血液筛查中隐匿性乙型肝炎病毒的核酸检测初步研究_刘强_百度文库
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血液筛查中隐匿性乙型肝炎病毒的核酸检测初步研究_刘强
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健康咨询描述：
这个乙型肝炎病毒核酸定量检测结果怎么看？需要怎样合理的治疗？乙型肝炎病毒核酸定量检测2.70e+05&&参考值
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擅长: 尤其在病毒性肝炎、慢性肝炎，急性肝炎等肝病的治疗方面造诣颇深
（点击按钮咨询医生，已有 726 名网友免费获得解答）
您好，乙肝病毒含量的正常值是1000，而你的乙型肝炎病毒核酸定量检测2.70e05，即270000，说明您体内每毫升血液里含有几十万的乙肝病毒，您体内的乙肝病毒含量远远超出了正常值，病毒复制活跃，传染性强，如果不及时控制病毒复制的话，病情有可能会进一步的恶化。不知道您具体的病情是怎样的？身体有什么不适的症状吗？你可以详细的说下病情，我好根据您具体的病情，给您制定科学合理的治疗方法，您看可以吗。
本回答由 石家庄肝病医院 提供、推荐服务有（）
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方法二：点击浏览器上的收藏按钮收藏问题。新型国产乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂的质量评价_百度文库
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乙型肝炎病毒1.4E 09
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目前应结合肝功能检查结果乙肝dna病毒量很高，在专业医生指导下接受抗乙肝治疗，有很强的传染、恶化，防止病情继续加重，病毒在体内活跃高复制
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出门在外也不愁乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒产品说明书
乙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)-荧光定量检测试剂盒
Yi Xing Gan Yan Bing Du(HBV)He Suan Kuo Zeng(PCR)-Ying Guang Ding Liang Jian Ce Shi Ji He
HBV DNA PCR-Fluorescence Quantitative Diagnostic Kit
本试剂盒采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于对临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸DNA的定量检测,本品可用于对乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。本品的检测灵敏度为500拷贝/ml，定量测定范围500～108拷贝/ml。PCR扩增前50℃处理2分钟，利用UNG将PCR反应液中可能存在的前次扩增污染物充分降解，以排除由此引起的假阳性检测结果。
32人份/盒类
别试剂名称规
格样品处理试剂
煮沸法[样品处理液A]4 ml × 1瓶[样品处理液B]&&&1 ml × 1支
柱提取[样品处理液A]4 ml × 1瓶[去抑制剂]&&&&&&
1支[核酸提取柱]32个 × 1袋[样品处理液B]14ml × 1瓶[样品处理液C]4 ml × 1瓶[灭菌纯化水] 1.8 ml × 2支
PCR扩增反应试剂适用所有荧光PCR仪[PCR反应液A]480μl × 1支
(LightCycler 360μl&&& × 1支)[PCR反应液B]480μl × 1支
(LightCycler 360μl× 1支)[PCR反应液C]40μl × 1支LightCycler专用[PCR主反应液]350μl × 1支[氯化镁]150μl × 1支[荧光杂交探针]&&&&&&
1支对照试剂[阴性对照]250μl × 1支[工作标准品①]250μl × 1支&&&&&&(参数见试剂盒内提示)[工作标准品②]250μl × 1支&&&&&&(参数见试剂盒内提示)[工作标准品③]250μl × 1支&&&&&&(参数见试剂盒内提示)[工作标准品④]250μl × 1支&&&&&&(参数见试剂盒内提示)
Roche LightCycler、ABI5700、ABI7000、枫岭FTC2000、博日Line-Gene、MJ Opticon等
经高压灭菌(121℃，30分钟)处理的0.5ml离心管及10μl、200μl带滤芯吸嘴；?髦止娓竦募友?梗桓咚倮胄幕?徽鸬匆牵凰?』蚋稍∩璞浮? 样品可采用血清或血浆样本，血浆采用3%枸橼酸钠抗凝，抗凝剂:血液为1:9。
1.煮沸法——适用LightCycler的操作步骤见【附件1】。2.煮沸法——适用ABI等荧光PCR仪的操作步骤见【附件2】。3.柱提取——LightCycler专用的操作步骤见【附件3】。4.柱抽提——适用ABI等荧光PCR仪的操作步骤见【附件3】。
1.待检新鲜血清或血浆若不及时检测,应保存于-20℃。1.试剂盒各组份使用前请充分融化并摇匀,离心管内的试剂需离心数秒后使用。2.PCR操作各阶段应在不同实验区域进行，包括PCR扩增试剂准备区、标本处理区及PCR扩增检测区。4.在标本处理阶段建议使用负压超净台。5.应穿工作服，戴一次性手套(经常替换手套)，使用一次性用品。6.PCR操作人员应具有经验和受过培训。7.操作过程中用到的超净台、移液器、离心机、扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或70%乙醇及紫外灯处理。8.实验中废弃的吸嘴应弃于含10%次氯酸的废液缸中，以防止污染。9.阴性对照、工作标准品应和待检标本平行进行操作后方可进行PCR扩增。10.使用本试剂盒检测，请按传染病实验室检查规程?僮鳌?
