用质粒瞬转的胶质瘤细胞系系可以用来成瘤吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-05-15 05:26 标签： 淋巴瘤细胞系
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瞬时转染原理及实验步骤
哺乳动物细胞瞬时转染能在短期内快速表达高活性蛋白而被广泛应用。本文主要介绍了细胞瞬时转染的步骤、原理，及血球计数板对细胞计数的原理和方法。
哺乳动物细胞自身具有蛋白折叠和翻译后修饰的功能，获得的蛋白更具有天然活性。哺乳动物细胞生产蛋白的方式有两种：瞬时转染和稳定转染。瞬时转染的特点是短期快速表达，满足蛋白的小量制备。而稳定转染通过构建稳定细胞系能够满足蛋白的大量、长期生产。
瞬时转染是指将构建好的质粒通过某种方式导入到哺乳动物细胞内（主要指HEK293细胞），该质粒上的外源基因不整合到细胞自身的基因组上。随着细胞的生长分裂，外源基因会逐渐丢失。质粒在细胞内能够存在3-4天，此时间内，质粒外源基因在细胞内发生转录翻译，得到极为少量的蛋白。这一整个快速转染得到蛋白的过程就称为。
瞬时转染步骤
瞬时转染流程简图
细胞复苏是将保存在液氮或-80℃冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程。细胞复苏的关键是快速。防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。细胞复苏一般步骤如下：
预先加热水浴锅，温度至37-40℃，并在离心管中准备好10ml培养基
从液氮罐或冰箱中取出细胞，迅速放进预热的水浴锅中，镊子夹住冻存管晃动，使其受热均匀
当冻存管内完全融化时，注意用酒精擦拭冻存管消毒，将液体倒入含有10ml培养基的离心管中
离心5min，去除上清，得到沉淀
用培养基悬浮沉淀，并接种到培养瓶常规细胞培养
细胞复苏后，生长一段时间，95%的细胞贴壁生长，细胞状态良好，说明细胞复苏成功。
以Lipofectamine转染试剂为例的操作流程，不同转染试剂参考说明书
将复苏后常规培养的细胞按照1-3×105接种到6孔板中，加入2-4ml的完全培养基，混匀放置在二氧化碳培养箱中37℃过夜
无菌状态下配置如下溶液：
a溶液 用100ul的无血清培养基稀释2ug的待转染的质粒
b溶液 用100ul的无血清培养基稀释25ul的Lipofectamine转染试剂（血清的存在会影响效率，因此要使用无血清培养基转染）
将ab溶液混合并摇匀，室温下放置30min左右
细胞培养至80%单层左右，用无血清培养基洗涤细胞2次，每孔加入1ml的无血清培养基，并将混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向轻摇混匀，二氧化碳培养箱中37℃培养24小时
将转染液倒出，换为完全培养基继续培养，培养3-4天后检测蛋白表达量
收集培养的细胞，采用超声或酶解的方法破碎细胞，离心得到上清。转染后的检测主要包括基因水平和蛋白水平的检测。针对基因水平，使用普通PCR或RT-PCR进行验证。蛋白水平，使用western blot检测。
细胞计数的原理就是测定单位体积内细胞的数量从而得到细胞总浓度，在细胞培养和测定细胞生长曲线的过程中广泛应用。本实验是采用血球计数板对细胞计数，步骤如下：
将计数板的盖玻片洗净晾干，并消化细胞离心加入培养基悬浮细胞，制得细胞悬液
稀释细胞悬液，按照一定的倍数
盖玻片盖上计数板表面，移液器吸取10ul左右的细胞悬液从血球计数板的一方慢慢注入到计数板上
盖玻片具有引流的功能，因此只需轻轻打入到板上孔中即可
显微镜下观察细胞，按照要求计数该血球计数板上的细胞个数，计数方式如图所示
图3 血球计数室表面
每个血球计数板有上下两个计数室（如图1）
每个计数室分为九大格（如图3）
其中最中间的方格分为25个中格，每个中格又被分为16个小格，因此计数室中一共有400个小格。每次计数时选取图3中红色部分计数，计数结果乘以5得到一个计数室中总的细胞个数
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【目的】构建和鉴定针对人抑凋亡基因livin的siRNA质粒载体，并研究其对宫颈癌HeLa细胞的作用。【方法】设计和合成针对人livin基因的siRNA寡核苷酸，定向克隆入质粒载体pmU6，脂质体瞬时转染入HeLa细胞中，用RT—PCR技术检测livin基因的mRNA表达水平，WesternBlot技术检测Livin蛋白表达水平。用MTT法分析HeLa细胞增殖改变，流式细胞仪检测HeLa细胞周期变化。【结果】livinsiRNA表达质粒能高效而特异地剔除HeLa细胞中livin的表达，抑制肿瘤细胞增殖（P〈0．05），将HeLa细胞阻止在G1期。【结论】livin基因的siRNA对HeLa细胞增殖和细胞周期调控有重要影响，细胞凋亡可能是导致其细胞死亡的主要原因。细胞库/细胞培养
