生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）,_实验百科_中国百科网
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）,
    
1. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除往生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置进袋内，将此透析袋浸进水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保存在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保存液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除往。可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证实，50％乙醇处理对除往具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。新透析袋如不作如上的特殊处理，则可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装进待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进进袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50％是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉进液面以下。检查透析效果的方法是：用1％ BaCl2检查(NH4)2SO4，用1％ AgNO3 检查NaCl、KCl等。为了进步透析效率，还可以使用各种透析装置。使用者也可以自行设计与制作各种简易的透析装置。美国生物医学公司（Biomed Instruments Inc.）生产的各种型号的Zeineh 透析器，由于使用对流透析的原理，使透析速度和效率大大进步。2. 超滤超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的产业单元操纵技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。 超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤根据所加的操纵压力和所用膜的均匀孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤所用的操纵压通常小于4×104 Pa，膜的均匀孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。超滤所用操纵压为4×104 Pa～7×105 Pa，膜的均匀孔径为10-100埃，用于分离大分子溶质。反渗透所用的操纵压比超滤更大，常达到35×105 Pa～140×105 Pa，膜的均匀孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。 超滤技术的优点是操纵简便，本钱低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温顺，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。超滤技术的关键是膜。膜有各种不同的类型和规格，可根据工作的需要来选用。早期的膜是各向同性的均匀膜，即现在常用的微孔薄膜，其孔径通常是0.05mm 和0.025mm。近几年来生产了一些各向异性的不对称超滤膜，其中一种各向异性扩散膜是由一层非常薄的、具有一定孔径的多孔"皮肤层"（厚约0.1mm ～1.0mm ），和一层相对厚得多的（约1mm ）更易通渗的、作为支撑用的"海绵层"组成。皮肤层决定了膜的选择性，而海绵层增加了机械强度。由于皮肤层非常薄，因此高效、通透性好、流量大，且不易被溶质阻塞而导致流速下降。常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来为适应制药和食品产业上灭菌的需要，发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH 1～14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，若使用恰当，能连续用1～2年。暂时不用，可浸在1％甲醛溶液或0.2％ 叠氮化钠NaN3中保存。超滤膜的基本性能指标主要有：水通量（cm3/(cm2·h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。超滤装置一般由若干超滤组件构成。通常可分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的题目，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的Milipore公司和德国的Sartorius公司。国内主要的研究机构和生产厂家是：中科院生态环境研究中心、杭州淡化和水处理开发中心、兰州膜科学技术研究所、无锡化工研究所、上海医药产业研究所、天津膜分离工程研究所、北京化工厂、常熟膜分离实验厂、无锡市超滤设备厂、无锡纯水设备厂、天津超滤设备厂、湖北沙市水处理设备厂等。