实时定量pcr试剂盒求助

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-12-08 09:08 标签： 实时荧光定量pcr
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请教版上有没有大侠实时荧光定量PCR做细菌定量
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请教大家，有没有用过定量PCR来做细菌定量呢
我一直不清楚的是
OD值与DNA拷贝数之间的关系是有推算的公式还是怎样呢？
[ 本帖最后由 vitae 于
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我没有做过!
希望做过的朋友能帮助到你!
机会凭自己争取！
命运靠自己把握！
生命是自己的画板！
为什么要依赖别人着色？
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如果你选用的基因在基因组中是单拷贝或者是已知拷贝数的，理论上是可以定绝对量的。做的时候先做好标准曲线。
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回复 3# moon87 的帖子
支持一下，只要知道确切的拷贝数就可以对照标准曲线进行实时定量。或者你可以用传统技术方法与RT－PCR进行对照实验建立对应关系以便定量。
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实时荧光定量PCR做细菌定量，是不是通常用于致病菌的检测啊？有可以依据的标准吗？对这个很感兴趣，希望能和大家交流。以前在学校经常做RT-PCR和荧光定量PCR，到单位反而用不上这些技术。
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谢谢楼上各位朋友的回复
我现在疑惑的是，某个基因的拷贝数我如何能知道呢？到哪里查呢，根据文献还是怎么样呢？
呵呵，rr的问题，请教大家，期待大家的回复
荧光定量PCR可以用于做菌的定量的哦，主要是标准曲线我不明白是怎么建立出来的
好像是用一系列稀释梯度的菌液提取DNA然后，直接用DNA进行PCR，然后在Ct值与菌数之间建立一条标准曲线，从而对未知菌数的样品进行定量
可能是我没看懂，genomic target/PCR,&&CFU/PCR这两种表达方式，我一直没明白，来请教大家。
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（1）如何知道某个基因的拷贝数，我觉得主要是根据文献。当然，也可以根据自己对已知的微生物的全基因组序列的分析判断。
（2）对于rRNA，在不同微生物中的拷贝数是不一样的，如大肠杆菌是7个拷贝，枯草芽孢杆菌是10个拷贝，所以，用rRNA基因来定量，最好是设计针对某种微生物的特异引物来分析，如果采用细菌通用引物分析未知微生物样品时，无法绝对定量。
（3）标准曲线的建立，先确定标准样品的菌数，以大肠杆菌为例，一般认为大肠杆菌在LB培养基中生长到1 OD的时候，对应的菌数是10的9次方（这种OD值与菌数之间的对应关系，不同的微生物也是不同的，你可以针对自己要做的微生物进行测量，即对已知OD值的培养物通过血球计数以及菌落计数来确定OD与菌数之间的关系）；
提取DNA，将DNA进行逐级稀释，进行Real-Time PCR，这样建立Ct值与DNA以及菌数之间的标准曲线；也可以将微生物进行逐级稀释后提取DNA，进行PCR后建立标准曲线；但后者与你提取DNA的效率有关，当菌体数量低于某个数量级后，DNA不易获得，所以我们常采用第一种方法建立标准曲线。
[ 本帖最后由 moon87 于
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需要其他的荧光定量方面的产品不
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我想请问各位大侠 PCR与咱们的传统法相比哪个更好一些呢
或者说PCR有哪些更突出的优点呢
努力!为了更好的明天!
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楼上日记MM和我发言语气好像哦呵呵~~
十分感谢大家的回复
特别感谢moon，以前也发过RT方面的帖子，还问到了所用耗材等细节问题，moon的回答切实回答了我的疑问，我想也回答了看到这个帖子的与我有类似疑惑的朋友们的疑问
再次感谢moon于凌晨的回复:)
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原帖由 蓝色日记 于
21:09 发表
我想请问各位大侠 PCR与咱们的传统法相比哪个更好一些呢
或者说PCR有哪些更突出的优点呢
对于菌种鉴定，如果有条件，建议先做16S rRNA 基因分析，然后补充生理生化等检测，可以节约时间，有的放矢。
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利用实时定量PCR分析基因相对表达量
利用实时定量PCR分析基因相对表达量
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METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen?,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ? Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量 实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。1. 2－△△CT方法1.1. 2－△△CT方法的推导PCR 指数扩增的公式是：这里，Xn 是第 n 个循环後目标分子数，X0 是初始目标分子数，Ex 是目标分子扩增效率，n 是循环数，C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。因此：X T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数。C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数。Kx 是一个常数。对于内参反应而言，也有同样的公式：用XT 除以RT 得到：对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言， XT 和 RT 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K 并不一定等于1 。假设目标序列与内参序列扩增效率相同： 或：XN 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△CT表示目标基因和内标基因CT值的差异（CT,X－CT,R ）整理上式得：最后用任一样本q 的XN 除以参照因子（calibrator, cb）的XN得到：在这里对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果 Mg2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是
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