11.血清标本的测定结果比血浆标本测定结果略低。
试剂盒运输可在2～8℃环境下进行。储存时，须置-20℃保存。
本试剂盒有效期为12个月，在有效期内使用。附件1:煮沸法——适用LightCycler的操作步骤1.核酸提取(在标本处理区进行)待测样品处理(将[阴性对照]、[工作标准品①]、[工作标准品②]、[工作标准品③]、[工作标准品④]与待测标本同步进行处理)1.1用带滤芯吸嘴吸取100μl[样品处理液A]于0.5ml离心管中。1.2加入100μl被测标本。1.3盖上管盖，振荡混匀，13000rpm离心10分钟(离心时固定离心管方向)。1.4吸弃上清(沉淀不明显，需在离心管底部沉淀对侧吸上清，应一次吸尽上清，避免搅动或碰到沉淀)。1.5再加入25μl[样品处理液B]。1.6振荡混匀，低速(2000rpm)离心数秒后，100℃干浴或沸水浴10分钟。1.713000rpm离心10分钟，取上清为PCR反应模板。(上清如不立即使用，须置-20℃保存,重新使用时需13000rpm离心10分钟。)2.PCR试剂准备(在PCR前准备区进行)2.1取试剂盒中[PCR反应液A]、[PCR反应液B]、[PCR反应液C]室温融化后，低速(2000rpm)离心数秒。2.2根据待扩增样品数按[PCR反应液A]:[PCR反应液B]:[PCR反应液C]=9:8:1的比例配制PCR反应液，并分装至PCR毛细反应管中，每管18μl，将装有PCR反应液的反应管转移至标本处理区。3.加样(在标本处理区进行)在装有PCR反应液的毛细反应管中用带滤芯吸嘴分别加入2μl已处理好的标本(标本处理步骤1.7的上清)。盖上管盖，离心数秒后转移到扩增检测区。4.PCR扩增检测(在扩增检测区进行)4.1将毛细反应管放入LightCycler荧光PCR扩增仪进行扩增检测。4.2循环参数设定:(荧光检测通道F1)ProgramCyclesTemperature Target(℃)Hold Time(min:sec)Slope(℃/sec)AcquisitionMode11502:0020None21932:0020None34093320None603020Single41351020None4.3样品设置在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型及工作标准品参数(见试剂盒内提示)。5.结果分析5.1选F1或F1/F2通道，点击Quantification按纽，进入数据分析界面。5.2在数据分析窗口中，将噪音线Noise Band的位置移至刚好超过阴性对照正常扩增曲线的最高点，且CT值不出现任何数值为准(可根据仪器本身的实际情况加以调整)，得到各标本的HBV DNA检测结果。6.质控标准6.1工作标准品标准曲线的相关系数│r│≥0.95。6.2阴性对照的测定结果为阴性(低于试剂盒检测下限)。6.3应同时满足上述2项条件,否则试验无效。7.结果判断7.1对于500≤测定拷贝数＜108拷贝/ml的样本，报告相应的测定结果。7.2对于测定拷贝数≥108的样本，所测结果仅供参考，报告上注明≥108拷贝/ml。若需精确定量，可根据所测结果，将该标本用阴性血清稀释至105～106拷贝/ml后复测。7.3对?诓舛?奖词??00拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明＜500拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。7.4对于HBV扩增阴性的标本(Ct无数值)，报告上注明＜500拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。附件2:煮沸法——适用ABI等荧光PCR仪器的操作步骤1.核酸提取(在标本处理区进行)待测样品处理(将[阴性对照]、[工作标准品①]、[工作标准品②]、[工作标准品③]、[工作标准品④]与待测标本同步进行处理)1.1用带滤芯吸嘴吸取100μl[样品处理液A]于0.5ml离心管中。1.2加入100μl被测标本。1.3盖上管盖，振荡混匀，13000rpm离心10分钟(离心时固定离心管方向)。1.4吸弃上清(沉淀不明显，需在离心管底部沉淀对侧吸上清，应一次吸尽上清，避免搅动或碰到沉淀)。1.5再加入25μl[样品处理液B]。1.6振荡混匀，低速(2000rpm)离心数秒后，100℃干浴或沸水浴10分钟。1.713000rpm离心10分钟，取上清为PCR反应模板。(上清如不立即使用，须置-20℃保存,重新使用时需13000rpm离心10分钟。)2.PCR试剂准备(在PCR前准备区进行)2.1取试剂盒中[PCR反应液A]、[PCR反应液B]、[PCR反应液C]室温融化混匀后，低速(2000rpm)离心数秒。