蛋白质分子因处于等电点状态或失去水化层而产生沉淀的原理相同吗?有什么不同?怎样区别?两者的作用为什么可以叠加?_百度作业帮
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蛋白质分子因处于等电点状态或失去水化层而产生沉淀的原理相同吗?有什么不同?怎样区别?两者的作用为什么可以叠加?
蛋白质分子因处于等电点状态或失去水化层而产生沉淀的原理相同吗?有什么不同?怎样区别?两者的作用为什么可以叠加?
处于等电点状态其本身的电荷被中和,蛋白质在等电点的溶解度最低而沉淀.失去水化层是因为受到外界的因素其本身结构发生改变,使表面的水化层丧失,因而蛋白质相互聚集而沉淀.
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第一章 蛋白质的结构和功能
16:50& 双博士丛书
　　1天然蛋白质中不存在的氨基酸是
　　A蛋氨酸
　　B胱氨酸
　　C羟脯氨酸
　　D同型半胱氨酸
　　E精氨酸
　　2下列哪种氨基酸在肽链中形成拐角
　　A缬氨酸
　　B酪氨酸
　　C脯氨酸
　　D苏氨酸
　　E色氨酸
　　3多肽链中主链骨架的组成是
　　AC2CONHC2CONH
　　BC2CNHOC2CN
　　CC2CHNOC2CHNO
　　DC2NHC2COC2NH
　　ENHC2COC2NH
　　4维系蛋白质三级结构稳定的最重要的键或作用力量是
　　A二硫键
　　D范德华力
　　E疏水作用
　　5β折叠
　　Aβ-折叠中氢键与肽链的长轴平行
　　B只有反平行式结构，没有平行式结构
　　C氢键只在不同肽链之间形成
　　D主链骨架呈锯齿状形成折叠的片层
　　Eα螺旋是右手螺旋，β折叠是左手螺旋
　　6关于蛋白质分子三级结构的描述，其中错误的是
　　A具有三级结构的多肽链都具有生物学活性
　　B天然蛋白质分子均有这种结构
　　C三级结构的稳定性主要是次级键维系
　　D亲水基团多聚集在三级结构的表面
　　E决定盘曲折叠的因素是氨基酸残基
　　7镰刀状红细胞贫血症是由于血红蛋白β链第6位的哪种改变造成的
　　A天冬→缬
　　B甘→缬
　　C丝→缬
　　D赖→缬
　　E谷→缬
　　8在效应物作用下，蛋白质产生的变构(或别构)效应是由于蛋白质的
　　A一级结构发生变化
　　B构型发生变化
　　C构象发生变化
　　D氨基酸序列发生变化
　　E三级结构发生变化
　　9HbO2解离曲线是S形的原因是
　　AHb含有Fe2+
　　BHb含有四条肽链
　　CHb存在于红细胞内
　　DHb属于变构蛋白
　　E由于存在2，3-DDG
　　10蛋白质的变性是由于
　　A肽键断裂，一级结构遭到破坏
　　B蛋白质中的一些氨基酸残基受到修饰
　　C蛋白质分子沉淀
　　D次级键断裂，天然构象解体
　　E多肽链的净电荷等于零
　　11变性蛋白质的主要特点是
　　A共价键被破坏
　　B不易被蛋白酶水解
　　C溶解度增加
　　D分子量降低
　　E生物学活性丧失
　　12关于蛋白质等电点的叙述，下列哪项是正确的
　　A在等电点处，蛋白质分子所带净电荷为零
　　B等电点时蛋白质变性沉淀
　　C不同蛋白质的等电点不同
　　D在等电点处，蛋白质的稳定性增加
　　E蛋白质的等电点与它所含的酸性氨基酸的数目无关
　　13茚三酮试剂能够
　　A与α-氨基酸特异性反应
　　B测出蛋白质中肽键的数量
　　C与α-氨基酸反应释放CO2和NH3
　　D测出蛋白质浓度
　　E茚三酮与氨基酸反应生成化合物的最大吸收峰在280nm波长。
　　14PI为6.5的蛋白质
　　A在pH7的溶液中带正电
　　B在pH7的溶液中带负电
　　C在pH5的溶液中带负电
　　D在pH5溶液中为兼性离子
　　E在pH6.5的溶液中带正电
　　15关于氨基酸的叙述哪一项是错误的
　　A酪氨酸和苯丙氨酸含苯环
　　B酪氨酸和丝氨酸含羟基
　　C亮氨酸和缬氨酸是支链氨基酸
　　D赖氨酸和精氨酸是碱性氨基酸
　　E谷氨酸和天冬氨酸含两个氨基
　　16关于α-螺旋的叙述，下列哪项是错误的
　　A一个肽键的CO和其后第4个肽键的NH形成氢键
　　B螺旋内的氢键方向不与螺旋的轴平行
　　C每一圈螺旋含有3.6个氨基酸，包括13个原子，故可写成3.613
　　D每个氨基酸残基绕轴旋转100°
　　E每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm
　　17下列哪项不符合Bohr效应
　　ACO2浓度增高时，血红蛋白的氧解离曲线右移
　　BBohr效应的机制能用别构作用来解释
　　CCO2的效应实际上是由于PH降低而引起的
　　D血红蛋白的某些咪唑基质子化，使血红蛋白的结构趋于紧密
　　E红细胞内2，3-二磷酸甘油酸浓度增加，使血红蛋白与氧的亲和力增加
　　Aα-螺旋
　　Bβ-折叠
　　Cβ-转角
　　D三股螺旋
　　E无规卷曲
　　18常发生于肽链进行180°回转的转角上
　　19有共价键参与维持其稳定性
　　A生物学活性丧失
　　B特定的空间结构被破坏
　　C蛋白质溶液发生沉淀
　　D蛋白质分子所带电荷被中和，水化膜存在
　　E多肽链中的肽键断裂
　　20在蛋白质溶液中加入适量硫酸铵可引起
　　21在蛋白质溶液中加入HCl水解时可引起
　　APhe-Arg-Ala
　　BPro-Ary-Met
　　C两者均是
　　D两者均否
　　22用胰蛋白酶消化断裂的多肽链
　　23用胰凝乳蛋白酶消化断裂的多肽链
　　A蛋白质沉淀
　　B蛋白质变性
　　C两者都有
　　D两者都没有
　　24加入丙酮可致
　　25加入高浓度硫酸铵可致
　　A二硫键
　　C两者均是
　　D两者均否
　　26能被尿素和盐酸胍破坏
　　27能维持蛋白质的构象
　　28蛋白质在280nm波长处有最大光吸收，是由下列哪些结构引起的
　　A血氨酸的咪唑基
　　B酪氨酸的酚基
　　C苯丙氨酸的苯环
　　D色氨酸的吲哚环
　　29可用于蛋白质多肽链N末端氨基酸分析的方法有
　　A2，4-二硝基氟苯法
　　B丹磺酰氯法
　　C肼解法
　　D茚三酮法
　　30蛋白质的β折叠
　　A是一种比较伸展的肽链结构
　　Bβ角蛋白具有典型的β折叠
　　C若干锯齿状肽链骨架平行或反平行排列，链间靠氢键维系
　　D两个相邻的肽平面呈折扇状折叠
　　31可根据蛋白质的下列哪些性质来分离纯化蛋白质
　　A蛋白质分子的大小
　　B蛋白质的溶解度
　　C蛋白质分子所携带的电荷
　　D蛋白质的吸附性质
　　答案及解析
　　第一章 蛋白质的结构和功能
　　1.答案：D
　　评析：
　　本题考点：天然蛋白质中氨基酸的类型。除甘氨酸外，均为L-α-氨基酸。
　　2.答案：C
　　评析：
　　本题考点：氨基酸的结构和肽链的形成脯氨酸是亚氨基酸，它的α-N在固定五原环上，形成肽键和必然造成肽链的拐角，所以本题正确答案为C。