从膜的品种，以及从某些研究工作的深度方面看，我国与世畀先进国家的差距不很大，但在膜的质量性能及商品化方面尚有较大差距。 在生物制品中应用超滤法有很高的经济效益，例如供静脉注射的25％人胎盘血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸铵盐析法、透析脱盐、真空浓缩等工艺制备的，该工艺流程硫酸铵耗量大，能源消耗多，操诈时间长，透析过程易产生污染。改用超滤工艺后，均匀回收率可达97.18％；吸附损失为1.69％；透过损失为1.23％；截留率为98.77％。大幅度进步了白蛋白的产量和质量，每年可节省硫酸铵6.2吨，自来水16000吨。超滤技术的应用有很好的远景，应引起足够的重视。3. 冰冻干燥冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，由于大多数生物大分子分离纯化后的终极产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，由于生物大分子轻易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。 冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温顺高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥的原理可用溶剂的三相点相图来说明，见图 6 ：图中OA是固液曲线，OB是汽液曲线，OC是固汽曲线，O是三相点。当温度在三相点O以下，将压力降至OC线以下，溶剂（通常是水）就可以由固相直接升华为汽相。例如，冰在－40℃时其上方的蒸汽压为0.1毫米汞柱mmHg，在－60℃时其上方的蒸汽压为0.01毫米汞柱mmHg。固态的冰升华为水蒸汽时要吸收大量的热，1克0℃的冰变成0℃的蒸汽需吸热580千卡，所以升华时又可以使固态的冰进一步降温，空气湿润时可以看见装有固态冰的容器外壁上结有霜。冰冻干燥得到的生物大分子固体样品有突出的优点：①由于是由冰冻状态直接升华为汽态，所以样品不起泡，不暴沸。②得到的干粉样品不粘壁，易取出。③冰干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。 冰冻干燥特别适用于那些对热敏感、易吸湿、易氧化及溶剂蒸发时易产生泡沫而引起变性的生物大分子，如蛋白质、酶、核酸、抗菌素和激素等。对于极个别的在冻干时易变性失活的生物大分子则要十分谨慎，务必先做小量试验证实冻干无害后方可进行大量处理。冰冻干燥机的国产品牌近年来发展很快。如北京的军事医学科学院生产的小型、中型和大型产业用冰干机，已可以取代昂贵的进口产品。在实验室中还可以自已组装小型简易的冰冻干燥器。①预备一个较大的玻璃真空干燥器，将样品置于小培养皿中速冻后放进干燥器内，器内已事先用两个小培养皿分别盛有KOH(或NaOH) 和 P2O5，干燥器通过一个两端塞上棉花其中装满P2O5的干燥管与真空泵相连，抽真空后，经过5～10小时就可以得到冰冻干燥的样品。②将样品溶液置于一个园底烧并内，将烧并浸进干冰～乙醇低温浴（－60℃）中，样品即被速冻成冰块，将烧并标准磨口通过磨口管与一个冷阱相连，冷阱内放有干冰～乙醇混合液，冷阱的另一个出口管与真空泵相连，抽真空时汽化的水汽就冻结在冷阱的内壁上，抽真空数小时后即可在烧并中得到冻干的样品。此简易装置也可用于冻干含有少量乙醇、甲醇、丙酮等常用有机溶剂的样品，可重复以下的操纵除往这些有机溶剂：样品速冻→→抽真空至恒定→→使样品升温至室温挥发有机溶剂→→再速冻样品，如此反复多次，以除尽有机溶剂，否则样品不易冻干，且泵前应装有保护真空泵的缓冲并，以吸收水份和有机溶剂。 冰冻干燥操纵固然十分简单，但以下的留意事项却必须认真记取：⑴样品溶液：①样品要溶于水，不含有机溶剂，否则会造成冰点降低，冰冻的样品轻易融化，因而减压时会起大量泡沫，使样品变性、污染和损失。同时若含有有机溶剂，被抽进真空泵后溶于真空泵油，使其可达真空度降低而必须换油。②样品要予先脱盐，不可使盐浓度过高，否则冰冻后易融化，影响样品活性，而且不易冻干。③样品缓冲液在冰冻时pH可能会有较大变化，例如pH 7.0的磷酸盐缓冲液在冰冻时，磷酸氢二钠比磷酸二氢钠先冻结，因而使溶液pH下降而接近3.5，使某些对低pH敏感的酶变性失活，此时需加进pH稳定剂，如糖类和钙离子等。④样品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于15 mg/mL 为宜。同批冻干的样品液浓度不宜相差太大，以免冻干的时间相差过大。⑵装样品溶液的容器：①最好用各种尺寸的培养皿盛样品溶液，液层不要太厚，以免冻干时间太长，耗电太多。也可以使用安瓿并和青霉素小并。用烧杯时液层厚度不要超过2 cm，否则烧杯易冻裂。②冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，轻易飞散而损失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口，刺的孔不要过小过少，否则会影响冻干速度。⑶溶液冰冻：如有条件，尽可能用干冰～乙醇低温浴速冻，如能将盛有样品溶液的容器边冻边旋转形成很薄的冰冻层，则可以大大加快冻干的速度。⑷冻干：①样品全部冻干前，不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。②样品冻干达到较高真空度时，容器外部有时会结霜，若外霜消失，则说明样品已冻干，或是仅剩样品中心的小冰块，再稍加延长冻干时间即可。③冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下仃留时间过长而失活。④仃真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。⑤样品冻干后要及时密封冷躲，以防受潮。⑥真空泵要经常检查油面和油色，油面过低和油色发黑，则需换油，通常半年或一季度至少要换一次油。
