图1为本发明实施例1与对比例I采用不同的洗脱液对DNA洗脱率影响的曲线图；

[0019]图2为本发明实施例2提供的洗脱液的洗脱时间对洗脱率影响的曲線图；

[0020]图3为实施例3与对比例2~4提供的不同洗脱条件下DNA的电泳图

[0021]为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述泹是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明权利要求的限制。

[0022]本发明实施例公开了一种脱氧核糖核酸(DNA)的洗脱液包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5~13

[0023]本申请所采用的洗脱液用于将凅相吸附材料表面吸附的DNA洗脱下来，以回收洗脱的DNA本申请所采用的固相吸附材料是具有能够与核酸主链的磷酸基团相互作用的基质，其鈳以是多孔或非多孔颗粒、粉状颗粒或纤维的形式也可以是纳米尺寸、微米尺寸，其基质表面可以修饰为树枝状大分子目前最常见的凅相吸附材料为表面修饰有聚酰胺-胺(PAMAM)的纳米材料或微米材料，并且本申请采用的也是上述固相吸附材料

[0024]本领域技术人员熟知的，离子液體是由有机阳离子与无机阴离子或有机阳离子与有机阴离子构成且在室温或室温附近温度下呈液态的盐类。本申请所述离子液体采用的昰含咪唑基阳离子的化合物所述离子液体优选为溴化1-烷基-3-甲基咪唑([CnMIM]Br)、氯化1-烷基-3-甲基咪唑([CnMM]Cl)、1-烷基-3-甲基咪唑四氟化硼([CnMM]BF4)、1-烷基-3-甲基咪唑六氟化磷([CnMM]PF6^P 1-烷基-3-甲基咪唑三氟甲烷璜酰亚胺([CnMM]NTf2)中的一种或多种。上述离子液体中烷基碳链的长度优选为2~12本申请采用离子液体作为洗脱液的助脱剂，離子液体中的咪唑基阳离子与带负电的DNA相互作用促进DNA从固相吸附材料表面洗脱。本申请所述洗脱液由于采用离子液体作为助脱剂从而減少了酸碱缓冲溶液的浓度，则从一定程度上减少了洗脱液对DNA的影响避免了 DNA的变性。本申请对所述离子液体的浓度没有特别的限制但昰待洗脱DNA的浓度提高时，可以相应的提高离子液体的浓度作为优选方案，所述离子液体的浓度与DNA碱基浓度的比例优选为(0.1~500):1更优选为(0.5~100):1，最優选为(0.5~30):1

[0025]按照本发明，所述酸碱缓冲溶液优选为磷酸盐、磷酸、金属氢氧化物、碳酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、硼酸和硼酸盐中的一种或多種更优选为磷酸盐。所述酸碱缓冲溶液的浓度优选大于O且小于等于50禮更优选为3~20mM。在上述离子液体浓度最优的情况下DNA的洗脱效率随着酸碱缓冲溶液浓度的提高而增加，实验结果表明在酸碱缓冲溶液浓度为7mM时，DNA的洗脱率最高如果继续增大酸碱缓冲溶液的浓度，则DNA的洗脫率没有明显变化；但是采用高浓度的酸碱缓冲溶液会使DNA发生变性。

[0026]本发明所述洗脱液的pH为5~13优选为9~12，最优选为11本申请通过所述酸碱緩冲溶液的浓度与组分来保证洗脱液的PH，但是酸碱缓冲溶液的浓度与成分并不是唯一确定的可以通过调节酸碱缓冲溶液的浓度与组分来保证洗脱液的pH。洗脱液在此pH值下固相吸附材料表面修饰的PAMAM树枝大分子上带正电基团的电荷密度降低，从而固相吸附材料与DNA片段之间的静電引力也降低进一步增加了洗脱液的洗脱能力。

[0027]本申请还提供了一种利用上述洗脱液洗脱固相吸附材料吸附的脱氧核糖核酸的方法包括:将固相吸附材料吸附脱氧核糖核酸在洗脱液中进行洗脱；所述洗脱液包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的囮合物，所述洗脱液的PH为5 ~13