2.2根据待扩增样品数按[PCR反应液A]:[PCR反应液B]:[PCR反应液C]=13.5:13.5:1的比例配制PCR反应液，并分装至PCR反应管中，每管28μl，将装有PCR反应液的反应管转移至标本处理区。3.加样(在标本处理区进行)在装有PCR反应液的反应管中用带滤芯吸嘴分别加入2μl已处理好的标本(标本处理步骤1.7的上清)。盖上管盖，转移到扩增检测区。4.PCR扩增检测(在扩增检测区进行)4.3将反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。4.4循环参数设定:(请参照各类仪器的操作软件进行设置)步骤温度时间循环数1UNG酶反应50℃2分钟12预变性94℃2分钟13变性94℃10秒40退火、延伸及检测荧光60℃30秒4仪器冷却35℃10秒1步骤3中60℃时荧光检测，检测通道:530nm(FAM)4.3样品设置在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型及工作标准品参数(见试剂盒内提示)。5.结果分析根据各类仪器的软件进行分析，得到各标本的HBV DNA检测结果。(基线选取6～10或6～15个循环，阈值线选在阴性对照正常扩增曲线的上方)6.质控标准6.1工作标准品标准曲线的相关系数│r│≥0.95。6.2阴性对照的测定结果为阴性(低于试剂盒检测下限)。6.3应同时满足上述2项条件,否则试验无效。7.结果判断7.1对于500≤测定拷贝数＜108拷贝/ml的样本，报告相应的测定结果。7.2对于测定拷贝数≥108拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明≥108拷贝/ml。若需精确定量，可根据所测结果，将该标本用阴性血清稀释至105～106拷贝/ml后复测。7.3对于测定拷贝数＜500拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明＜500拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。7.4对于HBV扩增阴性的标本(Ct无数值)，报告上注明＜500拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。
柱提取——LightCycler专用的操作步骤1.操作前准备1.1将[样品处理液A]置70℃加热5～10分钟，融化后混匀备用。1.2在[样品处理液B]中加入6ml无水乙醇，混匀备用。1.3在[样品处理液C]中加入16ml无水乙醇，混匀备用。1.4在[去抑制剂]中加入700μl[灭菌纯化水]，溶解后混匀备用。1.5准备实验所用的无水乙醇4ml。2.核酸提取(在标本处理区进行)待测样品处理(将[阴性对照]、[工作标准品①]、[工作标准品②]、[工作标准品③]、[工作标准品④]与待测标本同步进行处理)2.1用带滤芯吸嘴吸取20μl[去抑制剂]于0.5ml离心管中。2.2加入100μl被测标本，用带滤芯吸嘴反复吸打3次。2.3再加入100μl[样品处理液A]，盖上管盖，振荡混匀，离心数秒后置70℃反应10分钟。2.4离心数秒后打开管盖，加110μl无水乙醇，盖上管盖，振荡混匀。下接步骤1.5(负压法)或1.12(离心法)。负压法2.5将作好标记的核酸提取柱插入连接管后，固定在负压装置上，将步骤1.4中的所有液体移入核酸提取柱。2.6开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。2.7在每个核酸提取柱内加入500μl[样品处理液B]，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。2.8在每个核酸提取柱内加入500μl[样品处理液C]，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。2.9取下核酸提取柱，将其放入2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。2.10将提取柱放入一新的2ml离心管中，小心将30μl[灭菌纯化水]加在柱面中央，静置1分钟。2.1110000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液5μl做PCR反应模板。离心法2.12将作好标记的核酸提取柱放入2ml离心管中，将步骤1.4中的所有液体移入核酸提取柱。2.1310000rpm离心1分钟。2.14将提取柱放入一新的2ml离心管中，加入500μl[样品处理液B]，10000rpm离心1分钟。