　　3.答案：A
　　评析：
　　本题考点：多肽链骨架的形成形成肽键的肽单元结构为C-2-CON-H-C-2是由-分子氨基酸的α―氨基与另一分子氨基酸的α―羧基缩去―分子水形成，所以本题正确答案为A。
　　4.答案：E
　　评析：
　　本题考点：蛋白质的三级结构。是多肽链在二级结构的基础上再行拆叠形成的三级结构，维系其结构的非共价键有：氢键、离子键、疏水键、范德华力、二硫键，最主要的键是疏小键。
　　5.答案：D
　　评析：
　　本题考点：β-折叠的结构特点。β-折叠呈折纸状或锯齿状，氢键连接，主链骨架形成锯齿状折叠的片层。
　　6.答案：A
　　评析：
　　本题考点：蛋白质的三级结构具有一条多肽链的蛋白质，必须具有三级结构才有生物学活性，但许多有生物活性的蛋白质由两条或多条肽链构成，因此只具有三级结构的多肽链并不一定具有生物学活性。
　　7.答案：E
　　评析：
　　本题考点：蛋白质的一级结构与分子病。HbAβ链第6位为谷氨酸，而患者HbSβ链第6位换成了缬氨酸。HbS的带氧能力降低，分子间容易“粘合”形成线状巨大分子而沉淀。红血胞从正常的双凹盘状被扭曲成镰刀状，容易产生溶血性贫血症，这种病与正常蛋白质分子结构改变有关，故称之为“分子病”。所以本题的正确答案为E。
　　8.答案：C
　　评析：
　　本题考点：别构效应。一个蛋白质与它的配体(或其他蛋白质)结合后，蛋白质的构象发生变化，使它更适合于功能的需要，这种变化称别构效应。
　　9.答案：D
　　评析：
　　本题考点：HbO2的结构与功能的关系。Hb的四个亚基，其中一个亚基与O2结合后，能促进第二个及第三个亚基与O2的结合，当三个亚基与O2结合后，又大大促进了第四个亚基与O2的结合，这种效应称为正协同效应，属于变构调节。Hb与O2的解离曲线呈S形，是典型的变构蛋白调节的动力学特点。
　　10.答案：D
　　评析：
　　本题考点：蛋白质的变性蛋白质的变性是指以物理性或化学性方法瓦解蛋白质的空间构象，破坏了维持二、三、四级结构的力量，一般不影响其初级结构，所以正确答案为D。
　　11.答案：E
　　评析：
　　本题考点：变性蛋白质的性质。生物学活性消失，是变性蛋白质最主要的性质。
　　12.答案：A
　　评析：
　　本题考点：等电点的定义及性质。在某种pH环境中，蛋白质可能不游离，也可能游离成阳性离子及阴性离子的程度及趋势相等，成为兼性离子。在电场中它既不移向阳极，也不移向阳极，此pH称为该蛋白质的等电点。蛋白质的等电点决定于氨基。
　　13.答案：C
　　评析：
　　本题考点：氨基酸的化学性质所有的氨基酸均能与茚三酮反应，故对α-氨基酸的反应不是特异的，蛋白质水解后可用于定量测定水解产物中氨基酸的含量，但不能用于判断肽键的数目，也不能用于蛋白质浓度的测定。在弱酸性溶液中，茚三酮的还原产物还可与氨及另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色的化合物，该化合物的最大吸收峰在波长570nm处。
　　14.答案：B
　　评析：
　　本题考点：等电点在溶液中，当pH=PI时，蛋白质为兼性离子；当pH＜PI时，蛋白质带正电；当pH＞PI时，蛋白质带负电。
　　15.答案：E
　　评析：
　　本题考点：氨基酸的分子结构谷氨酸和天冬氨酸含有两个羧基，是酸性氨基酸。
　　16.答案：A
　　评析：
　　本题考点：α-螺旋的结构。α-螺旋是由第一个肽平面羧基上的氧与第四个肽平面亚氨基上的氢形成氢键，氢键的方向与螺旋长轴基本平行。多肽链主链每隔36个氨基酸残基螺旋上升一圈，每个氨基酸残基向上平移0.15nm。常用Nm来表示蛋白质结构中的螺旋，其中N为每上升一圈的氨基酸残基数，m表示氢键封闭环的原子数，因此，α螺旋又称3.613螺旋。所以本题正确答案为A。
　　17.答案：E
　　评析：
　　本题考点：Bohr效应。Bohr效应机制是由别构作用引起的，是当pH降低和CO2分压升高都使Hb对O2的亲和力降低，氧解离曲线右移，有利于O2的释放。Hb与O2的结合受pH值及CO2分压的影响，而与2，3-二磷酸甘油酸浓度无关，故本题答案为E。
　　22、23.答案：C、A
　　评析：
　　本题考点：蛋白酶肽链裂解位点自然界中有许多蛋白内切酶，它们对底物有很强的专一性，对底物切点附近的氨基酸序列有很严格的要求。其中胰蛋白酶仅仅催化水解肽链中Lys或Arg残基羧基端的肽键，而胰凝乳蛋白酶仅水解断裂肽链中Phe、Tyr、Trp残基羧基端的肽键。
　　24、25.答案：C、A
　　评析：
　　本题考点：蛋白质的沉淀及变性。在蛋白质溶液中加入大量中性盐，蛋白质胶粒的水化层即被破坏，其所带电荷也被中和，从而使蛋白质发生沉淀，这种盐析沉淀蛋白质的优点是不发生变性，硫酸铵沉淀蛋白质即为盐析作用；而在蛋白质中加入丙酮等有机溶剂，可破坏蛋白质的水化膜而使其沉淀，在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。
　　26、27.答案：B、C
　　评析：
　　本题考点：蛋白质中次级键的特点蛋白质中的氢键是由第一个肽平面羰基上的氧与第四个肽平面亚氨基上的氢形成氢键，尿素和盐酸胍中均有羰基，可与亚氨基上的氢形成氢键。而二硫键则是S=S，尿素和盐酸胍是不能将其破坏的。
　　28.答案：BCD
　　考点：氨基酸的结构与性质。芳香族类氨基酸能在280nm波长处有最大吸收峰。
　　29.答案：AB
　　考点：多肽链N末端氨基酸分析法。多肽链N末端氨基酸分析的常用方法有两种，一是二硝基氟苯(FDNB)法，二是丹磺酰氯(DNS)法，两种测定方法原理基本相似，但后者灵敏度比前者高近100倍。
　　30.答案：ABCD
　　考点：蛋白质的β折叠
　　31.答案：ABCD
　　考点：蛋白质的性质及其分离纯化。蛋白质性质分离纯化方法举例；蛋白质分子的大小凝胶色谱法、超离心分离；蛋白质的溶解度盐析；蛋白质分子所携带的电荷电源；蛋白质的吸附性质离子交换层析
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第一章_蛋白质的结构与功能
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3秒自动关闭窗口蛋白纯化经验指南（5）
蛋白纯化经验指南（5）
151)&&我想纯化一蛋白，分子量10kd左右，目的蛋白来自血液中，浓度大概为每毫升20纳克左右，其他性质不详。手边暂时没有bio-rad蛋白质纯化用mini-protein电泳仪，无法用tricine-sds-page纯化。反相液相色谱柱c18又太贵，有没有其他比较好而且又经济的方案？谢谢。
&只能在离子交换, 凝胶过滤, 疏水中去试吧.这么低的含量,先建立好的检测方法最要紧.
