如何获得高质量，高可信度的cfx96荧光定量pcr仪结果

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-11-26 02:59 标签： 实时荧光定量pcr
实时荧光定量PCR实验结果分析_图文_百度文库
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实时荧光定量PCR实验结果分析
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【求助】实时荧光定量PCR，如何计算统计学P值
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这个帖子发布于2年零351天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
实时荧光定量PCR实验结束了，如何计算统计学P值？请各位高手支个招。。。
不知道邀请谁？试试他们
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怎么没人回答呢？我也想知道
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aids610610 实时荧光定量PCR实验结束了，如何计算统计学P值？请各位高手支个招。。。 说一下我们的方法吧，首先用目的-内参，在结果中找一个最大的数值，用所有的结果减去这个数值，最后在带入2^（-x)，得到的数值统计一下
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说一下我们的方法吧，首先用目的-内参，在结果中找一个最大的数值，用所有的结果减去这个数值，最后在带入2^（-x)，得到的数值统计一下 非常感谢，楼主能说一下原理吗？
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aids610610
非常感谢，楼主能说一下原理吗？ 先用目的-内参去除组间差异，减最大值是方便统计，2的次方是对数据扩增
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先用目的-内参去除组间差异，减最大值是方便统计，2的次方是对数据扩增 减最大值是方便统计?
为啥是减去最大值？能说说理由吗？谢谢
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aids610610
减最大值是方便统计?
为啥是减去最大值？能说说理由吗？谢谢呃，其实正常的统计方法是所有数据减去control组数据，这样可以使control组归为1，其他组数据和control组比较。减去最大值是个人习惯。
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ACEI1990 呃，其实正常的统计方法是所有数据减去control组数据，这样可以使control组归为1，其他组数据和control组比较。减去最大值是个人习惯。 非常感谢，哈哈
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ACEI1990 呃，其实正常的统计方法是所有数据减去control组数据，这样可以使control组归为1，其他组数据和control组比较。减去最大值是个人习惯。 这位老师还是还说到底怎么算p值啊，你说的是怎么计算倍数。
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一条路走下去
这位老师还是还说到底怎么算p值啊，你说的是怎么计算倍数。 额 我最近也在学
尝试说下我的算法 来交流我要测基因M在A、B两种组织中的表达差异问题U6为参比基因
一个样本三个复孔 用BIO RED测出来之后
M基因在A和B中的Ct值分别减去U6的Ct值，得到两个ΔCt再求这两个ΔCt的2-ΔCt值，即为基因M在A和B两个组织中的相对表达值用SSPS软件 输入数据后 点击分析
选择 非参数分析 两个相关样本分析
不知道对不对
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关于丁香园　　荧光定量PCR（Real-time PCR）是目前基因表达定量分析的重要检测手段，已经为越来越多的研究者所采用。“好的开始是成功的一半”，Perrez-Novo等(Perrez-Novo et al., 2005)曾报道获得高质量RNA对后续PCR定量结果的准确性是非常重要的，而高质量RNA是获得高质量cDNA的必要条件，所以本文着重介绍一下如何获得高质量cDNA。
高质量cDNA应具备以下几个特点：无基因组DNA残留、能准确反应出样本真实的转录情况和信息完整且浓度适当等特点。
高质量cDNA应保证无基因组DNA残留
在提取RNA的过程中，常常会有基因组DNA的残留，从而导致实验结果的不准确性或假阳性结果的出现。2008年，Nature Protocol的一篇关于荧光定量PCR实验研究的文章1中明确指出，在合成cDNA第一链之前应去除基因组DNA残留，以免cDNA中有基因组DNA的存在，影响高灵敏度的荧光定量PCR实验结果：
那么，如何避免基因组DNA对荧光定量PCR结果的影响呢？对于真核生物，由于内含子的存在，可以选择跨内含子设计引物的方法来避免基因组DNA及假基因（Pseudogenes）的影响。如分别在相邻的两个外显子上设计qPCR引物，这样基因组DNA的扩增片段与cDNA扩增片段相比就增加了一个较大的内含子，而荧光定量PCR的延伸时间很短，很难扩增出大片段，如果使用SYBR Green方式检测，一旦有来源于基因组的扩增片段出现也可以在分析溶解曲线时发现。而对于原核生物，必须经过DNase I消化去除基因组DNA；但是，很多实验者发现，跨内含子设计引物有时的实验结果不佳，原因可能是基因组DNA增加了模板的复杂性，与目的模板竞争引物和酶等，可能导致PCR扩增效率的下降，影响定量结果的准确性；另外，并不是每个基因都能在相邻的且大小合适的外显子上找到合适的跨内含子引物，所以，很大部分实验需要在一个外显子上设计引物，这时就必须经过去除基因组DNA步骤，才能得到准确可靠的结果。
传统基因组DNA去除的方法采用对RNA进行处理，由于引入了蛋白（DNase I），后续需要进行氯仿抽提纯化，操作繁琐，耗时长，RNA的回收率低。TIANGEN公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（KR106，TIANGEN），将基因组DNA去除完美整合到反转录步骤中，采用全新的gDNase Buffer，可3 min快速去除基因组DNA残留，操作简便，无需氯仿抽提纯化步骤；而后利用高效FastQuant RT Enzyme 完成cDNA第一链的合成及gDNase灭活仅需18 min，并且所有反应均在同一离心管中完成，大大简化了操作步骤，节省了时间，被称为“21 min的一管式革命”。
高质量cDNA应能准确反映样本真实的转录情况
RNA纯化方法多种多样，包括有机溶剂沉淀法，硅基质膜吸附法，玻璃纤维素膜吸附和磁珠法等，那么，怎样选择适合自己的纯化方法呢？就要根据样本类型及后续实验对RNA质量待需求来进行综合考虑。高质量RNA应能准确反映样本真实转录情况的转录池（transcript pool）。
一般有机溶剂沉淀法对样本的起始量没有严格限制，获得的是包含总RNA和小RNA在内的总RNA，用沉淀法可以得到浓度较高或较为大量的RNA，多用于Northern Blot等RNA需求量大的实验；硅基质膜吸附法一般用于纯化片段较大的总RNA，mRNA保留比较完整，纯度高，多用于RT-PCR或Real-Time PCR分析；玻璃纤维素膜常用于纯化片段较小的RNA片段，纯度较高，经常用于microRNA等小RNA的分离实验；磁珠法一般用于RNA含量较少的样本，获得的RNA量比膜吸附法高，但纯度略低。
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