2.15将提取柱放入一新的2ml离心管中，加入500μl[样品处理液C]，10000rpm离心1分钟。2.16将提取柱放入一新的2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。2.17将提取柱放入一新的2ml离心管中，小心将30μl[灭菌纯化水]加在柱面中央，静置1分钟。2.1810000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液5μl做PCR反应模板。3.PCR试剂准备(在PCR前准备区进行)3.1在[荧光杂交探针]中加入70μl[灭菌纯化水],溶解后离心数秒。3.2按待扩增样品数n，取[PCR主反应液](n+1)×9.5μl、[氯化镁](n+1)×3.5μl、[荧光杂交探针](n+1)×2μl，充分混匀，离心数秒，分装至PCR毛细反应管中，每管15μl，将装有PCR反应液的毛细反应管转移至标本处理区。4.加样(在标本处理区进行)4.1在装有PCR反应液的毛细反应管中用带滤芯吸嘴分别加入5μl已处理好的标本(标本处理步骤2.11或2.18离心管中的洗脱液)。4.2盖上管盖，离心数秒后转移到扩增检测区。5.PCR扩增检测(在扩增检测区进行)5.1将毛细管放入LightCycler扩增仪进行扩增检测。5.2循环参数设定:(并选用校正好的颜色补偿程序)ProgramCyclesTemperature Target(℃)Hold Time(min:sec)Slope(℃/sec)AcquisitionMode11502:0020None21932:0020None34093020None551520Single721020None41403020None荧光检测通道: HBV DNA F2，内标F36. 结果获取(分析软件版本3.39)6.1HBVDNA检测结果分析:在数据分析窗口中，Fluorescence项目选择F2/Back-F1；将噪音线Noise Band的位置移至刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，且CT值不出现任何数值为准(可根据仪器本身的实际情况加以调整)，得到各标本的HBV DNA检测结果。6.2内标结果分析:将Fluorescence项目改为F3/Back-F1，根据仪器本身的实际情况调整噪音线Noise Band的位置，得到各标本的内标CT值。7.质控标准7.1工作标准品的标准曲线的相关系数│r│≥0.950。7.2阴性对照的拷贝数为0。(结果不显示任何值)7.3应同时满足上述2项条件,否则试验无效。8.结果判断8.1待测标本内标CT(IC)≤36时:8.1.1对于500≤测定拷贝数＜108 Copies/ml的样本，提?颈敬尾舛ń峁?谑约梁杏行Ф?考觳庀咝苑段?凇?
8.1.2对于测定拷贝数≥108的样本，提示病毒含量高于试剂盒定量检测线性范围上限，所测结果仅供参考，报告上注明≥108Copies/ml。若需精确定量，可根据所测拷贝数，将该标本用阴性血清稀释至105～106后复测。8.1.3对于测定拷贝数＜500的样本，提示病毒含量低于试剂盒定量检测线性范围下限，所测结果仅供参考，报告上注明＜500 Copies/ml。8.1.4对于HBV扩增阴性的标本(即结果不显示任何值)，表明HBV DNA检测结果为阴性。8.2待测标本内标CT(IC)＞36时:8.2.1对于测定拷贝数≥108的样本，需根据所测拷贝数，将该标本用正常人血清稀释至105～106后复测。8.2.2对于测定拷贝数＜108的样本，提示PCR的扩增受影响，将该标本用正常人血清稀释10倍及100倍后复测。复测后，如果内标CT(IC)≤36，则可出具报告。反之则提示该样本含有抑制PCR的物质，请与本公司联系。8.2.3对于HBV扩增阴性的标本(即结果不显示任何值)，须重复测定，如果复测结果内标CT(IC)≤36，则表明HBV DNA检测结果为阴性。反之则提示该样本含有抑制PCR的物质，请与本公司联系。
柱提取——适用ABI等荧光PCR仪器的操作步骤1操作前准备1.1将[样品处理液A]置70℃加热5～10分钟，融化后混匀备用。1.2在[样品处理液B]中加入6ml无水乙醇，混匀备用。1.3在[样品处理液C]中加入16ml无水乙醇，混匀备用。1.4在[去抑制剂]中加入700μl[灭菌纯化水]，溶解后混匀备用。1.5准备实验所用的无水乙醇4ml。2核酸提取(在标本处理区进行)待测样品处理(将[阴性对照]、[工作标准品①]、[工作标准品②]、[工作标准品③]、[工作标准品④]与待测标本同步进行处理)2.1用带滤芯吸嘴吸取20μl[去抑制剂]于0.5ml离心管中。2.2加入100μl被测标本，用带滤芯吸嘴反复吸打3次。2.3再加入100μl[样品处理液A]，盖上管盖，振荡混匀，离心数秒后置70℃反应10分钟。2.4离心数秒后打开管盖，加110μl无水乙醇，盖上管盖，振荡混匀。下接步骤1.5(负压法)或1.12(离心法)。负压法2.5将作好标记的核酸提取柱插入连接管后，固定在负压装置上，将步骤1.4中的所有液体移入核酸提取柱。2.6开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。2.7在每个核酸提取柱内加入500μl[样品处理液B]，开启负压，让核酸?崛≈?诘囊禾迦?砍楦伞?
