结核分枝杆菌复合群最简便有效的灭菌方法

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-10-27 08:21 标签： 结核分枝杆菌复合群
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【求助】结核杆菌怎么保藏？
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这个帖子发布于7年零169天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我第一次做结核杆菌，刚拿到BCG菌株，长的差不多了，请问各位我现在怎么把这菌保藏起来，和一般的菌种保藏是否有较大的差别？忘不吝赐教！
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宝藏的方法，我给你贴上来了！细菌的保存方法很多，原理是根据细菌的生理生化特性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长细菌生命以及使细菌保持原有的性状，防止变异。
(l)半固体穿刺保存法:
用穿刺接种法将细菌培养物接种于半固体培养基内，经37℃18一24h培养后加一层无菌液体石蜡，厚度约Icm，置冰箱保存，一般可保存3-6个月。
(2)斜面保存法:
这是最简便最普通的保存方法。即将菌丝生长良好的斜面细菌，置于冰箱内;在4℃左右低温下保存;但以后需每隔2一3个月转管移接一次。
(3)砂土管保存法:
适用于产芽抱的细菌将过筛后的中性细砂烘千，装入小试管内约Icm，高，塞以棉塞，160℃、2h灭菌烘干备用。用无菌生理盐水洗下培养基上的细菌培养物，制成菌悬液。然后吸此菌悬液约0.5ml注入砂土管内，以砂土全部浸湿为度。塞好棉塞，放入干燥器内抽干，然后放在装有氯化钙(吸水剂)的干燥瓶内，置4℃冰箱保存备用
(4)液体石蜡保存法:
此方法简单，只在斜面细菌试管内，注入一层己灭过菌的液体石蜡，注入量以高出斜面Icm为宜，使细菌与空气隔绝，降低其新陈代谢的活动，然后在棉塞外包以塑料薄膜，直立存放于室内干燥处或低温下保存，一般可保存一年以上。液体石蜡使用前，要在高压连续灭菌两次。彻底灭菌后方可使用。灭菌后的液体石蜡，由于有水蒸气渗入，会影响细菌保存质量，因此，需要放在44℃烘箱中，烘烤数小时，使水蒸气蒸发。在室温下也可以，不过所需的时间要长些。
(5)冷冻干燥保藏法
这种方法采用真空、干燥、低温等手段，使细菌新陈代谢活动处于相对静止状态，在低温下快速冷冻，又在低温下真空干燥，而使菌细胞的结构与成分保持原来状态而保存细菌。希望能够帮助你!
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建议一份长期保存，采用悬浮液超低温保存法。一份短期保存供试验用，采用罗氏培养基直接保藏，每3-4个月转接一次再保存。结核病实验室检验规程中是这样规定的：
根据需要移种传代间隔的时间，能够分为短期(3～24个月)和长期(≥ 2年)保存方法：四、短期保存方法：此类方法适用于实验和防护条件较低的实验室，特别是保存经分离培养获得的野生和临床分枝杆菌菌株。短期保存方法虽然简便，但为保证被保藏分枝杆菌的活性，需要定期移种传代，因此容易造成细菌的变异，不利于物种原始生物性状保持稳定。(一)
斜面保藏法
