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BVDV诱导MDBK细胞产生凋亡的分子机制研究.pdf 86页
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分类号：密级：学号:单位代码：10759石河子大学石河子大学石石河河子子大大学学硕士学位论文硕士学位论文硕硕士士学学位位论论文文BVDV诱导MDBK细胞产生凋亡的分子机制研究学位申请人王讲德指导教师陈创夫教授指导小组教师张辉副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向动物疾病病理学所在学院动物科技学院中国新疆石河子2013年6月ResearchonthemechanismofapoptosisofMDBKcellsinducedResearchonthemechanismofapoptosisofMDBKcellsinducedRReesseeaarrcchhoonntthheemmeecchhaanniissmmooffaappooppttoossiissooffMMDDBBKKcceellllssiinndduucceeddbyBVDVbyBVDVbbyyBBVVDDVVADissertationSubmittedtoShiheziUniversityShiheziUniversitySShhiihheezziiUUnniivveerrssiittyyInPartiaLFuLfiLLmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureMasterofAgricultureMMaasstteerrooffAAggrriiccuullttuurreeByByBByyWangJiang-deWangJiang-deWWaannggJJiiaanngg--ddee(BasicVeterinaryScience)(BasicVeterinaryScience)((BBaassiiccVVeetteerriinnaarryySScciieennccee))DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuAssociateProf.ZhangHui课题来源课题来源课课题题来来源源国际合作项目项目名称：牛病毒性腹泻粘膜病防制新技术课题编号：2013DFR30970国家自然科学基金项目项目名称：牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白E2与牛胚胎滋养层细胞相互作用的分子机制研究课题编号：学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师指导下进行的研究工作及取得的科研成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已发表和撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示感谢。研究生签名：时间：年月日学位论文版权授权书本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门和指定机构送交论文的电子版或纸质版。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日中文摘要[]bovineviraldiarrheavirusBVDV目的牛病毒性腹泻病毒（，）属于黄病毒科瘟病毒属的负链RNA病，该病毒主要引起腹泻、持续性感染、免疫抑制和母畜流产等主要症状。目前随着我国养牛业的快速发展，给我国的畜牧业发展带来了严重损失。根据BVDV能否在培养的细胞中产生致细胞病变的效应，将其分为致细胞病变BVDV（cpBVDV）和非致细胞病变BVDV(ncpBVDV)两种生物类型，其中cpBVDV能够使宿主细胞产生凋亡。探讨cpBVDV诱导宿主细胞产生凋亡的机制有助于我们开发针对病毒感染高效的生物治疗方法。[方法]（1）构建MDBKCs和BMDBKCs两个样品的cDNA文库，结合Solexa高通量测序技术和生物信息学方法鉴定miRNA的表达谱，利用qRT-PCR对表达差异显著的miRNA（miR-129-3p、miR-33a、miR-532、bno-miR-2、bno-miR-69和bno-miR-160）进行验证；（2）荧光显微镜观察cpBVDV感染的MDBK细胞形态变化，利用流式细胞仪检测感染细胞凋亡率；(3)利用qRT-PCR检测cpBVDV感染的MDBK细胞中miR-33a的表达水平；(4)利用Targetscan软件预测miR-33a的靶基因，构建重组载体pMD18-MAP3K33'UTR和双荧光素酶重组表达载体pmirGLO-MAP3K33'UTR，限制性核酸内切酶SACI/XHOI进行双酶切鉴定并测序，双荧光素酶基因检测法进行靶基因验证；(5)qRT-PCR检测转染miR-33aNC(阴性对照)和miR-33amimics的MDBK细胞中miR-33a的表达水平；(6)采用qRT-PCR和Westernblot分别检测靶基因MAP3K3和抗凋亡基
