荧光定量pcr步骤技术解决的是什么问题

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2015-10-19 08:44 标签： 实时荧光定量pcr
查看: 3083|回复: 6
新手做了一次荧光定量PCR,内参有结果,目的基因不佳,是引物问题么?
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秀基因 个 秀蛋白 个
第一次做RT-,也没人具体带,所以比较迷茫
荧光定量PCR,用了4个动物标本的CDNA,测同一个指标
目的基因的曲线大多杂乱,极个别有单峰曲线,但是CT值也非常大
4个的内参的曲线单峰,CT值30几
把PCR结果跑了下胶,
4个标本的都没有跑出条带,内参的可以跑出目的条带
请问下 这种情况是可能是引物原因还是加样之类的? 有什么方法可以确定么?
另:因实验室分光光度计不太准,没有测过
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可以先用CDNA和内参基因跑一下普通的PCR，如果能有目的条带，可以说明是引物的问题。如果加样不准确会造成峰值高低的不一致，但不会出现杂峰之类的。
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之前用realtime pcr做的
CDNA和内参基因的扩增产物跑胶可以得到目的条带 是不是和普通PCR的效果一样？
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是的。其实RT-PCR也是PCR的一种，只是加了荧光染料便于实时监测。
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那么根据realtime pcr结果理论上来说
我的CDNA 没问题?
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基本应该是这样，如果你得到的目的条带没有引物二聚体的干扰。
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感觉是引物问题吧
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看家基因作用是什么？实时荧光定量PCR技术中为什么要用它？
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那么看家基因的作用就出现了看家基因的意思是稳定表达的一种基因所以他的作用就是用来做内参比如在做PCR的时候，初始的模板量的不同直接导致扩增后的量的差别，要在看家基因的表达水平相同的情况下，比较其他基因的表达是否有升高或降低
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hiphotos，一般采用△△CT法对实时荧光PCR扩增数据进行处理./zhidao/wh%3D600%2C800/sign=16de9b3255fbb2fb347ec9c/4afbfbedab69afcd4b，△CT&nbsp用来参照的.hiphotos。
可以说一下荧光定量PCR中将看家基因加到哪里吗？检测手段是什么？
做相对定量就要用它。不然你的参照物是什么
看家基因一定可以p的出来，主要用于对比，
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出门在外也不愁荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思_百度作业帮
荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思
荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思
PCR原理中,反应一个循环,PCR产物扩增一倍,即为之前的2倍.……反应N个循环,理论上应为原来的2的N次方.此时,理论的扩增效率是100%,即1.但实际上,由于酶,dNTPs,引物,模板等因素,扩增效率达不到100%.因此,我们就要做标准曲线,看实际的扩增效率是多少,也就是标准曲线的斜率.理论上100%的扩增效率,换算出来的斜率是-3.32.
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：
Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n
其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。解决时间: 09:28
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普通PCR与荧光定量PCR技术区别？
回答者：匿名用户
&简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定 量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特 定的mRNA的含量等。
前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。
欢迎对最佳答案进行评论或补充，发表您的不同见解！
常规PCR：对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析
荧光定量PCR：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分析
作者：zzx555bs 时间： &共0人支持此评论
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【求助】荧光定量PCR溶解曲线出现杂峰问题
【求助】荧光定量PCR溶解曲线出现杂峰问题
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这个帖子发布于3年零201天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我是新手，今年刚开始做实验，已经做预实验一个多月了，共检测两个基因mRNA的表达，发现其中一个基因的溶解曲线总出现杂峰，怀疑是引物的特异性不好，重新设计引物结果稍好一点，但还时有杂峰出现，而且出峰位置不一，不知道是什么原因，望各位前辈指教，非常感谢！
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你qpcr做完以后把产物拿来跑一个琼脂糖的胶看一看是不是引物二聚体还是非特异性产物要是是非特异性产物就要再调整qpcr的条件了，或者重新设计引物引物二聚体的话慢慢调qpcr的条件总是可以的
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tco_001 你qpcr做完以后把产物拿来跑一个琼脂糖的胶看一看是不是引物二聚体还是非特异性产物要是是非特异性产物就要再调整qpcr的条件了，或者重新设计引物引物二聚体的话慢慢调qpcr的条件总是可以的非常感谢，电泳结果显示的PCR产物比预扩增的片段大，是不是说明扩增的并非是目的基因片段呀？
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鸿鹄and燕雀 非常感谢，电泳结果显示的PCR产物比预扩增的片段大，是不是说明扩增的并非是目的基因片段呀？要是扩出来的大小都不对应该就不是目的产物了
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建议重新设计引物吧
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谢谢各位师兄师姐，我换了一对引物，溶解曲线好多了，是单峰，可是CT值在34左右，不确定结果可不可靠，我可不可将反转录的cDNA浓缩后做个标准曲线？还有具体怎么浓缩呀？
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