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在基因工程中用来修饰改造生物基因的工具是（&&&）A．限制酶和连接酶B．限制酶和水解酶C．限制酶和运载体D．连接酶和运载体
解析试题分析：限制酶是切割基因的剪刀，而DNA连接酶是将DNA分子进行拼接的针线。考点：本题考查基因工程中的工具酶点评：基础题，学生熟悉基因工程相关的工具酶即可轻松作答。扫二维码下载作业帮
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生物选修3：基因工程”载体”和”运载体”是一回事吗?我在做题时见农杆菌转化法和动物病毒诱导法,都是用质粒作为载体,那么农杆菌和动物病毒算是什么?
蛇蝎美人°671Z
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基因工程的三大工具之一：载体，不包括农杆菌。
农杆菌转换法是一种技术，是一种细菌
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是一回事。也是质粒
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高中生物选修3：专题1 基因工程 1.1 DNA重组技术的基本工具
上传: 胡剑 &&&&更新时间： 9:22:29
DNA重组技术的基本工具
【本节重难点】
重点：DNA重组技术所需的三种基本工具的作用
难点：基因工程载体所需要具备的条件
【知识精讲】
知识点一& 基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。
注意：对本概念应从以下几个方面理解：
DNA分子水平
剪切&拼接&导入&表达
人类需要的基因产物
知识点二& 基因工程的基本工具
1.限制性核酸内切酶&&&分子手术刀&
（1）限制性内切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。
（2）限制性内切酶的功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。
（3）限制性内切酶的切割方式：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。
注意：比较有关的DNA酶
（1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基&
（2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。&&
（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。&
（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。
2.DNA连接酶&&&分子缝合针&
（1）DNA连接酶的分类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
（2）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。
3.基因进入受体细胞的载体&&&分子运输车&
（1）分子运载车的分类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。
（2）运载体使用的目的：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
（3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制& ②有多个限制性内切酶切点& ③有一定的标志基因，便于筛选。
思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──&分子手术刀&，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分内容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的内容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的&。这样就对&限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来&的认识提高了一个层次。
DNA连接酶──DNA片段的&分子缝合针&，在这里同学们很容易想到碱基互补配对或DNA聚合酶，这是很自然的。但只考虑到碱基互补配对原则还是不够的，我们可以从原有的知识出发，要想到限制酶切开的DNA中膦酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键，这个地方还没有连接起来，又是怎样连接的呢？这样自然而然地想到DNA连接酶。
基因进入受体细胞的载体──&分子运输车&的学习内容，不能仅仅着眼于记住这几个条件，而应该深入思考每一个条件的内涵，通过深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件才能充当载体。
拓展点一& 限制酶所识别序列的特点
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如： 以中心线为轴，两侧碱基互补对称； 以 为轴，两侧碱基互补对称。
拓展点二& DNA连接酶连接的是什么部位？
DNA连接酶是将一段DNA片段3&端的羟基与另一DNA片段5&端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键，而不是连接互补碱基之间的氢键。
【典题分类精析】
考点一、基因工程的概念
例1．（2005高考广东）以下有关基因工程的叙述，正确的是&& （&&& ）