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【求助】用双荧光素酶检测系统检测时候的96孔板是什么样的板
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RT，是用全透明的，还是黑色不透明的，还是白色布透明的。谢谢啦，
不知道邀请谁？试试他们
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普通的96孔板就可以了。
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michaelmichael 普通的96孔板就可以了。:X透明的会有干扰的，黑色的会降低灵敏度，所以一般大家都用全白不透的板子。
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晕，如是读板器直接读板的话，要选择底透明，壁不透明的96孔板:D
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因为只有这样才能不干扰检测，且机器可直读荧光
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到底用哪种板子？用全波段荧光分光光度计可以检测吗？
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mouse_haiyan 到底用哪种板子？用全波段荧光分光光度计可以检测吗？如LS所言“如是读板器直接读板的话，要选择底透明，壁不透明的96孔板”，不可用“全波段荧光分光光度计”，因为这不是荧光，而是luciferase bioluminescence（生物发光），和一般荧光最大的区别应该是荧光需要激发光，而luciferase bioluminescence不需要，所以检测原理是不同的，现在不少公司的plate reader是多功能的，一机多用，可检测以上两种，以及吸光度等。
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谢谢LS战友！明白了
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你可以参考promega公司推荐的板子E&K Scientific, EK-25075 这是一种全白的板子大多读板机都是可以top read的
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关于丁香园利用双荧光素酶报告基因系统检测猪miR-369与TNF-α基因的靶标关系--《四川农业大学》2011年硕士论文
利用双荧光素酶报告基因系统检测猪miR-369与TNF-α基因的靶标关系
【摘要】：本实验通过猪与人TNF-α基因序列相似性的比对,及与猪miR-369第2-8位种子序列相匹配的靶位点的寻找和对比,预测猪miR-369同样调节TNF-α基因的表达。为了验证这一结果,本实验利用双荧光素酶报告基因系统去检测猪miR-369与TNF-α基因的靶标关系。结果显示：
(1) TNF-α基因在人、猪、大鼠、小鼠、牛和家兔中,均具有较高的相似性,其中猪与牛的相似性最高,与人次之。
(2)猪与人的TNF-α基因中,3'UTR区域含有相同核苷酸数目(34 nt)的AREs,且相似性极高。经miR-369第2-8位种子序列碱基匹配预测,在AREs区域两者含有两个相似性极高的miR-369的靶位点。
(3)野生型重组质粒(WT)和突变型重组质粒(MT)构建成功,即野生型的AREs序列和靶位点突变的突变型AREs序列均按正确方向,成功地连接到了双荧光素酶报告基因质粒载体psiCHECKTM-2上。
(4)在对猪髋动脉内皮细胞(PIEC)进行转染时,只有当细胞生长融合度到90%,mimics (miRNA模拟物)与质粒载体共转染的最终浓度分别为50 nM和150 ng时,才能达到最优的转染效果。
(5)单转染的突变型重组质粒(MT)与野生型重组质粒(WT)相比,差异极显著,P0.01,即MT的荧光比值极显著高于WT的荧光比值,表明AREs影响mRNA的稳定性。由于MT比WT少了三个连续的AUUUA五聚体,说明AUUUA五聚体与mRNA稳定性密切相关,且推测mRNA的稳定性可能与AUUUA五聚体的连续性成正相关。即相同个数的AUUUA五聚体,连续性越好,其影响mRNA稳定性越强；连续性越小,其影响mRNA稳定性越弱。
(6) miRNA过表达时(C组,mimics+WT),其荧光比值极显著低于对照组(control, WT), P0.01,表明ssc-miR-369抑制了海肾荧光素酶的表达,即ssc-miR-369下调TNF-α基因的表达。
(7) miRNA抑制时(D组,inhibitor+WT),其荧光比值与对照组control相比,P0.05,差异不显著；与C组相比,P0.05,差异显著。进一步证实了miR-369对TNF-α靶基因的下调作用。
