一种应用于混合建库的高通量测序接头及其建库方法
专利名称一种应用于混合建库的高通量测序接头及其建库方法
技术领域本发明涉及高通量测序领域，具体的说，涉及一种节约时间、成本并提高效率的文库构建方法的改进。
背景技术通常用Truseq试剂建库所需流程简单，建库成功率高，但费用昂贵，时间长，在建库数目多时要消耗大量时间及费用。而NEB试剂建库虽然费用相对较低，但流程相对繁琐。
混合建库是在Truseq试剂和NEB试剂建库方法上的改进。通过在片段选择步骤前加上可以识别不同文库的Index，然后将不同文库进行混合。该方法与传统方法比会使后续的切胶进行片段选择和PCR步骤上节约大量试剂成本、人力成本及时间。该方法特别适用于基因组小的生物基因组重测序及测序深度低的基因组测序。发明内容
本发明的一个目的是合成Illumina公司的双链接头,并替换Index,增加Index数量。
本发明提供的双链接头DNA序列分子A，包括正向和反向两条链。正向链5’末端到3’末端与Illumina公司的Hiseq2000测序平台测序序列P7除Index部分6个碱基不同，其余都相同，并在5’末端进行磷酸化修饰；反向链与Illumina公司的HiSeq2000测序平台测序序列P5相同。接头A的结构如图I所示。
前述的与illumina公司的Hiseq2000测序平台测序序列p7相同的寡核苷酸片段，为序列表中序列I的第1-33位和40-63位。
前述的替换的Index部分，为序列1、2、3中的第34-39位。
前述的在正向链5’末端进行磷酸化修饰，为序列表中序列1、2、3的第I位的脱氧核糖核苷酸进行的磷酸化修饰。
前述的反向链为序列表中序列4。
本发明的第二个目的是运用上述接头A，混合构建不同样品文库；结合Truseq试剂和NEB试剂建库方法，混合构建文库包括如下步骤，如图2所示1)将基因组DNA打碎大小集中在300bp左右；2)对步骤I)得到的打碎产物纯化回收之后，进行末端补平。对末端补平的产物进行 3’加dATP，将加dATP的产物连上接头A ；3)对步骤2)得到的连接产物进行混合后，跑琼脂糖凝胶电泳分析，如图3所示；根据所需文库大小选择选择片段，如图4所示；4)将片段纯化并定量后进行PCR扩增，并将扩增产物纯化，然后在Illumina公司的 Hiseq2000测序平台进行测序；5)进行生物信息分析。
前述的运用上述接头A，混合构建不同样品文库的方法，其中步骤I)中，所述的打碎的条件为使用covaris打碎仪器并调整相应的参数。
前述的运用上述接头A，混合构建不同样品文库的方法，其中步骤2)中，所述的回收打碎产物的方法为采用PCR产物回收试剂盒进行回收；所述的末端补平体系为使用NEB 公司的Quick Blunting kit进行；所述的加dATP的体系包括dATP, 10XNEB Buffer 2, Klenow exo-聚合酶,所述的dATP的浓度为100 mM,所述的聚合酶在所述的反应体系中的浓度为25 U/所述的接头A的连接体系包括接头A, 2XQuick Ligation Buffer、Quick T4 DNA Ligase，所述的接头A的浓度为8 uM。
前述的运用上述接头A，混合构建不同样品文库的方法，其中步骤4)中，所述的纯化采用Qiagen公司的胶回收试剂盒进行回收；PCR体系包括引物，聚合酶混合物，以及步骤3)中得到的连接产物。
进一步地，所述PCR体系包括引物，聚合酶混合物，以及步骤3)中得到的连接产物包括引物的浓度为O. 2 uM，所述聚合酶混合物在所述PCR体系中所占的50%的体积。
本发明的实验证明，本发明提供的接头分子A，能够连接到DNA片段的两端，运用本发明的建库方法，成功的构建了 DNA文库，并成功的运用在illumina公司的Hiseq2000 的测序平台进行测序，新引入的Index能够将文库很好的分开；同时，可以实现多个样本的混合建库。本发明提供了一种便捷，高效，快速的构建文库的方法，大量节约了试剂成本，人力成本及时间。
图I为接头A的结构示意图；图2为建库流程示意图；图3为连完接头A的琼脂糖凝胶电泳图；图4为连完接头A切胶选择完片段大小的琼脂糖凝胶电泳图；图5为2100检测结果；图6为混合建库测序质控结果。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法，所用核苷酸序列均由上海 Invitrogen生物公司合成。所用试剂如无特别说明均为NEB公司的产品,所用水均为超纯水。
一、质量检测。
I.样品浓度测定使用Qubit (美国)对样品DNA浓度测定，进行精准定量，并使用O. 8%琼脂糖凝胶，120v电压，电泳I小时，检测样品质量，确保基因组DNA样品完整无降解。
二、基因组片段破碎。
2.将基因组DNA使用covaris (美国)破碎至300 bp左右，使用Qiagen PCR试剂盒回收打碎产物，具体步骤按照Qiagen试剂盒操作说明书进行。
3.对上述回收产物进行末端补平；反应体系和反应条件如下打碎产物DNA 30μ , IOXBlunting Buffer 5 M-I, I mM dNTP 10 M-I, Quick Blunting kit Enzyme Mix, I μ
JPH2O 9 μ ，总体系50 μ反应条件30 °C孵育30 min。用I. 6倍体积的Ampure XP beads对补平产物进行纯化。