⒈罗氏培养基直接保藏：这是一种最基本的方法，适用范围广，对生长速度快、满的分枝杆菌都可应用。分离的分枝杆菌移种罗氏培养基(L-J)斜面、在适当孵育温度条件下生长良好后，菌株置于4℃左右保藏。该方法对一般慢生型分枝杆菌可保藏3~6个月；生长速度快的分枝杆菌能够保藏2～3个月。到期后重新移种一次。当然保藏培养基、温度和时间都不是绝对的，个别菌种需要结合菌种所需的营养条件、生长速度、繁殖能力对移种传代的时间间隔进行适当调整。这种方法的弊端是传代次数多了容易发生变异，如导致部分分枝杆菌繁殖能力下降、生物性状发生变化、毒力减小甚至基因失落等；同时传代次数多也容易使污染机会增加。建议实验室采用密封性能较好的螺旋口试管替代传统的胶塞并保存生长菌落发育充分的培养物，有利于保藏菌种的稳定。注意事项：由于斜面冰箱保藏是在4℃下进行，分枝杆菌分离物活动并未停止，需要经常转管移接，因此对于保藏所用的斜面菌种质量要求较高，其菌落形态、生长速度等生物性状应保持原有特性。操作人员必须对斜面菌种质量具有一定的鉴别能力，所挑选的菌种才能适合保藏；其次菌种的菌龄不能太幼也不能太老，否则冰箱保藏后移种传代易造成菌株衰亡；再则冰箱温度应控制在2-4℃之间，尽量恒温使菌体处于稳定的生理状态。⒉穿刺液体石蜡覆盖保藏法 此法是罗氏培养基直接保藏的一种改进方法，可用于保藏结核分枝杆菌。方法是将罗氏培养基为凝固时盛入小试管或螺旋口小试管内，高度为试管的1/3。85℃凝固灭菌时不制成斜面，用接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处。培养后的微生物在穿刺处及培养基表面均可生长。然后以无菌液体石蜡覆盖生长表面，使液体石蜡高出培养基表面约2~3mm。液体石蜡必须高压灭菌2次后，于80℃彻底烘干其中的水分。小试管被置于4℃冰箱中保存。由于保藏温度低且分枝杆菌被液体石蜡包裹而使氧气减少，从而降低了结核分枝杆菌的代谢能力，因此保藏效果较斜面为好。虽然不用穿刺法而直接将液体石蜡加入生长好的斜面上亦可得到相似的效果，但消耗的液体石蜡较多。保存期内发现液体石蜡减少应及时补充。穿刺液体石蜡覆盖法虽然简便，但却不适宜保藏非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacteria, NTM)、特别是速生型分枝杆菌菌株。此外，由于从液体石蜡覆盖层下移种时，接种针在火焰上烧灼时菌体会随着液体石蜡飞溅，如果实验室操作和防护条件较差时，应予注意防止操作人员被感染。另外，移种传代后第一代的培养物会因液体石蜡的残留而影响复壮的生长丰盛程度，第二代才适于实验用。注意事项：结核分枝杆菌菌株培养时间不能太短，为防止菌株的过度发育，可适当让试管先置在冰箱中(2～4℃)2d后再加入液体石蜡。倒入的液体石蜡必须要超过培养基表面，过低则液体石蜡挥发后会露出培养基，从而导致培养基表面干涸，缩短了保藏时间。高压后烘烤液体石蜡应彻底，尽可能把水分蒸发干净。使用密封性较好的螺口试管防止液体石蜡蒸发影响菌种的保藏。(二)
悬浮液低温保存法 悬浮液低温保存法的基本原理是将分枝杆菌充分悬浮于不含养分的溶液，如经高压灭菌的20%甘油/0.25M（pH 6.5）磷酸缓冲液或20%甘油/生理盐水中，保藏在－20 ℃。使用该方法，大部分分枝杆菌能保藏1年以上。此法的关键是要用密封性能好的螺旋口菌种管和封口膜密封管口，防止水分的蒸发。五、 长期保存方法此类菌株保存方法适用于仪器设备齐备(如超低温设备、真空干燥设备)、实验防护设施和相关措施较完善、开展科研和检查项目较丰富的实验室采用。为保证被保藏的细菌，在经过长期、低温冷冻保存后能够移种传代复活，一般每支保存管中要求的细菌数量在108~10个( ≥10 mg )。(一)