(8)在转录后水平调节mRNA的过程中,AREs与miRNA具有一些相似之处。但当共处时,它们的调节作用互不干扰,或者说影响很少,即使当miRNA的靶位点位于AREs区域中时也一样。
(9)本研究的成功表明了一种筛选动物功能基因的新的途径,能更好地把人类和小鼠等物种上的取得的一些研究成果借鉴到我们动物生产上来,同时本研究还可能为AREs (AU-rich elements)和miRNAs(微小RNA, microRNA)的基础研究提供了一些有用的参考数据。
【关键词】：
【学位授予单位】：四川农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2011【分类号】：S828【目录】：
摘要4-6Abstract6-111 文献综述11-27 1.1 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF)的研究进展11-16
1.1.1 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的来源及表达11
1.1.2 TNF-α的基因序列及其分子结构11-12
1.1.3 TNF-α受体(TNFR)的分类及表达12
1.1.4 TNF-α的生物学功能及其研究进展12-16 1.2 微小RNA(microRNA,miRNA)的研究进展16-22
1.2.1 miRNA的生物合成16-17
1.2.2 miRNA的特征17-18
1.2.3 miRNA的作用机制18-20
1.2.4 动物体miRNA与siRNA的区别20-21
1.2.5 miRNA的生物学意义及其研究进展21-22 1.3 miRNA靶基因的鉴定22-24
1.3.1 鉴定miRNA靶基因的方法22-23
1.3.2 双荧光素酶报告基因系统鉴定miRNA靶基因的原理及优势23-24 1.4 mRNA的降解途径24-26
1.4.1 mRNA的主要降解途径24-25
1.4.2 ARE调控mRNA稳定性的机制25
1.4.3 mRNA的其它降解途径及研究进展25-26 1.5 本实验研究的目的和意义26-272 材料和方法27-39 2.1 主要仪器设备27-28 2.2 实验所需试剂28-29 2.3 常用试剂的配制29 2.4 实验方法29-39
2.4.1 miRNA的预测29-30
2.4.2 目的片断序列的设计及PCR钓取30-31
2.4.3 琼脂凝胶回收31-32
2.4.4 双酶切PsiCHECKTM-2载体32-33
2.4.5 目的片断与载体连接33
2.4.6 连接产物的转化33-34
2.4.7 重组质粒的检测与抽提34-35
2.4.8 转染条件的优化35-37
2.4.9 共转染及双荧光素酶报告基因活性检测37-393 结果与分析39-47 3.1 miRNA的预测39-40
3.1.1 猪与其他哺乳动物标准序列的同源性比对39
3.1.2 miRNA靶位点序列的比对39-40 3.2 重组质粒测序结果与分析40-41 3.3 重组质粒载体的提取41-42 3.4 转染条件的优化42-44
3.4.1 Mimics转染条件的优化42-44
3.4.2 pEGFP-N3质粒转染条件的优化44 3.5 双荧光素酶报告基因活性检测44-474.讨论47-52 4.1 AREs负调控mRNA的表达47-48 4.2 ssc-miRNA-369负调控靶位点位于AREs上的TNF-a基因48-49 4.3 miRNAs与AREs的相关性研究49-525 结论52-536 参考文献53-61致谢61
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双荧光素酶报告基因问题 LUC REN
1个转录因子，1个启动子，想要研究转录因子对启动子的调控。
实验设计：
1、构建转录因子过表达载体，TF
2、构建启动子+LUC载体，p
3、单独的一个载体，REN海肾荧光素酶载体作为内参，ren
4、35sTF+p+ren& &&&35s空载+p+ren& & 3个载体共转化拟南芥原生质体，使用Promega试剂盒，单管测LUC，REN荧光，不是用的酶标仪。
结果：不同样品之间，海肾荧光素酶REN的值差别挺大，最小的500，最大的10000。空白对照（原生质体没有加质粒，后面步骤一样的），100左右，所以转化是成功了吧。
问题：理论上来说，不同样品之间的REN值应该差不多的啊，感觉操作也没啥问题，差异这么大，可能的原因有哪些？
谢谢！你的实验结果ren值不同样品差异大吗？一百倍的话，按照我的空白100计算的话，所有的结果都是不对的了:sweat:
因为海肾荧光素酶是作为对照，质粒加的少一些，所以这个值没有很高。
你好 请问你做这个实验的时候，用的是什么仪器呢&&多功能酶标仪和全波长酶标仪可以检测LUC的表达量嘛 因该用什么波段呢？
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