152)你好, 我没做过层析,我想纯化经胃蛋白酶消化的血浆蛋白, 使产物F(ab')2含量达到80%以上.
现在的工艺F(ab')2含量在45-65% . 请教大规模层析方案. 一次处理量为100万毫升, 蛋白含量约2% .
&我觉得可以在疏水和离子交换的办法中去试.你的样品中主要的杂质是白蛋白和IgG吧,你也可以把这些物质去掉达到去除杂质提高纯度的目的.
153)我想问一下Ｃ８柱用于分离蛋白质或肽类物质时，怎样选择洗脱的试剂？我对ＨＰＬＣ不懂，但现在需要用！谢谢！
&你查一篇文献就知道了,比较简单,就是低浓度的乙腈水加三氟乙酸平衡柱子,然后在用高浓度的乙腈水加三氟乙酸线性剃度洗脱,基本就这样,具体的浓度要自己看你蛋白特性而调整了.不少HPLC的文献都有具体的方法.
154)&今天花了一个晚上浏览，收获蛮大，我的问题是这样：纯化GST融合蛋白（加上GST共90kD多），用amersham的1ml柱，曾经纯化出来，但酶切后就不见目的蛋白，只见GST，这次更悬，没有加凝血酶切，但洗脱柱后就在GST大小附近有带，菌液预先小量诱导有目的条带（90kD，没有GST条带），不知道是什么原因，诱导条件：IPTG0.1mM，26～29度3小时。细菌离心后用PBS重悬，-80度反复冻融3次，蛋白酶抑制剂只加了PMSF，超声（可能有点过，有部分泡沫），加tritonX100后RT摇20min，添加DTT至10mM（操作手册说可以增加跟柱的结合）后10000g离心，上清过柱按说明操作。SDS-PAGE的结果，沉淀仍然有大量目的条带，过柱前的上清的同一位置就只有很淡条带，过柱后相类似，PBS洗出液里蛋白就较稀少，但关键洗脱液中就只见约26kD的条带，怀疑GST，但从何而来？
我曾经按此步骤纯化过分子量比较小的一个蛋白（含GST约55kD），纯化得率还可以，但这次失败的原因是什么呢？
&我怀疑是超声过了也许断裂了,所以这样,或者使蛋白变性都有可能,至于切了没有目标蛋白会不会切了以后不稳定,就沉淀在柱子上,这样就只有切的了,你可以用变性剂看看能不能洗下来东西.我想这是原因吧.
谢谢chromatography的教导，现在我已经决定不切除GST，凝血酶也很贵，不成功，则成＃％￥，所以，应该GST对研究影响不大吧。
是不是融合蛋白在融合位点就特别脆弱呢？我添加的DTT是不是也有影响？怎样超声不会太过？我500ml菌液浓缩到15mlPBS，超声几次都还很粘稠，请再给予指点。
变性剂是指哪些？
此外，听您讲有国产的层析柱还是怎样，可否给小弟一些资料？
&我不做上游,但是处理的时候,书上是写如果超声的强度过大,时间过长,有可能会变性或者断裂,加DTT有没有影响我不很清楚,预处理这个问题你还是问问外面做表达和提取的人吧.变性剂常用的是尿素和盐酸胍
155)&我的酶蛋白单体分子量约为90KD，其四聚体的分子量约为360。
我现在用的凝胶柱是S-200，是不是不大合适？此外，做SDS-PAGE时，有一条杂蛋白，和我的目标蛋白距离很近，一直分不开。不知道该怎么办？
&你纯化出来应该是不错的,因为这样你的目标蛋白正好在纯化范围外,至于很近的杂质有没有可能是降解的产物呢,其实你也可以用s-100试试.如果没有,那就用现在的吧
156)我在做一个核内定位的蛋白，预测等电点是10，60KD。做过好久的亲和纯化，有N端his-tag，C端his-tag,
还有N端GST-tag的，纯化时的问题都一样：包涵体表达为主，上清含量很少。用低离子强度的PBS破菌的化，上清中含量会多一些，但是蛋白不挂亲和柱。洗脱出来的微量目的蛋白中目标蛋白只占很少一部分，用透析，PEG浓缩等等操作又都能使蛋白完全沉淀。上清用硫酸铵沉淀浓缩以后过疏水柱也不挂，也试过阴、阳离子柱，还是不挂柱。因为蛋白活性未知，所以我不倾向于做包涵体纯化，但是也曾经试过分级洗涤提包涵体蛋白，都没能拿到比较纯的包涵体，而且在包涵体中his－tag耦连的该蛋白也不挂柱，很迷惑，在变性条件下不应该存在tag被蛋白屏蔽的问题吧？
既然是包涵体本身应该有一定的纯度，不挂柱，那你用的是哪家的产品呢，此外怎么操作呢，你能说详细点吗，有的时候也许结合力比较弱，所以要选择镍密度高的填料，延长作用时间，提高pH值，降低流速，一般天然结构不挂的时候有，但是变性不挂很难理解，此外你的样品里有没有别的物质干扰挂柱，原因挺多的，所以需要你说详细点。
&我用的亲和柱是qiageon的Ni-NTA
agrose，应该不是镍柱质量问题，用这套操作体系纯化过几个其他his-蛋白效果都很理想，至于是不是有其他物质干扰我也不能确定，但是我试过这么多载体和tag，效果都一样，就觉得是蛋白本身性质的问题了
&据说在靠近等电点附近的ph条件下，8M尿素体系的his蛋白是不挂柱的，不知是不是有这个情况，但是据预测的数据来看，好像ph8.0的缓冲体系应该不存在这个问题的
&至于操作呢，亲和纯化我们用的都是agrose，在离心管里agrose与菌体上清4
度或者室温结合2hr～过夜不等，结合条件应该是很充分的了，很迷惑
&另外如果是86KD的蛋白与其他60KD以下的杂带分开的话，用哪种型号的分子筛来做HPLC合适呢？
&做HPLC的话那你可以用TSK系列的凝胶柱,不过处理不了多少样品,虽然每家都产镍柱,他们的产品其实结构是不一样的,而效果也会有一些差别,因此我建议你可以换一种填料试试,没有听说哪家的填料是最好的,我没有用过这个公司的填料,但是它的结构我很清楚,我个人感觉这个填料的吸附力是比较弱的,因为我看过一般洗脱通常在200-300uM咪唑之间,而且由于它的填料结构是有三个螯合基团螯合镍离子,而通常用的只有两个,这样剩余用在和his作用的镍离子的价数就少一个,这样必然会吸附力不如只有两个的,这是我个人的见解.我用的填料有不少洗脱要在300-400mM咪唑,可见作用力还是有差别的,结构也是有差别的,这些差别和琼脂糖没有关系,只和配基本身的结构有关.
&如果你说的pH的问题,那你可以再提高pH看看,反正是变性的,无所谓,你提高的10或者10.5看看,也许这样能挂住.
此外你也可以考虑换个别的离子看看能不能挂柱,不过好象你的填料也没有办法换离子,这个也是它的缺陷.
157)&我用离子层析得到人总IgG，含有IgG1,IgG2,IgG3,IgG4，然后用亲和层析获得各个亚类，它们的分子量分别为：146，146，170，146，分子量差别很小，用常规的SDS-PAGE+考马斯亮兰很难鉴定它们的纯度，请问用何方法来鉴定它们的各自纯度。
&哦,什么亲和能把这几个亚类分开,我记得好象说只有羟基磷灰石能把一些亚类分开,至于鉴别我没有做过,我觉得只能用专门检测亚型的试剂盒去检测他们了.