A、基因工程是细胞水平上的生物工程&&& B、基因工程的产物对人类都是有益的
C、基因工程产生的变异属于人工诱变&&& D、基因工程育种的优点之一是目的性强
分析：本题考查的知识点是基因工程的概念。解答本题的关键是理解基因工程的概念。基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工&剪切&和&拼接&，对生物的基因进行改造(目的性强)和重新组合(基因重组)，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物.但并不是所有的基因产物对人类都有益的。所以选D。
答案：D&&&
点评：正确理解基因工程的概念是解题的关键。&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
考点二、基因工程的基本工具
例2.下列关于限制酶的说法不正确的是
A．限制酶广泛存在于各种生物中，微生物中很少分布
B．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
C．不同的限制酶切割DNA的切点不同
D．限制酶的作用是用来提取目的基因
分析：此题主要考察限制酶的有关知识。解答本题的关键是理解限制酶的来源和限制酶的特点。限制酶主要是从原核生物中分离出来的，并不是广泛存在于各种生物中；一种限制酶能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA分子经限制酶切割形成黏性末端和平末端两种。
点评：考察有关限制酶的题目，主要是考察限制酶的特点，这一点一定要牢记。
例3．在基因工程中用来完成基因的剪接的工具是&&&
A．限制酶和连接酶&&& B．限制酶和水解酶
C．限制酶和运载体&&& D连接酶和运载体
分析：本题考查限制酶和连接酶的有关知识。解答本题的关键是&剪接&二字，是既剪又接。限制性内切酶(即限制酶)是剪切基因的&剪刀&，DNA连接酶是将DNA末端之间的缝隙&缝合&起来的&基因的针线&。所以，剪接工具是限制酶和连接酶。
点评：本题注意审题，剪接是既剪又接，需要限制酶和连接酶。
例4．有关基因工程的叙述正确的是
A．限制酶只在获取目的基因时才用&&&&&&&& B．重组质粒的形成是在细胞内完成的
C．质粒都可以作为运载体
D．蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基因提供线索
分析：本题综合考察了基因工程中所用到的工具。在基因工程中，不仅要用限制酶切割目的基因，还要用同一种限制酶在质粒上切割出一个切口，使目的基因与质粒切口的黏性末端能进行碱基互补配对，所以A错；重组质粒是在细胞外进行的，所以B错；并不是所有的质粒都可作运载体，在科学研究中，人们通常只是用大肠杆菌的质粒(其上有抗药基因)作运载体，所以C错；在人工合成目的基因的方法中，有一种方法是根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，最后通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。所以D项正确。
点评：解答本题时要综合考虑基因工程的基本工具的特点、条件、适用范围。
例5．下列哪项通常不被用作基因工程的运载体
A．细菌质粒&&& &&B．噬菌体
C．动植物病毒&&& D．细菌核区的DNA
分析：本题考察基因工程中的工具&&运载体。解答本题的关键是记住、理解运载体必须具备的条件和课本上讲的常用运载体。作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制& ②有多个限制性内切酶切点& ③有一定的标志基因，便于筛选。记住常用的运载体有：质粒、噬菌体、动植物病毒等。细菌的核区由一个大型的环状DNA分子反复折叠缠绕而成，控制着细菌的主要性状，所以一般不被用作基因工程的运载体。
点评：牢记作为运载体必须具备的3个条件是解答本题的关键。
考点三、限制酶所识别序列的特点
例6．［2005天津］（1）限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是&G&GATCC&，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是&&GATC&。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。
①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后形成的黏性未端。___________________________
②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后形成的黏性未端。_____________________
③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性未端能否连接起来？为什么？________________________________________________________
分析：本题主要考察黏性末端的知识。解答本题的关键是理解限制酶的特点。在切割目的基因和运载体时，一定要使用同一种限制性内切酶，这样，切出的切口才一样，才能进行碱基互补配对连接起来。两个黏性末端只要一样就可以进行碱基互补配对，再通过DNA连接酶连接起来。
答案：（1）
&③可以连接。因为由两种限制性内切酶切割后所形成的黏性末端是相同的（或&是可以互补的&）。
点评：限制酶所识别的是特定的碱基序列，并在特定部位进行切割，限制酶不同，所识别的碱基序列不同，黏性末端不同。但不同的粘性末端有时是可以进行拼接的，如：黏性末端 。两者不要混淆。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