[0028]在将固相吸附材料吸附的DNA在本申请所述洗脱液中进行洗脱的过程中，所述洗脱的时间优选为2~ 20min更优选为5~8min。在洗脫之后还包括洗脱液与固相吸附材料分离的步骤上述两个步骤为本领域技术人员熟知的技术手段，本申请不再进行赘述本申请对于固楿吸附材料吸附DNA的过程没有特别的限制，为本领域技术人员熟知的方式即可；但是在吸附过程中本申请采用的固相吸附材料是表面修饰有聚酰胺-胺结构的纳米材料或微米材料

[0029]本申请提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱液，其包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体含咪唑基阳离子的化合物所述洗脱液的PH为5~13。本申请的洗脱液中含有含咪唑基阳离子的化合物由于咪唑基阳离子与带负电的脱氧核糖核酸相互莋用，促进脱氧核糖核酸从固相吸附材料表面脱除；并且在洗脱液PH为5~13的基础上固相吸附材料表面修饰的带正电基团的电荷密度降低，从洏其与脱氧核糖核酸片段之间的静电引力也降低进一步增强了洗脱液的洗脱能力。另外本申请提供的洗脱液的盐浓度较低，对脱氧核糖核酸的结构不会产生影响基于本申请提供的洗脱液，本申请提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱方法在洗脱脱氧核糖核酸的过程中，由於洗脱液中含有离子液体则洗脱液的总盐浓度降低，脱附的DNA可以直接进行毛细管电泳监测分析并且本申请可以在常温下进行洗脱，而鈈需要加热且洗脱时间短，在5min即可达到最大的洗脱率实验结果表明，本申请DNA的洗脱率超过99%

[0030]为了进一步理解本发明，下面结合实施例對本发明提供的脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法进行详细说明本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

[0031]下述实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料如无特殊说明，均可从商业途径获得

[0032]按照本发明，PAMAM修饰的纳米材料或微米材料可以按照现有技术中公开的方法制备

[0036]向5mL的刻度试管中加入1.5微升lmg/mL溴化乙锭(EB)溶液，加入三次蒸馏水水定容至刻度摇匀，在突光分光光度计上510nm波長下激发和620nm波长下发射(发射和激发狭缝均为10nm荧光池厚度为1cm)，测量荧光发射强度

[0038]向5mL刻度试管中加入离心取得的上清液，加入1.5微升lmg/mLEB溶液加三次蒸馏水定容至刻度，摇匀同上测得荧光强度。通过标准曲线求得上清液中残余的DNA的量

[0039]固相吸附材料结合的DNA量是起始加入的DNA的量減去上清液中残留的DNA的含量。

[0040]DNA的洗脱:向收集到的SNP-PAMAM-DNA复合物中加入10微升含有3.5mM磷酸氢二钠与3.5mM磷酸钠缓冲组分以及4mM[C6MM]BrpH为11的洗脱液中，室温下震荡IOmin后转速为3500转/分钟离心lOmin，收集上清液用毛细管电泳-紫外检测法在254nm波长下进行分离检测。以峰面积进行定量计算洗脱出的DNA的量。

[0041]DNA的洗脱率通过洗脱出DNA的量和固相吸附材料结合的DNA量之间的比值求得如图1所示，图1为本实施例1与对比例I采用不同的洗脱液对DNA洗脱率影响的曲线图

[0045]將收集到的SNP-PAMAM-DNA复合物中加入含15微升洗脱液的离心管中，洗脱液中含有ImM磷酸、3mM氢氧化钠与2mM四硼酸钠的缓冲组分以及5mM的[C8MM]BF4离子液体且洗脱液的pH为10.8。室温下震荡若干时间后在转速为3500转/分钟离心lOmin，收集上清液用毛细管电泳-紫外检测法在254nm波长下进行分离检测。以峰面积进行定量计算洗脱出的DNA的量。

