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弱问：提DNA时，异丙醇沉淀DNA离心后的沉淀，用 75%酒精洗3次
在这里是 1、离心 ？&&2、倒进去马上倒出来？
加入酒精，弹管壁，使得沉淀分散，然后离心收集沉淀，倒掉酒精
短暂离心，收集管壁残留酒精，吸掉
其实洗一次都够的了…… 具体离心条件呢？ 不等，你可以选择11000xg 离10min
其实10000转上下都是可以的，高了没必要
低了就离久一点，当然也不能太低，比如不要低于7500rpm 我平时用的都是12000rpm。一般至少15min。这样倒的时候不容易把DNA也倒掉。一般洗1-2次就行了，可再用100%的洗一次，这样容易吹干 多谢楼上两位
ATP朋友，如果两次，第二次要短暂离心，也是10000r/m的转速吗？ 时间呢？
高速 短暂离心 允许吗？对离心机是不是不大好 Originally posted by rongshuxia at , 18:46:
多谢楼上两位
ATP朋友，如果两次，第二次要短暂离心，也是10000r/m的转速吗？ 时间呢？
高速 短暂离心 允许吗？对离心机是不是不大好 短暂离心只是为了收集管壁残留的乙醇
我是放在那种小型台式离心机按那个short spin来做的
五六秒都可以了~~转速不一定的，随便转一下就好了 我怎么觉得不对呢
异丙醇 -20度沉淀DNA2h，12000r/m 15min后 得到沉淀
再加0.5ml 75%酒精 沉淀根本分散不了，用液体混合器也打散不了
用枪头吹打吧？？？？？？？？？？
弹管壁 根本就不行 先渦旋，然后離心，最大轉數，１０ｍｉｎ以上！;) 什么叫短离心呢？ Originally posted by rongshuxia at
我怎么觉得不对呢
异丙醇 -20度沉淀DNA2h，12000r/m 15min后 得到沉淀
再加0.5ml 75%酒精 沉淀根本分散不了，用液体混合器也打散不了
用枪头吹打吧？？？？？？？？？？
弹管壁 根本就不行 我用苯酚氯仿法纯化的时候，也是用tip来回吸来溶解的。感觉很多时候弹管壁不好用，比如酶切的时候，我都是用TIP来回吸下，我有的同学就是弹管壁。不过貌似用TIP对大片段的会有破坏 没弹壁，就洗一次
根本就不要离心，即使脱离了，小心倒就是了，不会出去的。
杂质多了 再抽提一次 还有红包的呀？ 开始没发掘耶， 给的好快哦 呵呵& &谢谢！ 酒精浸泡2-3小时，浸泡至白色 离心吧，分子克隆上是这样 不需要弹壁，就用75%酒精洗两次在用无水乙醇洗一次好了。
我实验室的一个师姐是用低速收集DNA沉淀，DNA的絮状沉淀都不粘在试管上的，然后用酒精洗，这样所有沉淀都能充分与酒精接触，然后用枪头把酒精洗出来。这个方法我看她用的很好，很省事，主要是因为这一步的原因，她每次都只抽提两遍，提出来的DNA就满纯了。 8000rpm&&25°以下&&几分钟 就可以了的 12000rpm,10min就够了，晾干，溶解后验证请教载体构建的问题！_百度知道
请教载体构建的问题！
都是没有克隆偶尔有两个载体自联的！我的目的片段大小为2,从T载体上PCR下来之后，做了已经几次了！感受态，电泳胶回收然后用smaI单酶切我的目的片段和载体，请教各位大侠有没有什么改进方法，所以我将酶切后的载体去磷酸化然后连接想请教大家载体构建的问题，就是没有我要的啊.5kb，载体也较大7，已经做过几次了，技术等都没有问题！真是愁啊，或高招请指教.9kb由于是单酶切，转化DH5a
提问者采纳
去除内切酶.SmaI酶切体系是否正确？如果跑胶后目的片段的条带位置正确;10？3。4。载体和目的片段的摩尔数比应为3，可基本确定成功：1之间。6？胶回收后是否跑胶查看浓度，问题可能出现在以下几个环节.胶回收是否成功.连接体系是否正确，也是最容易出错的一步：1到10我想.PCR是否成功？通常酶量不能超过体系1&#47，否则会对之后的连接反应造成影响。5.另外，再通过两者碱基数确定其需加的量，转化时看有没涂错板子。这步是最关键，否则甘油会妨碍酶切的进行，还要确认载体抗性。2：1。希望我的回答可以为你提供帮助O(∩_∩)O~如果还不可以.通常我做双酶切后会进行乙醇沉淀。可以先通过跑胶确定两者浓度
提问者评价
谢谢哦！连上了！鉴定中
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其他2条回答
还明显.5K的话挺大的，我没做过去磷酸化，还有就是对单链进行酶切2，也不好连接。效率会低一点，难道有不同，酶切好切。我做的是原核和昆虫，而且也不知道效果，还是克隆到T-VECTOR上
从t载体上pcr下来 用的什么酶？ 有没带着A
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关于胶回收后乙醇沉淀纯化的问题
我用胶回收试剂盒回收到产物后，用nanodrop测浓度和纯度，浓度在20纳克每微升，测出来的纯度也很低，因为下游实验是4个2000bp的片段进行重组pcr和同源重组到载体上，怕纯度会影响到实验成功率，所以想用乙醇沉淀法纯化浓缩一下。方法是1/10的pH5.2 3M的醋酸钠和3倍体积冷无水乙醇在-20沉淀30分钟，然后4度离心20分钟，倒上清，加75%乙醇摇匀，静置2分钟，4度离心20分钟，再倒上清，通风橱干燥至无乙醇气味，加dd溶解。问题来了:测结果显示有的浓度没有变化，有的甚至是负值。想请教各位什么原因，另外在两次离心倒上清的时候，根本没有沉淀，所谓倒上清就是把EP管里的溶液全倒了而已，大概能留下5、6微升在底部。请问这个操作有问题吗？另外各位大大有什么更好的纯化方法也请不吝赐教。谢谢！