158)&请问：DEAE-和CM-纤维素柱用完后可以用20%的酒精过柱保存吗？或用1M醋酸钠
还有它们的上样浓度一般在什么范围内？有没有什么要求？
&应该可以用20%乙醇保存,就是柱子中填料也许会缩小一些,用醋酸钠也需要加防腐剂例如叠氮钠等把,否则也会长菌的.
上样的浓度应该关系不大,只和上样的总蛋白量有关,你可以查他们的载量,我觉得一般的离子交换填料的上样量也就在&20mg/ml左右,太高我没有上过.
159)&我现在想用蛋白来亲和纯化我的抗体
蛋白SDS-PAGE就有一条带，但western效果很差，所以我想进一步纯化一下蛋白，来亲和纯化抗体。现在我想电洗脱来纯化一下蛋白，但对用考染后的蛋白是不是可以用于亲和柱来纯化抗体呢具体应注意什么问题呢？&&变性的蛋白既然能免疫,那么直接偶联到填料上做成柱子来纯化你的抗体应该没有问题,但是变性后的蛋白偶联很麻烦,因为如果你的变性蛋白要在盐酸胍或者脲里溶液,那它们都有氨基也许也会和活化的填料偶联,所以你的蛋白在普通缓冲液中能溶解才成.考染后的蛋白估计是不适合做抗体的配基,你可以跑电泳只切一条染色,这样知道位置后再把剩下电泳板切胶电洗脱就可以.我没有做过这个实验,所以抱歉,你可以在DXY里搜索,你会找到电洗脱的一些帖子的.
160)&请问chromatography : 我用QIAGEN公司的Ni-NTA纯化his
tag 融合蛋白,杂带忒多,摸过很多条件,做过很多不同的蛋白,结果都一样.能否麻烦老兄寄一份his纯化的资料让我好好学习学习.
&我已经把材料发给你了,你可以参考一下,或者改用我们公司的镍琼脂糖凝胶试试.去除这些杂带一般可以用降低pH洗脱,同时在缓冲液里加一些非离子表面活性剂,这样可以降低非特异吸附.
161)你好版主！我想请教一个问题：8M尿素溶解的蛋白能否直接做疏水或凝胶层析？另外separose
4FF分离2万左右分子量的蛋白效果会如何？如果改成 6FF应该怎样换介质？
8M尿素溶解的蛋白不加盐的话估计是挂不住的,你可以降低一点脲的浓度,这样才能保证硫酸铵能溶解在这里面.做凝胶过滤得小心点,在变性的条件下,蛋白都是线性分子,凝胶过滤是很难分开的.用separose系列分离这么小的效果也不会好的,除非是差别很大,即使separose6FF也未必好用.
162)&请问chromatography 师兄,
纯化his蛋白,用降低pH洗脱和梯度咪唑洗脱有什么不同吗? 梯度ph洗难道不会使蛋白变性吗?
&低pH和咪唑不一样,降低pH可以减弱蛋白和金属离子的作用力,这样吸附弱的蛋白容易被洗脱,而咪唑是竞争洗脱,它们原理是不同的,互相配合可以使一些咪唑洗不去的杂带洗掉,低pH也就到4-5左右,短时间不少蛋白不会变性的.
163)&&我纯化一个原核表达的热休克蛋白融合蛋白，超声裂菌后40％硫酸铵沉淀，然后DEAE
FF纯化下来纯度85%左右，有3条杂带，分别为130KD+、～55KD、～45KD，目标蛋白分子量为74KD，偶的要求是要达到电泳纯所以偶选了phenyl做进一步纯化，可是偶的这个蛋白比较奇怪2M
NaCl才能挂柱，（用硫酸铵的话还没挂柱就沉淀了），可是挂上之后0M
NaCl也洗不下来，而且杂蛋白的性质和目标蛋白很象也弄不下来，是不是偶的疏水做的有问题呀？还有一个问题就是国产的柱子和仪器哪家的比较好？我现在用的柱子没有接头，对拉梯度会不会有很大影响？
&其实你这个操作我觉得你可以这样,沉淀后直接上疏水,然后再过离子交换,至于你说的沉淀你可以稀释到低一些的硫酸铵蛋白就不沉淀了,它不需要那么高的浓度,一般1.5M左右看有没有沉淀,能不能挂在柱子上,洗脱洗不下来可以在洗脱液体中加5-10%的甘油或者乙二醇,应该和你操作没有关系.
国产的机器和柱子上海就有,上海沪西的就不错,柱子一般用锦华的.如果你的柱子没有死体积就没有关系.
后面的操作没有问题,一点坑没有关系
&我之所以不先用疏水是因为疏水的分离效果很差，下来后还有好多杂蛋白，不如DEAE效果好，我现在用DEAE纯度可以达到85%，但是下一步不知道选什么介质好了，疏水不是很理想，我刚才用2M
NaCl上样，用500mM NaCl到0M NaCl
50%乙二醇的梯度洗脱，结果都洗不下来像样的峰，是一个扁扁的A280最高值才7，偶用的柱子是1X17cm,流速0.9ml/min，洗脱体积&10CV.还有不知道Butyl、OCtyl和phenyl差别大不大，如果换他们两个会不会有不同效果？还有偶的蛋白是个多聚体，凝胶过滤好像没甚么戏。不知道您还有什么推荐的介质供选择吗？偶的蛋白不怕变性。
&是吗,那会不会你的蛋白再盐情况下容易沉淀,所以没有没有得到象样的峰呢,如果是这样你可以降低浓度,调pH看看,我怀疑是沉淀到柱子上,或者你用盐酸胍洗看看,通过调pH可以改变溶解度,此外可以用凝胶过滤做试试,或者尝试燃料亲和或金属螯合试试,也可以用羟基磷灰石做试试
164)&chromatography
:您好，我想请教一个问题，我要把标记碘的900KB的蛋白与游离碘分开，用凝胶层析法，应该用多长的柱子及多大型号的凝胶呢？
&游离的碘是溶解状态的吗，这个我不清楚，如果是小分子的，那可以透析或者sephadex
G-25柱子就可以，你试试吧，不知道你处理多少体积，一般上样量是柱子体积的1/5或1/4游离的碘是溶解状态，我用过sephadex
G-200，分离效果很差，昨天刚用过sephadex
G-25，效果也不好，第一个峰下降的不快，并且两个峰之间的值仍然很大，远远大于本底值，我用的柱床体积是18立方厘米，每次上样量只有100微升。您看我哪个地方需要改进？谢谢！
&你上样可以上到3-4毫升试试,上样太少扩散厉害,如果你做了还不行,那你可以透析试试吧.
165)&&&&&chromatography,你好。我现在遇到一个非常头痛的事情，最近用分子筛SephadexG100来分离虾的总蛋白的时候可以把大分子和小分子蛋白分开，可是条件不变，换了蟹的材料就不行了，而且提高盐的浓度或PH值都没有使分离效果得到改善。请帮忙分析一下。分离条件如下：柱体积为80ml，流速为0.1ml/min，上样方式手工上样，缓冲液：0.05M磷酸缓冲液，PH=6.4。分离图谱和SDS电泳结果见附件。请问如果换一种孔径的分子筛是否能够使蟹总蛋白分离效果改善？如果是应该换大的还是小孔径的？您还有其他好的建议吗？谢谢了！
&要把大蛋白和小蛋白分开,那你干脆选择范围更小点的填料,例如G-50也许更好点,此外对凝胶过滤改变pH和盐对分离效果没有什么影响.你的流速也太慢了,可以提高到0.5ml/min左右.抱歉忽略了,以为已经回复过了呢.
