转化及重组子的筛选 - DNA技术 - 生物秀
标题: 转化及重组子的筛选
摘要: 实验目的了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义；学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化子的方法。实验原理转化（transformation）是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。其原理是细菌处于0℃， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形……
了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义；
学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化子的方法。
转化（transformation）是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。其原理是细菌处于0℃， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。
基因导入方法:
1)电击法 (Gene transfer by electroporation)
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＞＞＞根据模拟制作重组DNA分子的活动，甲DNA分子、乙DNA分子被EcoRⅠ酶..
根据模拟制作重组DNA分子的活动，甲DNA分子、乙DNA分子被EcoRⅠ酶切后，即可获得所需的目的基因和质粒，回答以下问题：(已知EcoRⅠ酶识别序列为GAATTC，识别位点为G||A)绿色硬纸板(甲DNA分子)的碱基序列为：……ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…………TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…… 红色硬纸板(乙DNA分子)的碱基序列为：……TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…………AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG……(1)其中，DNA分子________表示含有“目的基因”，DNA分子________表示是“质粒”。用剪刀代表进行切割。酶切位点在(在下图的a处还是b处)，此化学键称为____________。 (2)请用“||”在上面的甲、乙两DNA分子上标出EcoRⅠ的作用位点。
题型：读图填空题难度：中档来源：安徽省期中题
(1)乙&& && 甲&&&&& a处& &&& 磷酸二酯键(2)绿色硬纸板(DNA分子甲)的碱基序列为：……ATAGCATGCTATCCATG|| AATTCGGCATAC…………TATCGTACGATAGGTACTTAA||GCCGTATG……红色硬纸纸(DNA分子乙)的碱基序列为：……TCCTAG||AATTCTCGGTATG||AATTCCATAC…………AGGATCTTAA||GAGCCATACTTAA||GGTATG……
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据魔方格专家权威分析，试题“根据模拟制作重组DNA分子的活动，甲DNA分子、乙DNA分子被EcoRⅠ酶..”主要考查你对&&基因工程的基本操作程序&&等考点的理解。关于这些考点的“档案”如下：
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基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序：1、目的基因的获取（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。2、基因表达载体的构建（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。如图：①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。（3）基因表达载体的构建过程：3、将目的基因导入受体细胞（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）常用的转化方法：
（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。4、目的基因的检测和表达（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。 （4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。知识点拨：1、构建基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 2、PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR扩增是获取目的基冈的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因。 3、基因文库中不是直接保管相应基因，基因文库中的基因保存在受体菌中。 4、在基因工程的四个操作步骤中，只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。5、原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常用大肠杆菌等原核生物作为受俸细胞。 6、植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。7、转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中，从而使受体生物获得了新的遗传特性的现象，从其变化的实质看，这种变异属于可遗传变异中的基因重组。 知识拓展：1、基因文库的构建：（1）概念①基因组文库：含有一种生物的全部基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因组文库。 ②cDNA文库：只包含了一种生物的部分基因。 （2）构建过程
2、人工合成目的基因（1）反转录法：（2）人工合成目的基因3、PCR技术扩增目的基因①原理：DNA双链复制②过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
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与“根据模拟制作重组DNA分子的活动，甲DNA分子、乙DNA分子被EcoRⅠ酶..”考查相似的试题有：
834307932592012100754730671074681.1DNA重组技术的基本工具学案 - 百度文库
1.1DNA重组技术的基本工具学案
高二生物学案
第一章 基因工程 第1节 基因工程的工具
一、基因工程中的工具——酶与载体 1．限制性核酸内切酶——分子手术刀
(1)限制酶主要________________中分离并纯化。
(2)作用：每种限制性核酸内切酶只能识别DNA分子的________________，且在特定位点上切割DNA分子。
(3)DNA末端：限制性核酸内切酶在切开DNA双链时，末端有两种形式____________和______
2．DNA连接酶——分子缝合针
(1)作用：把DNA分子“梯子”的__________________连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的
(2)结果：形成一条________分子。
3．基因进入受体细胞的载体——分子运输车
(1)常用种类：______、________以及一些可以起载体作用的动植物病毒。 (2)质粒：来自于____________中的一种很小的____________分子。 （3）质粒载体的特点：
(2)请画出目的基因两侧被限制性核酸内切酶Ⅱ切割形成黏性末端的过程。
(3)在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？
4．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：
知识点一 基因工程的诞生和发展
1．下列关于基因工程的叙述，不正确的是(
) A．基因工程的原理是基因重组
B．运用基因工程技术，可使生物发生定向变异
C．一种生物的基因转接到另一种生物的DNA分子上，属于基因工程的内容 D．是非同源染色体上非等位基因的自由组合 2．以下有关基因工程的叙述，正确的是(
) A．基因工程是细胞水平上的生物工程
B．基因工程的目的是获得目的基因表达的蛋白质产物 C．基因工程产生的变异属于人工诱变
D．基因工程育种的优点之一是可以定向地使生物产生可遗传的变异 知识点二 限制性核酸内切酶和DNA连接酶
3．限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—GGATCC—，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列
和切点是—GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。
(1)请画出质粒被限制性核酸内切酶Ⅰ切割形成黏性末端的过程。
(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前、后，分别含有________个游离的磷酸基团。 (2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma Ⅰ切割，原因是________________________________________________________________________。
(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止________________________________________________________
________________________________________________________________________。
贡献者：wuwangguoqu999君，已阅读到文档的结尾了呢~~
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