用1倍体积异丙醇和十分之一体积3M 醋酸钠-20三十分钟，12000转，四度离心十分钟，后面和你的一样，用百分之70乙醇洗两次，离心过程同上。烘干乙醇用水溶解。 请问沉淀完离心过后，怎么倒上清才不会让DNA倒掉？ : Originally posted by zhang宇微 at
用1倍体积异丙醇和十分之一体积3M 醋酸钠-20三十分钟，12000转，四度离心十分钟，后面和你的一样，用百分之70乙醇洗两次，离心过程同上。烘干乙醇用水溶解。 请问怎么倒上清才不会把DNA倒出去呢？因为离心过后根本5看不见有任何东西啊 : Originally posted by 将陈爱喝茶 at
请问怎么倒上清才不会把DNA倒出去呢？因为离心过后根本5看不见有任何东西啊
... 可能是DNA 太少了，沉淀后能看见一点沉淀在管壁或者底部。用枪吸 : Originally posted by zhang宇微 at
可能是DNA 太少了，沉淀后能看见一点沉淀在管壁或者底部。用枪吸
... 好的，我试试 1、如果你是切胶回收的，用nanodrop测的是严重不准确的，或者说虚高的成分很大；原因是常规的较回收试剂盒中含有胍盐，会影响读数；
2、你的程序上没有错，可以这么操作的。但是对象不对。PCR片段（短片段）这样浓缩的损失是很大的，一般情况能够截留三分之一就很好了。要想把损失减到最小，可以考虑你加完3倍无水乙醇后混匀直接过柱子，然后洗涤一次，再洗脱就好了，一般你情况下可以达到85%以上；当然你如果换成异丙醇系统效果还会好些；
3、你想浓缩，最简单的就是蒸发浓缩了；
具体的再联系； : Originally posted by woshishui916 at
1、如果你是切胶回收的，用nanodrop测的是严重不准确的，或者说虚高的成分很大；原因是常规的较回收试剂盒中含有胍盐，会影响读数；
2、你的程序上没有错，可以这么操作的。但是对象不对。PCR片段（短片段）这样浓 ... 好的 我试试蒸发浓缩，谢谢了！ : Originally posted by 将陈爱喝茶 at
好的 我试试蒸发浓缩，谢谢了！... 不客气
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驽巴贝斯虫BC-48基因片段在大肠杆菌中的表达与初步应用.pdf56页
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延边大学硕士学位论文
驽巴贝斯虫 船6e豇aca6ajjj 是一种经蜱传播的血液原虫，可引起马属动
物发热、贫血、黄疸和水肿，严重的可致死。该病被世界动物卫生组织 OIE 列
为B类疫病，给养马业造成了巨大的经济损失。驽巴贝斯虫管状蛋白主要起到侵
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贝斯虫裂殖子管状蛋白，而且是该虫属比较重要的保守基因。
本研究利用PCR技术扩增和克隆了610bp驽巴贝斯虫中国吉林株Bc一镐基
因片段，对所克隆的BC一48基因序列与基因库中已发表的序列 u46551 进行比较
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标二抗稀释度为1：4∞O为最佳工作浓度。该方法不与新孢子虫、弓形虫、马巴
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双酶切得到的500bp的片段回收效果不好，是怎么个情况？
我的质粒全长3000多bp& &双酶切后得到2000bp和500bp两个片段&&可是前者亮度较好&&后者亮度较浅& & 要回收500bp&&可是回收后跑胶没条带& &请问各位大神&&这是神马情况啊？？？
ab shuangmeiqie 16hr 55min_副本.jpg
你可以看一下成像的原理，小片段相对大片段不亮是合理的，你可以增加以下模板的量，因为回收本来就有一定的效率，目的片段太少了，回收过程中损失太多了…… 小片段回收是比较麻烦，我前段时间也出现过这个问题，首先应该用试剂盒给的TE，因为TE是弱碱性的，有利于DNA的溶解，我前段时间用灭菌水要过一直不好，因为这个水有点偏酸性了。。另外，在最后一步离心下来的DNA溶液再放到柱子上离心一下，这样会提高回收率。当然了，最后加TE的时候最好60度预热一下。
祝你成功~ 目测质粒浓度太低，增加酶切质粒的量是最有效的解决办法。。。
另外，我一般回收后都直接测定浓度，不再跑电泳检测的。 只要有就可以往下做，不必在意量。大不了下步连接全部加上 : Originally posted by Thomas_T at
小片段回收是比较麻烦，我前段时间也出现过这个问题，首先应该用试剂盒给的TE，因为TE是弱碱性的，有利于DNA的溶解，我前段时间用灭菌水要过一直不好，因为这个水有点偏酸性了。。另外，在最后一步离心下来的DNA溶液 ... 你好&&很感谢你的答复&&方便留个联系方式吗？&&最近做的有点不顺利，想请教您一下。 有的时候即使看不到条带也能出来结果的，多试几次看看。 : Originally posted by Lopick at
你好&&很感谢你的答复&&方便留个联系方式吗？&&最近做的有点不顺利，想请教您一下。...
1、目测你的酶切好像不完全，多切点时间不急做分子实验
2、凝胶回收注意：低温核酸容易结合在柱子上，所以溶胶液可以冷却在4°冰箱2min，然后离心。
3、高温核酸易分离，所以用60°的洗脱液洗脱，那么你得到的回收率可以达到90%以上
暂时给你这么多意见吧