166)&&还有一个问题想问一下。纯化的酶最终要冻干成制剂，静脉注射。可是内毒素很难合格，好不容易成功过几次，现在又不行了。而且我用的TRITON
X－114萃取分离不适合放大。该酶理论等电点8.4。ph稳定范围7－11。肯定不能用阳离子柱了。内毒素合格标准每mg小于25EU。请问可以用什么方法，或者什么填料？哪可以提供少量填料小试一下（我们公司只有看到可行才会买大量柱料）？
&据我所知，内毒素的控制可以采取一下措施：
1 首先所用的容器必须经过干烤，180摄氏度4小时以上，使粘附在容器上的内毒素分解。
配制缓冲液的盐类必须保持不被内毒素污染。所用蒸馏水应该新鲜配制，所用试剂也最好新鲜配制，因为缓冲液在常温下很容易孳生细菌，而是溶液产生大量的内毒素。
3 配制好的液体用0.22微米的滤器虑过。
这样处理的话，有师兄将内毒素控制在了0.5EU/mg蛋白，符合FDA 的规定。
不妨一试。
&你的酶是不是有同工酶,这酶有什么特点,需要辅酶吗,不知道有没有试过疏水,此外也可以用染料亲和的方法,不知道有没有可能用亲和的办法.
萃取的方法回收率要低,而且如果临床那也得对你的的TRITON残留也是个问题,不好去干净.我们有专门去除内毒素的填料,可以给你点小样,你可以PM你的邮件给我,我把我们的材料发给你.我们是用亲和的方法,特异去除内毒素,收率高.你可以试试.
167)我在纯化一个天然蛋白，纯化出来后没有抗原活性，请教原因。
流程是这样：提取－－－－conA柱－－－－－DEAE柱（梯度洗脱）
－－－－ －总蛋白 －－－未结合部分 －－－一个蛋白－与抗体
－－反应－－－－反应－－－－－－－不反应& 很是苦恼，最近才发现这个宝地，请不吝赐教。
&会不会是你的目标蛋白在最后一个柱子上有沉淀没有洗下来,或者失活了呢,你可以结合你的电泳图看看是不是把所有的蛋白都洗下来了,此外你的纯化工艺很有意思,第一步柱子好象没有太大意义,而且成本高,不如直接上离子交换看看.
&首先谢谢你的答复。第一步柱子是去掉大部分与conA结合的蛋白，然后在上的交换柱，文献上基本上都这样，而且电泳显示确实去掉了很多的蛋白。不过我将试试直接上离子柱的效果。
电泳图显示的是除了最后纯化的蛋白外，几乎没有什么蛋白出来。离子交换柱不就是这种性质吗？我一直这样认为，蛋白挂在柱上，经过洗脱液洗脱得到自己的蛋白，没用的蛋白就洗不下来。不知对不对。
&conA应该是去除糖蛋白的,离子交换和别的色谱一样也是有穿透的,洗脱也有你的目标蛋白和别的杂质,没用的蛋白不一定都是洗不下来.现在关键是你的目标蛋白如果上离子交换也洗得下来,那没有活性会不会是你的蛋白失去活性,或者是你检测的方法有偏差,有没有可能是pH或者盐干扰抗原和抗体的结合呢.
168)&在层析过程中，我只是少量蛋白纯化，并且基本上是在4度层析柜中进行的，没有脱气，结果装柱装了几次，还是有一些气泡（开始在室温中装的，装好后放到层析柜中），由于样品已经处理好，最后一次有一些气泡我也没办法，我只能上样，结果在再平衡过程中出现很多峰，花了几个小时，还是没平衡，时不时又出现一个峰，真的很郁闷，这时我再看柱中的气泡时，几乎气泡都消失了，原来气泡一般都在柱壁上，是不是气泡跑到柱中间填料里去了？出现这么多峰，其它的问题都不存在，是不是气泡的缘故？如果装柱过程中有气泡，层析过程中会出现哪些情况？谢谢！
&造成这样的问题主要是因为由于你的液体和柱子中的液体有温差,
这样两种溶液混合的时候就容易产生气泡,
你最好把你的溶液脱气,同时保持管道以及你的溶液温度都差不多,也就是液体也放在层析柜中,这样会好些,你说的问题说明的确是有气泡，气泡不是进入填料中间，而是出去了，或者变更小了，一直出到检测池中，所以一直有小峰上去又很快下来，装柱子装好后再放到层析柜中也不会有气泡的，主要还是有温差造成的，如果柱子中有气泡有两种情况，一是气泡一直不断，有气泡也赶不走，二是可以把气泡赶走，但是越多越难赶，因此最好是没有气泡，否则柱子分离效果也不好。
&你说的情况似乎跟我的不一样，我装柱的时候，液体都放在层析柜里，并且恒流泵也放在层析柜中，柱中都是刚从层析柜中拿出来的,还有，我的很多峰并不像你说的那样上去又很快下来，慢慢上去，下得也很慢，持续的时间相当长，不知为什么？很急，做得很烦，是不是填料有问题？
&气泡出的快慢和流速有很大的关系,流速慢,气泡比较大,所以上得慢,下来也慢,无论如何我觉得都是气泡的事,尽量要避免有温差.柱子中装的时候一定要没有气泡,否则很难赶走.
169) 我这几天作DEAE sephadex
50离子交换，上样前检测有蛋白，但是洗脱梯度0.1mol/L到1mol/L。但是检测没有任何蛋白（280nm），实用的缓冲液tirs－Hcl
样品是碱性蛋白酶。不知道什么原因？谢谢！！
&那你用更高的盐,如2M做个梯度你看看怎么样.也许你的蛋白要更高浓度的盐才能洗下来.
170)&我有一个问题：我们的蛋白原来是用CM填料纯化的，洗脱条件都已经摸索好，最近我觉得我们CM填料有问题，我们还有SP填料，我想请问一下，如果我用SP填料的话，用CM填料的洗脱条件是否适用？能否得到相同的结果？
还有一个小问题：
使用分子筛时，每一种填料都有一个分级范围，我想请问一下，洗脱体积跟洗下来的蛋白的分子量之间的具体关系是怎样的？就是说，比如Sephadex
G-25 的分级范围在，多少柱床体积，分子量1000的蛋白分子就出来了？一般洗几个柱床体积就可以了？谢谢！
1.我觉得你换填料,那么条件一般是不会一样的,还得再摸一下条件,如果你是用线性梯度洗脱的方式,那直接重复看看就可以.反正都得做了才知道.
2,很难把握不同蛋白的洗脱体积,因为和你的蛋白特性,浓度,上样量流速等都有关系,做纯化还是得有检测器的,毕竟和除盐不一样.