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透析后的肌酐一般达到多少算透析清除率高
透析后的肌酐一般达到多少算透析清除率高透析2年，透析前肌酐1200，透析后肌酐700，请问这个透析效果可以吗？
共3条医生回复
因不能面诊，医生的建议仅供参考
职称：其他
专长：皮肤过敏
&&已帮助用户：128086
指导意见：你好根据你的情况描述考虑血肌酐大于700已经是尿毒症的表现是必须透析治疗但是透析治疗也是有风险的祝你早日康复
职称：医生会员
专长：内科
&&已帮助用户：113162
病情分析： .血肌酐大于700已经是尿毒症的表现，是必须透析治疗，但是透析治疗也是有风险的。
不做透析治疗，患者也可能会死亡，做也有风险，我认为还是做要好。。
问透析前肌酐是1500，透析后是560，算高吗
职称：护师
专长：妇科综合
&&已帮助用户：41301
病情分析： 您好，还是高的。一般是在200左右的。透析是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。 透析疗法是使体液内的成分（溶质或水分）通过半透膜排出体外的治疗方法，一般可分为血液透析和腹膜透析两种。经常透析肾脏会纤维化，而且会加重病情。意见建议：症状，但由于病理中度损伤，可视有无高血压以及浮肿情况，控制盐的摄入量，分别给予低盐或者无盐饮食。
二、维生素的摄入：肾衰肌酐高病人宜选用富含维生素A，维生素B2、维生素C的食物。如果肾功能不全仅有肾衰肌酐高，但无少尿、无浮肿病人不禁盐和水，维持低盐饮食。如果有严重水肿，以及高血压甚至是心衰的情况应严格限制禁盐。
问第一次做透析血肌酐从772降到702透析时间1.5小时为什么降这么低
职称：医师
专长：内科、消化内科
&&已帮助用户：10934
问题分析：你好！血清肌酐的浓度变化主要由肾小球的滤过能力(肾小球滤过率)来决定。滤过能力下降，则肌酐浓度升高。血肌酐值高出正常值多数意味肾脏受损，血肌酐能较准确的反应肾实质受损的情况，并非敏感指标。因为肾小球滤过率下降到正常人1/3时，血肌酐才明显上升。意见建议：其实肾脏已经损伤严重，此时血肌酐也开始明显上升，血浆肌酐的正常上限值为100微摩尔/升左右。而不同的医院检测标准也不一样，但都不会超过120微摩尔/升，根据你所说的情况肾脏受损应该挺严重，所以透析治疗是最好的方式，而你现在的肌酐还远远高于正常透析的目的还没有达到需要继续治疗。
问第一次做透析血肌酐从772降到702透析时间1.5小时为什么降这么低
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问题分析：你好！血清肌酐的浓度变化主要由肾小球的滤过能力(肾小球滤过率)来决定。滤过能力下降，则肌酐浓度升高。血肌酐值高出正常值多数意味肾脏受损，血肌酐能较准确的反应肾实质受损的情况，并非敏感指标。因为肾小球滤过率下降到正常人1/3时，血肌酐才明显上升。意见建议：其实肾脏已经损伤严重，此时血肌酐也开始明显上升，血浆肌酐的正常上限值为100微摩尔/升左右。而不同的医院检测标准也不一样，但都不会超过120微摩尔/升，根据你所说的情况肾脏受损应该挺严重，所以透析治疗是最好的方式，而你现在的肌酐还远远高于正常透析的目的还没有达到需要继续治疗。
问透析前肌酐是1500，透析后是560，算高吗
职称：护师
专长：妇科综合
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病情分析： 您好，还是高的。一般是在200左右的。透析是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。 透析疗法是使体液内的成分（溶质或水分）通过半透膜排出体外的治疗方法，一般可分为血液透析和腹膜透析两种。经常透析肾脏会纤维化，而且会加重病情。意见建议：症状，但由于病理中度损伤，可视有无高血压以及浮肿情况，控制盐的摄入量，分别给予低盐或者无盐饮食。
二、维生素的摄入：肾衰肌酐高病人宜选用富含维生素A，维生素B2、维生素C的食物。如果肾功能不全仅有肾衰肌酐高，但无少尿、无浮肿病人不禁盐和水，维持低盐饮食。如果有严重水肿，以及高血压甚至是心衰的情况应严格限制禁盐。
问尿毒症中晚期肌酐1200只能透析吗
专长：生殖孕育、人流、宫颈糜烂
&&已帮助用户：220664
你好根据你说的情况建议你到附近正规的医院做一下检查祝您早日康复
问糖尿病肾病肌酐700医生让透析可以腹透吗
专长：中医儿科，中医内科
&&已帮助用户：221481
肌酐的升高是因为肾脏发生纤维化具有滤过功能正常肾单位被纤维组织所代替失去排毒功能关键是肾脏的固有细胞的修复激活残存的肾脏功能治疗.透析只是起到人工肾的作用可以暂时缓解高毒素对机体的损伤并不是针对肾脏的治疗即使应用了透析也需要同时行保护肾功能治疗建议中西医结合一体化治疗.
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