三、打碎片段末端修复、加dATP。
4.对步骤3中的纯化产物进行加dATP ;反应体系和条件如下步骤3中的补平产物，20 μ1，100 mM dATP I μ , 10ΧΝΕΒ Buffer 2 3 μ , Klenow exo- (NEB) (50,000 units/ ml) 0. 5 μ1，Η20 5.5 μ ，总体积 30 μ反应条件充分混匀，37 °C孵育 30 min, 75 °C 20 min热失活。
四、加dATP产物加接头A。
5.对加dATP产物，加入接头A，接头A结构如图I所示；反应体系和条件具体如下连接产物 24 Kl，2XQuick Ligation Buffer 30 μ , Quick Τ4 DNA Ligase I. 2 μ ，8 uM接头A 5 μ ,总体积60 μ ,室温下连接30 min。用I. 6倍体积的Ampure XP beads对连接产物进行纯化，纯化过程严格按照使用说明书进行。
6.将步骤5中的连接产物进行Qubit定量，按照测序数据量将不同样品的连接产物进行等量混合。
7.配制2%的琼脂糖凝胶电泳，如图3所示；将混合的连接产物进行切胶选择片段大小,如图4所示；采用Qiagen公司的胶回收试剂盒进行回收；对回收产物进行Qubit定量，用于下一步PCR扩增。
五、PCR扩增。
8.将7中回收的产物，精准定量IOng用于PCR反应，得到的PCR产物，即为所构建的文库。反应体系和条件如下DNA样品3 μ1，ΡΟ
Primer I I Pl，PCR Primer 2 I μ ， 2 X Phusion PCR Master Mix 25 μ1，Η20 20 μ ，总共 50 μ ，应条件为先 98°C预变性 I 然后 98°C 10 s，60°C 30 s，72°C 30 s，共 10个循环；最后 72°C 延伸 5 minoPrimer I 的序列为 5’ -AATGATACGGCGACCACCGA-3’ ；Primer 2 的序列为 5’ -CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。
9.将步骤8中的PCR产物等体积AMP μ re XP Beads纯化两次；纯化过程严格按照使用说明书进行；取出Iul进行2100检测，结果表明，得到文库大小为351 bp，如图5 所示。
10.将步骤9中的纯化产物进行Qy bit精准定量。
六、文库库检和上机。
11.将步骤9中所得的纯化产物稀释到lng/ul，取出Iul用于Agilent2100 (美国Agilent公司)检测，另外再取Iul用于qPCR (Biorad公司)检测，根据检测结果，决定上机浓度。
12.根据步骤I所得的浓度，将文库稀释到上机要求后，在Illumina公司的 Hiseq2000测序平台进行测序。
七、上机结果质控。
利用上述方法对3个蜜蜂重测序样品进行混合建库。
结合图6所示，结果分析如下Q20，Q30 :从图中可知PoolBee的Q20，Q30达到98%以上，而对于重测序项目:要求Q20 不小于90% ；Q30不小于85%，即便是De novo项目也不过是Q20要求不小于95% ；Q30不小于90%，所以此次测序质量良好。
Adapter 污染率此次混合建库的 adapter rate 分别为 O. 02%、O. 03%、O. 02%, Adapter rate在5%以下认为正常,所以此次建库Adapter rate正常。
Duplication :此次混合建库的 Duplicationl. 85%、2· 26%、2. 53,混合建库 Duplication 一般较高,此次建库Duplication在允许范围内。
数据量此次测序目标数据25M，实际数据20M左右，少了 5M数据。且Poolbee-I、 Poolbee-2, Poolbee-3得到的数据有所差异，这可能与混合样品时手法及文库中实际有效浓度有关。
综上所述此次建库合格，测序质量良好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种接头序列A，其特征在于
由序列表中序列I或2或3和4所示的核苷酸序列组成的接头。
2.一种运用如权利要求I所述的接头A，混合构建不同样品文库的方法，其特征在于，包括如下步骤
1)将基因组DNA打碎，大小集中在300bp左右；
2)对步骤I)得到的打碎产物纯化回收之后，进行末端补平；对末端补平的产物进行3’加dATP ;将加dATP的产物连上接头A ；
3)对步骤2)得到的连接产物进行混合后，跑琼脂糖凝胶电泳分析；根据所需文库大小选择片段；
4)将片段纯化并定量后进行PCR扩增，并将扩增产物纯化，然后在Illumina公司的Hiseq2000测序平台进行测序；
5)进行生物信息分析。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于
结合Truseq试剂和NEB试剂建库方法，并对多个DNA文库同时构建。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于根据权利要求2所述的方法，其特征在于
通过连接不同的Index接头A,构建DNA文库。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于