171)&我原核表达了一种Ｈis蛋白，买了博采公司的非变性条件下提取His
Tag蛋白质的Ni＋填料，按照它的说明书在层析是用的Buffer含有Tris,Nacl,甘油和不同浓度的咪唑，洗脱液就含有甘油。我对洗脱液进行了冷冻干燥，可是甘油除不了，不知该怎么办？请指点！
&直接透析就可以，你把你的邮件pM给我，我可以把我们的材料发给你做参考，其实不需要用甘油就可以，此外金属螯合最好别选择Tris缓冲液。我不知道博采公司是哪里的，好用吗，什么价格呢。
我最近纯化一个蛋白，发现CM填料装的柱用7～8个柱床的平衡缓冲液都无法平衡，并且用7～8个柱床的的氢氧化钠也也洗不出一条直线来，总是有峰出来，不知是怎么回事？请高手指点，希望能指出造成这种现象尽可能多的原因。谢谢！
&是不是太脏了，多洗几个柱床体积，或者看有没有气泡，峰型是直上直下的吗，如果是这样那就是气泡。
&这次绝对没有气泡，峰型也不是直上直下的，慢慢升起来后又慢慢降下去，也不知道是不是紫外检测仪不稳定？
&也许是不稳定或者检测池脏了。你直接不过柱子走有没有这样的问题
173)&&&&&&&&&&&&&
我用amersham的Ni亲和柱变性条件下纯化E Coli表达的蛋白。菌体破碎后，用8M
Urea溶解。样品10000g，10min，0.22v过滤，但进样过程中，柱子压力升高仍很快。很快就达到了压力上限，不得不停止进样。
我想降低一点尿素的浓度，使得压力降一些，但是提取时8M Urea比6M提取的更好。
考虑，样品中用8M Urea，Binding &elution buffer中使用4M
Urea, 会不会有一些蛋白（或杂蛋白）由此在柱中沉淀呢？用1N NaOH
CIP理论上应该可以把蛋白降解，柱子是否能通过CIP完全恢复原状呢？
另外，进样过程中压力升高，除了有蛋白，还有什么物质容易堵在柱子里呢？如何在进柱前除去呢？谢谢
&另外，我用Superdex200
10/300预装柱分析Ni柱收集的目的蛋白（样品中含500mM IMI,8M Urea, 500mM NaCl,10%
Glycerol,pH8.0），分子筛的buffer也用同样的buffer，可是，最后在19ml开始，出现好几个大峰，跑SDS-PAGE也没有蛋白band。不知道为什么我的buffer和样品buffer一样还会出现可能是溶剂峰？
Another question:
蛋白溶于有机溶剂中能保持其有活性的结构么？
30% ACN是不是能让蛋白复性呢？
在纯化过程中上样的样品中pH和盐浓度,以及种类等组分一定要平衡缓冲液完全相同,至少相当,你的问题就在于平衡用的4M,
而样品用的是8M, 这样混合, 蛋白就会沉淀,
所以柱压高,没有办法纯化,解决这个问题的方法是AKTA可以倒洗,你用6M盐酸胍或者8M脲含有400mM咪唑反方向冲柱子,这样就可以使沉淀溶解,
同时咪唑可以把挂的蛋白洗下来,这样柱子就好了, 用1N NaOH 变性蛋白也不能溶解,
根本没有用.你洗后再用水洗,再做CIP这样还可以好些.否则不用变性剂使蛋白溶解,
CIP根本没用,还是堵柱子.此外还有注意的是你的样品很粘加上有甘油,黏度很大,所以相应压力也高,所以不用甘油也可以.
2,你的意思是说你的缓冲液中也有500mMIMI吗,我怀疑那几个峰不是蛋白,会不会是咪唑呢.此外也许有你的目标蛋白,但是浓度低,你得透析浓缩才能电泳看到,或者你用银染的方法看看.我怀疑你前面纯化也许没有你的目标蛋白,所以做这一步没有蛋白或者很少.
Another question:
蛋白溶于有机溶剂中能保持其有活性的结构么？
30% ACN是不是能让蛋白复性呢？
&一般是不能,除非这个蛋白是亲脂性的,而且稳定性很好.
而我看的文献30%
ACN只会使蛋白变性,不会复性的,除非你的蛋白是亲脂性,水中不溶解,而溶解在有机溶剂中,这就不是复性的问题,,是溶解性的问题.
&1,我现在做的镍柱样品和buffer是一样的，都是8M
Urea，降低尿素浓度只是一个想法，还没开始实施。
2，我的SEC中的peak1,
peak2浓缩跑过电泳，都是我的目的蛋白。我的蛋白疏水性强，较容易聚集，所以才加的甘油。前面纯化应该纯化出来了。
3，SEC最后的peak4,
5用银染做过，没有蛋白条带，浓缩用BCA测过蛋白浓度基本没有。所以应该不是蛋白。这样就很怪了，我的SEC buffer中也有500mM
Imidazole阿，基线走平了才进的样，为什么最后还会出峰呢？
4，乙腈的问题是由于有做蛋白结构的文献说我的目的蛋白在三氟乙醇或30%
ACN中用CD测，三维结构是对的；也没有聚集体。当然，他们的蛋白是固相合成的。我在做蛋白复性，希望找到一个条件使得我的蛋白不聚集，且有三维结构，所以想试一下。
5，你说的CIP方法很有启发，多谢了。我用Urea,Gua-HCl,NaOH洗镍柱，柱的颜色都不如水洗时白，是不是变性剂和碱会使胶的状态发生变化呢？
&1.抱歉，因为问题太多，所以没有看清楚。
2，即使是这样，那样品黏度大，而且有甘油，你得把流速降低，蛋白的浓度也不能高。
3。如果是有你的蛋白，那后面的也许是一些色素或别的有吸收的物质，不是蛋白也没有关系。
4。如果是这样，那你可以试试用这样的液体看能不能复性。
5，碱不能长时间洗镍柱子，那样镍也许会被还原的，何况单独在碱性条件下并不能溶解变性沉淀的蛋白。
我在最近不断的条件摸索下纯化到了我的目的蛋白，其中洗脱液是改用含0.1%SDS的系统，这样才能洗出蛋白（还原型谷胱苷肽就不行），但这样得到的蛋白还需要怎么样处理呢？
如果是这样，那我很长见识：），不知道你随后要做什么，所以很难知道要怎么处理。
其实还有一个问题随后出现，就是我之前用的是直接与sepharose
4B混合的纯化方法，就用0.1SDS洗脱可以，但是用预装柱就变成是是elution
buffer（含还原型谷胱苷肽)才能洗脱，前者琼脂糖有一些过期而已，其他步骤基本一致，样品也是一样处理的，用SKL溶解包涵体，用TX100增加Binding，不知道为什么结果有差。
我之后的目的是功能检测，检测蛋白对癌细胞的促凋亡作用。
还有一点想问一下，上海生化所的低分子量Marker的每条蛋白带大约是多少蛋白量呀（20ul*20的），因为我不想做蛋白定量先，想先估计一下。
那也许你填料和样品混合时间较长, 所以吸附比较牢固, 因此用elution buffer洗不下来,而要用0.1SDS洗脱,
而过柱子相对吸附较弱, 所以elution buffer可以, 或者是你的这两种填料不一样造成的,
至于Marker我就不清楚了,你最好问卖东西的人,他们也许知道.
我一般洗镍柱都是用EDTA把镍脱去再洗，洗完再加镍，很麻烦。
用Gua-HCl,EtOH洗柱可以不脱镍么？
&别客气。用Gua-HCl, EtOH洗柱可以不脱镍,放心吧
这里还要麻烦Chromatography兄一次，我作草鱼胰蛋白酶的提纯，用卵类粘蛋白合成SEPHAROSE-4B亲和柱提纯。
现在我碰到亲和柱洗脱液的问题。草鱼胰蛋白酶性质和哺乳动物的不同，哺乳动物的是碱性蛋白酶，而草鱼胰蛋白酶是酸性蛋白酶，在酸性区域不稳定，国外资料和我作的预实验都证明了这一点。经典的哺乳动物胰蛋白酶的提纯方法用pH2.5的酸性洗脱液洗脱，而这种方法对我的草鱼胰蛋白酶的提纯不适用。国外资料有苯甲脒琼脂糖凝胶提纯鱼胰蛋白酶的，用120mM苯甲脒在中性区域洗脱。我的卵类粘蛋白合成的SEPHAROSE-4B亲和柱能用120mM苯甲脒洗脱吗？
&苯甲脒琼脂糖凝胶可以用苯甲脒洗脱，但是我不知道能不能用在你的柱子上，因为按道理蛋白和这两个填料的作用位点和方式也许不一样，因此我觉得不一定能用，除非它们作用方式是一样的，最实际的就是试试就知道。
&此外我觉得既然文献用的是苯甲脒琼脂糖凝胶，那你也可以用这个填料，其实我们公司就有这个填料。此外你也可以换个配基例如胰蛋白酶抑制剂做配基，不过一般都是用降低pH的洗脱，所以实在没有办法你还是得用苯甲脒琼脂糖凝胶。
我用的介质是CM52（羧甲基纤维素的），柱子的直径是7CM，介质在上样过程中经常出现裂纹，请问这是为什么？这个问题怎么解决？
&我怀疑是填料压得太紧,样品和平衡缓冲液是一样的吗,温度是一样的吗,我怀疑样品上柱子有气泡才会有裂纹,否则是不该有的.你要保证样品和平衡缓冲液温度一样,别直接从冰箱里拿出来就上样.