【针对性练习】
1．实施基因工程第一步的一种方法是把所需的基因从供体细胞内分离出来，这要利用限制性内切酶。一种限制性内切酶能识别DNA子中的GAATTC顺序，切点在G和A之间，这是应用了酶的
A．酶的高效性 　B．酶的专一性&& C．酶的多样性 &&&D．酶的催化活性受外界条件影响
2．以下说法正确的是
A．所有的限制酶只能识别同一种特定的核苷酸序列
B．质粒是基因工程中惟一的运载体
C．运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接
D．基因治疗主要是对有缺陷的细胞进行修复
3.下列黏性末端属于同一种限制性内切酶切割的是（&&&& ）&&&
A．①②&&&&&&&&&&&&&& B．①③&&&&&&&&&& C．②④&&&&&&&&&& D．③④
4.下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&
A．①②&&&& &&&&&&&&& B．②③&&&& &&&& C．③④&&&& &&&&&& D．②④
5．依右图有关基因工程的工具酶功能的叙述，不正确的是
A．切断a处的酶为限制核酸性内切酶&&&&&&
B．连接a处的酶为DNA连接酶
C．切断b处的酶为解旋酶&&&&&&&&&&&&&&&&
D．切断b处的为限制性内切酶
6．不属于质粒被选为基因运载体的理由是
　A．能复制 　　　　&&&&&&&&&& B．有多个限制酶切点
　C．具有标记基因 　&&&&&&&&&& D．它是环状DNA
7.基因工程技术也称为DNA重组技术，其实施必须具备的四个必要条件是
A.目的基因&&& 限制性内切酶&& 运载体&&&&&&&&& 体细胞&&
B.重组DNA&&& RNA聚合酶&&&&& 限制性内切酶&&& 连接酶
C.工具酶&&&& 目的基因&&&&&&& 运载体&&&&&&&&& 受体细胞
D.模板DNA&&& 信使RNA&&&&&&& 质粒&&&&&&&&&&& 受体细胞
8．下列关于各种酶作用的叙述，不正确的是&&&&&&&&&&&&&&&&&&
A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接
B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录
C．一种DNA限制酶能识别多种核苷酸序列，切割出多种目的基因
D．胰蛋白酶能作用于离体的动物组织，使其分散成单个细胞
9.下列关于限制酶的说法不正确的是
A.限制酶广泛存在于各种生物中，尤其在微生物细胞中分布最多
B.不同的限制酶识别不同的核苷酸序列
C.限制酶能识别不同的核苷酸序列，体现了酶的专一性
D.限制酶的作用只是用来提取目的基因
10．有关基因工程的叙述中，不正确的是&&& &
A.DNA连接酶将黏性未端的碱基对连接起来　& B.限制性内切酶可用于目的基因的获得&&
C.目的基因须由运载体导入受体细胞　　　&&& D.人工合成目的基因不用限制性内切酶
11．下图所示限制酶切割基因分子的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列和切点是
A．CTTAAG，切点在C和T之间&& B．CTTAAG，切点在G和A之间
C．GAATTC，切点在G和A之间&& D．GAATTC，切点在C和T之间 &
12.下列关于质粒的叙述，正确的是　　　　　　　　　　（　　）
A、质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B、质粒是细菌细胞质中能够自主复制的小型环状DNA分子
C、质粒只有在导入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制
D、细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的
13．科学家常选用的细菌质粒往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是
A．提高受体细胞在自然环境中的耐热性& B．有利于检测目的基因否导入受体细胞
C．增加质粒分子的相对分子质量&&&&&&& D．便于与外源基因连接
14．下图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤，这一步需用到的工具是
A．DNA连接酶和解旋酶&&&&&&&&&&&&&&&& B．DNA聚合酶和限制性核酸内切酶
C．限制性核酸内切酶和DNA连接酶&&&&& D．DNA聚合酶和RNA聚合酶
15．限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸碱基序列。下图为四种限制酶BamHI，EcoRI，HindⅢ以及BglⅡ的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列为何？
A. BamHI和EcoRI；末端互补序列&AATT&
B. BamHI和HindⅢ；末端互补序列&GATC&
C. EcoRI和HindⅢ；末端互补序列&AATT&
D. BamHI和BglII；末端互补序列&GATC&
16．在DNA 测序工作中，需要将某些限制性内切核酸酶的限制位点在 DNA上定位，使其成为 DNA 分子中的物理参照点。这项工作叫做&限制酶图谱的构建&。假设有以下一项实验：用限制酶 HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个 4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。
据此分析，这两种限制性内切核酸酶在该DNA 分子上的限制位点数目是以下哪一组？
A．HindⅢ1个，BamHⅠ2 个&&&&&&& B．HindⅢ2个，BamHⅠ3个