2.8在每个核酸提取柱内加入500μl[样品处理液C]，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。2.9取下核酸提取柱，将其放入2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。2.10将提取柱放入一新的2ml离心管中，小心将30μl[灭菌纯化水]加在柱面中央，静置1分钟。2.1110000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液5μl做PCR反应模板。离心法2.12将作好标记的核酸提取柱放入2ml离心管中，将步骤1.4中的所有液体移入核酸提取柱。2.1310000rpm离心1分钟。2.14将提取柱放入一新的2ml离心管中，加入500μl[样品处理液B]，10000rpm离心1分钟。2.15将提取柱放入一新的2ml离心管中，加入500μl[样品处理液C]，10000rpm离心1分钟。2.16将提取柱放入一新的2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。2.17将提取柱放入一新的2ml离心管中，小心将50μl[灭菌纯化水]加在柱面中央，静置1分钟。2.1810000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液12μl做PCR反应模板。2.PCR试剂准备(在PCR前准备区进行)2.1取试剂盒中[PCR反应液A]、[PCR反应液B]、[PCR反应液C]室温融化混匀后，低速(2000rpm)离心数秒。2.2根据待扩增样品数按[PCR反应液A]:[PCR反应液B]:[PCR反应液C]=13.5:3.5:1的比例配制PCR反应液，并分装至PCR反应管中，每管18μl，将装有PCR反应液的反应管转移至标本处理区。3.加样(在标本处理区进行)在装有PCR反应液的反应管中用带滤芯吸嘴分别加入12μl已处理好的标本(标本处理步骤2.11或2.18的收集液)。盖上管盖，转移到扩增检测区。4.PCR扩增检测(在扩增检测区进行)4.1将反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。4.2循环参数设定:(请参照各类仪器的操作软件进行设置)步骤温度时间循环数1UNG酶反应50℃2分钟12预变性94℃2分钟13变性94℃10秒40退火、延伸及检测荧光60℃30秒4仪器冷却35℃10秒1步骤3中60℃时荧光检测，检测通道:530nm (FAM)4.3样品设置在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型及工作标准品参数(见试剂盒内提示)。5.结果分析根据各类仪器的软件进行分析，得到各标本的HBV DNA检测结果。(基线选取6～10或6～15个循环，阈值线选在阴性对照正常扩增曲线的上方)6.质控标准6.1工作标准品标准曲线的相关系数│r│≥0.95。6.2阴性对照的测定结果为阴性(低于试剂盒检测下限)。6.3应同时满足上述2项条件,否则试验无效。7.结果判断7.1对于500≤测定拷贝数＜108拷贝/ml的样本，报告相应的测定结果。7.2对于测定拷贝数≥108拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明≥108拷贝/ml。若需精确定量，可根据所测结果，将该标本用阴性血清稀释至105～106拷贝/ml后复测。7.3对于测定拷贝数＜500拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明＜500拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。7.4对于HBV扩增阴性的标本(Ct无数值)，报告上注明＜500拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。
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