178)&&我想问一下DEAE
FF柱缓冲液能不能用硼砂-硼酸缓冲液
阴离子柱一般都用TRIS-HCL，或者有用磷酸缓冲液但是前者对我的酶活有影响，后者PH值不够高，所以决定换BAFFER，不知道选择BAFFER的时候有什么依据
&应该没有问题，其实缓冲液不过是调pH的，低浓度对离子交换影响没有象一些书上说的那样说不能用某个缓冲体系。所以我觉得大多都比较随意，常用的都是可以的。
179)&真佩服搂主的豪言壮语，你果真能“制填料如煮小鲜，做纯化似拂轻尘“吗？我不太相信，国内好多前辈和专家都不敢这么夸口，我做了6年的蛋白纯化和填料合成工作，我觉得这个领域要做好，做精并不是一件轻松的事情.
&“制填料如煮小鲜，做纯化似拂轻尘“是我对填料合成的理解,那就是填料合成和做汤差不多，就是熬，而纯化就象把杂蛋白象灰尘一样吹去才得到目标蛋白，我不觉得做填料和做纯化很容易。专家和前辈现在亲自做实验的不多，而做产业的更少，我也做了11年的纯化和填料，包括小分子的HPLC和生物大分子的中低压色谱，既然你是同行，有问题以后向你请教，精是要静下心来做的。我觉得做产品最难。
180)&&我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，
请问，我怎么设计我的纯化步骤？
我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知道下边该怎么做？
这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21表达
请问，5KD 左右得蛋白，不用tricine－sdspage用普通得sds－page跑胶行吗？
181)&& chromatography兄:
请教一个问题
目的蛋白分子量大概在9万左右，想除去分子量8万以下的杂质，而且希望除的尽可能干净，但是我看了millipore的资料，如果选择3万截留分子量的膜，还有不少3－8万的杂质，不知道选择8万截留分子量的膜能不能最大可能的去除8万以下的杂质？最适当的膜应该是哪种？
选择5万截留分子量的膜是否能保证5万以下的分子都能除干净（95％以上吧）？其实目的蛋白只要损失不超过三分之一我都可以接受，但是一定要去除3万到5万之间的那些小分子，不然会影响我的检测。
请专家赐教！谢谢！
&我超滤用得不多，好象没有这么能截留80KD以上的膜，如果你的样品不多，直接过凝胶过滤柱子就可以，你选择排阻范围上限为80KD的填料，例如sephadex
G-75范围在，这样在外水体积出来的正适合你需要大于80000的样品，快，简单，而且不需要复杂设备。如果用superdex
75 范围在,效果也许更好，
182)&1,现在除了各种离心管样的超滤装置,有没有更快更大量的超滤设备?
2,如果样品体积相对于上样量太大您比较常用的浓缩方法是什么?我有透析袋,PEG
,大容量冷冻干燥设备和50ml的脱盐柱,很小的超滤管可供选择.
3,我依次用离子柱,疏水柱,亲和柱纯化我的蛋白.过了离子柱之后,我发现不挂柱的部分和梯度洗脱下来的某一部分都能检测到活性(我提纯天然酶),这可不可以说明他们是不同蛋白?
我把在离子柱上梯度洗脱下来的那一部分再经过疏水柱之后上亲和柱(染料,red),用2M的盐洗,发现在小于1M和接近2M的地方有两个活性峰,这能不能说明这又是不同的蛋白?最终SDS-PAGE发现这"两个"条带分子量相差一点点,但是按照文献上应该只有一个活性很强的蛋白,我却得到这样活性很弱的"两个"蛋白,真是越做越糊涂了.
&超滤设备当然有大的，你可以和密理博或者颇尔公司联系，他们会给你详细回答的，我做纯化大多用疏水和亲和多，所以不怎么浓缩，小量可以用透析袋，大量的可以用超滤，如果要做成粉末长期保存那就冷冻干燥。
不挂的部分不一定是另一种酶，因为柱子不可能是100%挂住，何况超载时穿透也会有活性，还是用电泳检测看是不是在同一个位置都有。洗脱做电泳差一点很难说，因为电泳的带不一定对得很齐，你把两个样品混在一起跑，这样看是不是一条带，如果是很可能还是一个东西，活性的强弱得看你操作本身有没有降低活性的可能，如果是这样，那说明在纯化过程中有活性损失，染料亲和有洗脱需要特异洗脱，例如用辅酶洗脱的，你看你的操作和文献是不是一样，此外提取有没有问题，还有是不是浓度太低所以活性低。
183)&&&&&&&&&&&&&
请问新买的NI填料是不是已经螯和好镍的？NI填料的再生过程具体怎么样呢？
我要做的His融合蛋白是细胞表达后提取出来的，上样体系是否要和柱子平衡体系一样呢？因为没有检测器，请问大概要用多大浓度的咪唑来洗脱？
&我们公司的镍琼脂糖凝胶是已经螯合好镍了，不知道你用的是哪家公司的，一般如果是蓝绿色的，那是螯合好镍了，如果是白色的，那就没有，再生很难在这里说清楚，你PM你的邮件地址给我，我把我们的材料发给你，很详细，包括操作也是，样品最好是pH和盐浓度同平衡缓冲液一样，一般你买的填料都有说明书，就有怎么操作的，我可以把我们的操作发一份给你做参考。不同蛋白洗脱都不一样，你看我们的说明书就比较清楚了。
184)&准备纯化一多肽串联体，分子量17000左右，，准备先用G-25除盐，在分别过sp-sephrose
FF,DEAE-sephrose
FF,串联体裂解成单体后，由于单体分子量4000左右，PI和原来差不多，所以想重复串联体一样在进行纯化。
我没做过纯化，以上想法是否行得通，请兄台指教，
若学长有更好的想法请尽管不吝赐教。G-25除盐速度快吗？操作条件：平衡，洗脱液，柱的大小，都望指教
&如果你的样品等电点是4.3，那用DEAE-sephrose
FF比较合适，而sp-sephrose
FF很难挂住，当然如果pH在2左右也许能挂柱，但是不知道在这样条件下你的蛋白稳定性如何。得到串联体后用什么方法裂解，这个说清楚才能说选择怎么样的柱子，简单重复不一定能得到好的效果，除盐很快，一般上样的多少取决你柱子的大小，也就是说你处理的样品体积，一般除盐可以上样到填料体积的25%左右，洗脱就用你不含盐的缓冲液，也就是平衡DEAE-sephrose
FF最好。除盐柱子一般离子交换平衡缓冲液洗冲柱子3个柱床体积就可以，柱子不需要装很高，短粗柱子就可以除盐了，你没有告诉你要做多少样品，抱歉没有办法给你说要多大的柱子。
&多谢指点，sp sephrose-ff
我是打算用来出去带+电蛋白的，所以这步我是否可以、只收集过柱液，而不要去洗脱了，我用溴化氰裂解的，你的意思是否我可以只用DEAE
SEPHROSE-FF就可除盐了，不用再用G-15之类的，我是用来进行50L罐后的纯化的，小肽分子量如上，很小，选柱要以此为依据，但我对柱的参数不懂，请指教
&别客气,其实我觉得sp sephrose-ff 也可以，看你怎么配合了，DEAE
SEPHROSE-FF不能除盐，但是如果你选择挥发性的盐，那也许不需要过凝胶柱子就可以，此外如果是4000的多肽，只能选择sephadex
G-10除盐，不知道效果好不好，G-25不行，因此如果量很大的话，还是用挥发性的盐吧。仅用离子交换不好的话，你可以考虑反相，但是量大成本比较高，因此你也可以试试疏水
185)&主要是纯化小肽，能教我选选柱子吗，thank you
抱歉，不知道你要纯化多肽分子量在什么范围，做多大的规模，这些不清楚很难说选择什么填料和柱子。
&纯化小肽最好用反相色谱，它的分辨率是色谱方法中最高的，C18或C8柱都可以，如果你的小肽中芳香氨基酸的含量较高，也可以考虑苯基的反相柱，小肽经过反相后通常结构能够得到恢复，如胰岛素。仅供参考。
186)&&前几天我提取了一种菊科植物的蛋白，用的是tris—Hcl缓冲液，然后用100%丙酮沉淀蛋白，结果蛋白中含有色素杂质，属水溶性，颜色很深，请教高手，如何除去色素干扰，纯化蛋白？？
另外我也查了一些资料，说可能是花色素，于是我在100%丙酮沉淀后，加了一步0.1%甲醇，但是并没有显著的效果。
chromatography wrote:
&你说的花色素就是黄酮类的花青素吗，它有很强的亲水性，所以丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了，你试试吧。
&chromatography,您好.为什么"丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了"呢?谢谢!