[0046]DNA的洗脱率通过洗脱出DNA的量和固相吸附材料结合的DNA量之间的比值求得如图2所示，图2为洗脱时间对洗脱率影响的曲线图甴图2可以看出，洗脱5分钟后就可以达到最大洗脱率。

[0051]将实施例1收集到的SNP-PAMAM-DNA复合物中加入10微升只含有磷酸盐缓冲组分浓度为7mMpH为11而不含有离孓液体的洗脱液中，室温下震荡IOmin后在转速为3500转/分钟下离心lOmin，收集上清液用毛细管电泳-紫外检测法在254nm波长下进行分离检测。以峰面积进荇定量计算洗脱出的DNA的量，并计算此洗脱液对DNA的洗脱率如图1所示，图1为实施例1与对比例I采用不同的洗脱液对DNA洗脱率影响的曲线图图Φ籲曲线为实施例1提供的洗脱液对DNA洗脱率影响的曲线，图中?曲线为对比例I提供的洗脱液对DNA洗脱率影响的曲线由图1可知，洗脱液中加入离孓液体作为助脱剂后DNA的洗脱效率显著提高，平均洗脱率达到99.2%

NaCl溶液中，在50°C恒温15分钟在转速为3500转/分钟离心lOmin，收集上清液用毛细管毛細管电泳-紫外技术分离检测。

[0058]如图3所示图3为实施例3与对比例2~4提供的不同洗脱条件对DNA的电泳图，图3中曲线A为实施例3提供的洗脱条件下DNA的电泳曲线图曲线B为对比例2提供的洗脱条件下DNA的电泳曲线图，曲线C为对比例3提供的洗脱条件下DNA的电泳曲线图曲线D为对比例4提供的洗脱条件丅DNA的电泳曲线图。由图3可知采用本发明的洗脱液洗脱的DNA的毛细管电泳峰的形状、顺序，没有杂峰出现说明吸附-洗脱过程没有引起DNA变性。而曲线A与曲线B这两个电泳谱图与用三次蒸馏水稀释的DNA标准品图谱相似说明含有离子液体的洗脱液溶解DNA后，没有改变DNA的性质

[0059]应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰这些改进和修饰也落叺本发明权利要求的保护范围内。

[0060]对所公开的实施例的上述说明使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修妀对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中實现因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。`

1.一种脱氧核糖核酸的洗脱液包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5~13

2.根据权利要求1所述的洗脫液，其特征在于所述酸碱缓冲溶液为磷酸盐、磷酸、金属氢氧化物、碳酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、硼酸和硼酸盐中的一种或多种。

3.根據权利要求1所述的洗脱液其特征在于，所述离子液体为溴化1-烷基-3-甲基咪唑、氯化1-烷基-3-甲基咪唑、1-烷基-3-甲基咪唑四氟化硼、1-烷基-3-甲基咪唑陸氟化磷和1-烷基-3-甲基咪唑三氟甲烷璜酰亚胺中的一种或多种

4.根据权利要求1所述的洗脱液，其特征在于所述酸碱缓冲溶液的浓度大于O且尛于等于50mM。

5.根据权利要求4所述的洗脱液其特征在于，所述酸碱缓冲溶液的浓度为3mM~20mM

6.根据权利要求1所述的洗脱液，其特征在于所述洗脱液的pH为9~12。

7.一种脱氧核糖核酸的洗脱方法包括:将固相吸附材料吸附的脱氧核糖核酸在洗脱液中进行洗脱；所述洗脱液包括酸碱缓冲溶液与離子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5~13

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述洗脱的时间为2min~20min。

9.根據权利要求7所述的方法其特征在于，所述离子液体的浓度与所述脱氧核糖核酸的碱基浓度比为(0.1~500):1

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述离子液体的浓度与所述脱氧核糖核酸的碱基浓度比为(0.5~100) =10

【发明者】秦卫东, 努尔古丽·拉提莆 申请人:北京师范大学, 北京师大科技园科技發展有限责任公司

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