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【求助】请教大家一个关于报告基因质粒瞬时转染与报告基因表达的问题，问题比较长，谢谢
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来源：丁香园论坛
点击次数：606
想请教大家，在我研究的信号转导通路中，转录因子要形成二聚体转移到核内与调控序列结合启动后续目的基因的表达，报告基因质粒含转录因子调控序列和荧光素酶基因，我在想如果用瞬时转染的话，那么质粒只在细胞质之中，并未整合到核基因组中，转录因子又必须是要转入核内与调控序列结合启动荧光素酶表达的，那瞬时转染质粒的细胞能用于报告基因分析吗？
woxingwosu
用瞬时转染是可以用来做报告基因分析的，这类的例子不在少数。
质粒确实不会整合到基因组上，但是它表达出来的蛋白（也就是你的转录因子）是可以转运到核内的（只要你的蛋白含有入核序列NLS）就可用结合到调控序列并启动荧光素酶表达。
其实所有的转录因子不都是这样子的吗？它们在细胞质中形成成熟的蛋白之后才转到细胞核内行使起功能。所以说他们的原理是类似的。
蛋白和基因是有所区别的~~~
我还是没有明白，可能是我的问题没问清楚，我的报告基因质粒上含有转录因子对应的调控序列（并非转录因子基因）和荧光素酶报告基因，就算你说的质粒能表达出转录因子能入核与核内调控序列结合启动后续基因表达，可是核内并未整合有外源的荧光素酶基因，又怎么表达出荧光素酶呢？这部分的分子知识我很欠缺，也许我钻牛角尖了，可是我确实没弄明白，希望woxingwosu能不吝赐教，帮我搞清楚这个问题，非常谢谢！
我在想在瞬时转染报告基因分析中，是不是转录因子也可以与细胞质中的质粒上的调控序列作用调控荧光素酶基因表达出蛋白质，这样似乎说得过去一些，
woxingwosu
lsdcfhyj wrote:
我还是没有明白，可能是我的问题没问清楚，我的报告基因质粒上含有转录因子对应的调控序列（并非转录因子基因）和荧光素酶报告基因，就算你说的质粒能表达出转录因子能入核与核内调控序列结合启动后续基因表达，可是核内并未整合有外源的荧光素酶基因，又怎么表达出荧光素酶呢？这部分的分子知识我很欠缺，也许我钻牛角尖了，可是我确实没弄明白，希望woxingwosu能不吝赐教，帮我搞清楚这个问题，非常谢谢！
呵呵，那就继续讨论一下。你的意思是指你的报告基因质粒是指含有转录因子对应的基因的promoter，这个promoter后面跟着荧光素酶报告基因。其实这个也差不多的。
我认为你转染（瞬时转染）的报告基因质粒虽然不整合到染色体上，但是它是可以进入细胞核的。受到激活的转录因子转运到细胞核内，不仅能激活内源性的基因promoter，也同时会激活瞬时转染进去的这个质粒上的promoter，从而引起他连接的荧光素酶的表达。其实这种质粒的表达一般不会受到染色体的影响。不过由于没有整合到染色体上，所以这种质粒的表达一般只能维持几天的时间，随后会丢失或降解掉。
不知道有没有回答到你的问题？
哦，现在清楚了，我原来以为瞬时转染的质粒只能存在于细胞质中，如果它能进入细胞核，那么这就容易解释了，这几天一直纠结在这个问题上，谢谢您的回答了!看来您在这方面比较在行，我还想请教一个问题，就是在一种真核细胞中同时稳定转染两种报告基因质粒（双荧光素酶报告基因）建立稳定的细胞系的成功几率大吗，就我看的资料没人这样做，一般都是用的瞬时转染？
woxingwosu
一种基因的稳定表达细胞做过，但是没有尝试过同时稳定转染两种报告基因质粒建立的细胞系，难度相当的大，我不是很乐观。
我也是觉得难度很大，很谢谢您能这么耐心回答我的问题。
这个问题很有意义啊，我也有收获，谢谢上面两位了
liuzhen200893
透射电镜观察细胞自噬， 交流扣扣
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wudihero007
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