&我觉得因为是水溶性的色素，在乙醇和高盐中能溶解，而蛋白沉淀，这样可以去掉一些色素，其实色素是小分子，也可以超滤透析过凝胶过滤都可以去掉一部分，结合起来也许能去得更干净点。
187)&&&&&&&&&&&&&
作完外源基因表达后想纯化上清中6kd糖蛋白，看了一点文献也不确定如何选择柱子，正着急。你看先过分子筛再过疏水或离子柱行吗？关键是想您给一些关于各类柱子型号、特点以及装柱操作的链接或书（希望能全点），帮我扫一下盲。可以吗？
另外上清中的色素用分子筛可以和目的蛋白分开吗？
&糖蛋白有专门的亲和柱子,例如凝集素的柱子,你的蛋白上是什么类的糖就可以用专门的凝集素亲和柱子去做,当然也可以用硼酸琼脂糖凝胶去纯化糖蛋白,我们公司就有这样的填料,当然你也可以选择离子交换和疏水试试,具体的方案得看你现在手头有什么条件,我觉得如果是离子交换和凝胶最好先过离子住,再过凝胶柱子,如果是疏水,那可以用硫酸铵沉淀配合疏水,不知道你的上清目标蛋白浓度大不大,太具体的那就很难三言两语说得清楚,何况你没有提供蛋白的等电点,所以很难说选择这么离子柱,也没有上清电泳图,所以不知道选择什么凝胶的填料,不知道什么糖,很难知道用什么凝集素的柱子,硼酸琼脂糖凝胶倒适合各种糖蛋白,而且成本也低,也许值得考虑.
色素一般比蛋白分子量小很多,凝胶柱子应该能分开.
188)&&&&&&&&&&&&&
我想用反相Source分离蛋白，说明书上说可以耐受6M Gua-HCl，我的蛋白溶于8M
Urea中，不知道Urea会不会对source填料造成影响？Urea会不会影响蛋白的binding呢？色谱园上有一个实例用SOURCE分离包含体蛋白，不过进样时样品是在盐酸胍中的，没见到用尿素的阿。
还有，反相的A液为TFA in
water，在这种条件下，是不是应该先做一下我的蛋白的溶解性试验呢？随着洗脱时ACN的增加，蛋白会不会沉淀出来呢？这样，柱子很容易会被堵掉的。我试过不加TFA的ACN溶解我的蛋白，30%以下的ACN无法溶解，我的蛋白疏水性较强，非变性buffer中溶解性很小，那么加入TFA就可以保证蛋白百分之百溶解么？
&能用6M Gua-HCl那耐受8M
Urea完全没有问题，这个填料很稳定，脲也不会影响binding的，我觉得还是用Gua-HCl好一些，，因为它溶解包涵体的能力更强。一般的蛋白在TFA
water这样条件下都能溶解，但是我不知道包涵体蛋白可以不可以，你参考文献做吧。通常HPLC做蛋白和多肽在洗脱时ACN增加不会使蛋白沉淀，如果不加TFA不溶解是很正常的，因为没有它一般的蛋白都难溶解在ACN水溶液中，加入的话应该可以增加你蛋白的溶解度。100%的溶解那也得看你蛋白浓度和本身的特性。
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我要纯化的蛋白是一种酶，过完阴离子柱后还有酶活，但接着再过个疏水层析柱就没有蛋白吸收峰也没有酶活了，我的蛋白去了哪里？所用疏水层析柱柱体积只有１ml，是否有影响？
我要纯化的蛋白是一种酶，过完阴离子柱后还有酶活，但接着再过个疏水层析柱就没有蛋白吸收峰也没有酶活了，我的蛋白去了哪里？所用疏水层析柱柱体积只有１ml，是否有影响？
我怀疑你的蛋白也许在苯基柱子上没有洗下来，你可以用20%乙二醇水洗看看有没有东西，和柱子大小关系不大，你纯化什么酶呢
&我纯化的是真菌发酵液里的葡聚糖酶，量很小，即使硫酸铵浓缩后酶活也没有显著提高，电泳凝胶用考染只有几条很淡的条带，所以一直在用银染．过阴离子柱时我用的是ＰＨ７.０的Ｔris－ＨＣl平衡柱子和１Ｍ的ＮaＣl洗脱，在１０－１５％时目标蛋白就被洗了下来．您认为我有没有必要改变ＰＨ再过阴离子柱．
疏水层析对蛋白的稀释大吗？有没有可能我的蛋白本身就太少所以被稀释的找不见了．用20%乙二醇水洗是上样后直接用20%乙二醇洗脱还是低盐洗脱后再用20%乙二醇洗，20%乙二醇会影响酶活吗？是乙醇还是乙二醇？
&离子交换如果挂住，洗脱下来比较快，那你可以改变pH试试，提高pH到8-9看看，这样是不是结合更牢，此外如果你的蛋白是葡聚糖酶，那你直接用sephadex
G-25这样的柱子也许能做亲和填料，挂住你的蛋白，可以试试，因为它的底物是葡聚糖，而sephadex是交联的葡聚糖，测定上柱前的酶活，上样完后看总的酶活有没有降低，如果是，那可能被吸附，然后改变pH或者盐看有没有东西下来。
疏水不会稀释你的蛋白，如果被挂住它和亲和一样有富集的作用，用20%乙二醇水洗只在洗脱的时候用，别的缓冲液都没有，此外疏水和时候配合硫酸铵沉淀，如果你沉淀没有，那也许浓度太低，沉淀不下来。
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