其所述的材料DNA来源，是植物，动物或者微生物。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于
测序平台为illumina Hiseq2000测序平台。
本发明基于illumina公司的Hiseq测序平台原理，设计了含有新的Index序列的接头，通过结合Truseq试剂建库和NEB试剂建库方法，成功建立了一种对多个文库同时构建的混合建库方法，从而节约了建库成本和时间，提高了建库效率。
文档编号C40B50/06GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者蒋智, 刘少卿, 吴静, 彭献军 申请人:北京诺禾致源生物信息科技有限公司扫二维码下载作业帮
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在于，它采用了2条基因特异性引物，因此不易产生非特异性扩增。该方法可以快速、高效地扩增
或基因组中已知序列两侧位置的片段。
随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。在过去寻找新基因的方法中，以消减杂交、mRNA
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谢！ JUST DO IT！ 92/92 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌 60/92
革兰氏阳性球菌： 产品样本、水、环境监测中发现的大多数阳性球菌来自人，有些可能来源于天然来源的原料。
药品生产中包括无菌工艺，最常见的污染物是革兰氏阳性球菌，有葡萄球菌属、微球菌属、链球菌属。 人源污染的细菌经常与不规范的无菌行为和操作、裸露的皮肤或头发(人类脱落)有关。 常见革兰氏菌污染来源 61/92
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常见革兰氏菌污染来源 63/92 革兰氏阴性球菌 在医学上是与人类有关的。 它们包括引起性传播疾病(淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌)和呼吸道感染(卡他莫拉菌)的微生物。 这类的污染很少出现在生物工艺中。 如果结果显示有革兰氏阴性球菌污染，很有可能是检验错误。 常见革兰氏菌污染来源 64/92 革兰氏阴性螺旋菌 在制药用水系统或洁净室环境很少发现。 这些细菌与排泄物污染有关,包括被污染的水源。 当检测到该类菌时，应该全面调查找到它的潜在来源。
常见革兰氏菌污染来源 65/92 分离纯化得到单菌落 菌落形态检验
构建系统发育树 分子生物学鉴定
通用引物扩增细菌16S rDNA 序列 16S rDNA序列分析 鉴定结论
样品接收 革兰氏染色 形态鉴定
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66/92 生理生化--半自动细菌鉴定仪（ATB New） 检测项目：可鉴定由环境、原料及制成品分离出的菌种和药敏试验（包括：肠杆菌、非发酵G-杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌）。可鉴定770种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。 67/92 分离纯化得到单菌落 菌落形态检验
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68/92 分子生物学--具体流程 基因组的制备 PCR克隆16sRNA 阳性克隆鉴定，测序 同源性分析，系统进化树建立 69/92 系统发育树 根据同源性分析结果和系统发生树来判定该菌株为Cellulophaga属细菌, 命名Cellulophaga sp.QY201。
* 70/92 3、真菌的鉴定 71/92 真菌的鉴定流程图 分离纯化得到真菌样品的单菌落 真菌菌落形态观察 真菌DNA的提取
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通用引物扩增真菌ITS 序列 ITS序列在GenBank中进行Blast分析 鉴定结论
真菌形态观察
通常把真菌分为酵母菌和丝状真菌(霉菌)。
霉菌由粗大、有隔或无隔分支状菌丝构成，菌丝分为基质菌丝和气生菌丝。气生菌丝特化结构上产生多种无性、有性孢子。孢子着生部位、排列方式以及孢子形态是真菌鉴定的重要依据。 * 73/92
酵母菌 是微小的单细胞真菌。 可能在非专业人员看来，平皿上的酵母菌落像细菌。然而，在显微镜下，这些细胞大得多，看起来像葡萄干，因此可以很容易地区别于细菌。 生物工艺中典型的酵母污染是生物工艺中的人员、植物和原材料。 常见酵母菌污染来源 74/92 霉菌 是多细胞真菌，其产生的细丝称为菌丝。因此其学名为“丝状真菌”。 这类微生物在土壤、尘埃(粉尘)和植被中非常常见。 霉菌污染是这些微生物在生殖周期中会产生的孢子。因此霉菌污染很容易传播。 另一个问题是大多数物种产生的真菌毒素对人类有
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