悬浮液超低温保存法将10 mg分枝杆菌充分悬浮于冻存溶液(如3 g或6 g 胰蛋白胨溶于100 ml 20%或40%甘油水溶液)或7H9培养基(含抗菌素混合物PANTA)中，保藏温度为－70 ℃。使用该方法，大部分分枝杆菌能保藏5年以上。此法的关键是要用密封性能好的螺旋口菌种管防止水分的蒸发。(二)
液氮保藏法液氮罐在目前来说实验室较容易购置。用液氮罐来保藏菌种，效果好、方法简单、保藏的对象也最为广泛。其方法是将菌悬液加入灭菌后的保护剂 (终浓度为10%的甘油水溶液或5%二甲基亚砜水溶液) 中。许多细菌可保藏超过4年之久。此方法操作简便但无菌要求较高，且保存的菌株数量受到保藏容器的限制。(三)
梭－氏(Sordelli)真空干燥保藏法此法的基本原理是将小试管中的菌悬液，不经过冷冻而直接抽干保藏。一般用8×60 mm有棉塞的小试管，加入悬浮于保护剂中的菌悬液。悬液中细菌的浓度应高，而加入小试管的数量应少，一般每管不超过0.5 ml。将小试管振荡使悬液黏附于管壁，贴上标签后，放入12×150cm的大试管中，大试管底部加入少量五氧化二磷和几粒小玻璃珠使小试管不直接与干燥剂接触。大试管的口上配有中间插有玻璃管的橡皮塞。将真空泵与橡皮管联接，抽真空至0.05托左右。可以用石蜡将橡皮塞和玻璃管全部封住，也可以在橡皮塞下部将大部试管拉细，第二次抽真空熔封。在5℃低温下保藏时，NCTC曾报道保藏了2724个菌种，14年后的存活率为83%。(四)
冷冻干燥保藏法用这种方法保藏菌种已有几十年的历史，由于它具有保藏期长、变异小、便于大量保藏及适用范围较广等优点，是各保藏机构使用的主要方法。曾有报导ATCC保藏的6,500个菌种中只有不到100个无法用这种方法保藏，病原菌中的98.5%适用，仅有一些不产孢子的丝状真菌不宜用此法。其基本原理是将微生物或孢子冷冻，然后在减压情况下利用升华现象除去水分，使细胞的代谢、生理等生命活动处在停止状态下进行长期保藏。此法可用小箱式或多孔道的冷冻干燥机进行，亦可自制较简单的装置进行。它的操作步骤比较复杂且需要经过系统培训的人员完成操作
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非常感谢dew488 版主！！ 我就按您的建议，一份长期保存，采用悬浮液超低温保存法。一份短期保存供试验用。
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结核杆菌常用的物理消毒方法
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你可能喜欢（1）煮沸消毒：一般含有结核杆菌的物品，应该持续煮沸10分钟以上才能杀死全部的结核分枝杆菌，达到完全灭菌的效果。（2）高压蒸气灭菌：是普遍应用的灭菌效果最好的消毒方法；（3）紫外线消毒：结核分枝杆菌对紫外线具敏感性。
（1）煮沸消毒：一般含有结核杆菌的物品，应该持续煮沸10分钟以上才能杀死全部的结核分枝杆菌，达到完全的效果。所以，患者在家中的痰纸、废纸、痰均可采用火烧消毒。
（2）高压蒸气灭菌：是普遍应用的灭菌效果最好的消毒方法；在121.3℃（1.05kg/cm2）持续30分钟的消毒处理是结核分枝杆菌及其污染物的最安全最彻底的方法。
（3）紫外线消毒：结核分枝杆菌对紫外线具敏感性。主要指日光内的紫外线和紫外线灭菌灯。痰标本涂片在直射的太阳光下照射2～7小时，可以杀死结核分枝杆菌，对结核患者的衣物、被褥等用品，采用太阳光照射的简单消毒法是有效的。尤其是在晴朗的夏天，经过太阳3～4小时的照射，可以完全达到消毒效果。结核病诊疗室、试验室应采取紫外线灭菌灯常规消毒。
作者：消毒杀菌灭菌网 来源：
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