C．HindⅢ2个，BamHⅠ1 个&&&&&&& D．HindⅢ和BamHⅠ各有2 个
17.两个核酸片段在适宜的条件下，经X酶的作用，发生下述变化，则X酶是
A.连接酶&& B.RNA聚合酶&&&&& C.DNA聚合酶&&& D.限制酶
18．基因工程中涉及多种工具酶：
（1）限制性内切酶是一类能识别特定核苷酸序列并在特定位点切割双链DNA的&基因剪刀&。被限制酶识别的序列往往正反读顺序相同，断裂的位置交错，但又是围绕着一个轴线（对称轴）对称排列，如下左图。PstI和EcoRI都是限制酶。请补全下右图中的互补链，画出对称轴以及切割后的产物。
&& &&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
（2）DNA连接酶是基因操作的&针线&，其作用是把基于&&&&&&&&&&&&&&& 能力而粘贴在一起但存在的切口封闭，进而才可能形成有意义的&&&&&&&&&&&&&&&&& &。
（3）逆转录酶也常被用于基因工程，其存在于&&&&&&&& （生物）中，催化以&&&&&& &为模板合成DNA的过程。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
19.利用基因工程生产蛋白质药物，经历了三个发展阶段。第一阶段，将人的基因转入细菌细胞；第二阶段，将人的基因转入小鼠等动物的细胞。前两个阶段都是进行细胞培养，提取药物。第三阶段，将人的基因转入活的动物体，饲养这些动物，从乳汁或尿液中提取药物。
（1）将人的基因转入异种生物的细胞或个体内，能够产生药物蛋白的原理是基因能控制　　　　　　　　　　　　。
（2）人的基因能和异种生物的基因拼接在一起，是因为它们的分子都具有双螺旋结构，都是由四种____________构成，基因中碱基配对的规律都是　　　　　__________。
（3）人的基因在异种生物细胞中表达成蛋白质时，需要经过　　　和翻译两个步骤。在翻译中需要的模板是　　　　　，原料是氨基酸，直接能源是ATP，搬运工兼装配工是　　　　　　，将氨基酸的肽键连接成蛋白质的场所是________，&翻译&可理解为将由____个&字母&组成的核酸&语言&翻译成由　　　　个&字母&组成的蛋白质&语言&，从整体来看　　　　　　在翻译中充任着&译员&。
（4）利用转基因牛、羊乳汁提取药物工艺简单，甚至可直接饮用治病。如果将药物蛋白基因移到动物如牛、羊的膀胱上皮细胞中，利用转基因牛羊尿液生产提取药物比乳汁提取药物的更大优越性在于：处于不同发育时期的　　　　　动物都可生产药物。
20.在某一特定的植物基因工程中，用土壤农杆菌中的Ti质粒作为运载体。把目的基因重组入Ti质粒上的T-DNA片段中，再将重组的T-DNA插入植物细胞的染色体DNA中。
(1)科学家在进行上述基因操作时，要用同一种&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&分别切割质粒和目的基因，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就可通过&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 而黏合。
(2)将携带抗除草剂基因的重组Ti质粒导入二倍体油菜细胞，经培养、筛选获得一株有抗除草剂特性的转基因植株。经分析，该植株含有一个携带目的基因的T-DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论上，在该转基因植株自交F1代中，仍具有抗除草剂特性的植株占总数的&&&&&&& ，
(3)种植上述转基因油菜，它所携带的目的基因可以通过花粉传递给近缘物种，造成&基因污染&。如果把目的基因导入叶绿体DNA中，就可以避免&基因污染&，原因是&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &。
【课后答案点拨】
思考与探究（P7）
1. 不能。连接如下：
&2和7能连接形成：&ACGT&
&&&&&&&&&&& &&&&&&&&TGCA&；
4和8能连接形成：&GAATTC&
&&&&&&&&&&&&&&&&&& &CTTAAG&；
3和6能连接形成：&GCGC&
&&&&&&&&&&&& &&&&&&&CGCG&；
1和5能连接形成：&CTGCAG&
&&&&&&&&&&&& &&&&&&&GACGTC&。
解析：限制酶具有特异性，一种限制酶只能识别特定的碱基序列，并在特定的部位切开。
2.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？
解析：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵（本题不要求学生回答的完全，教师可参考教师用书中的提示，根据学生的具体情况，给予指导。上述原则也应适用于其他章节中有关问题的回答。）。
3.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？
解析：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。
（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。
（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。
（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。
（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
4.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
解析：迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。
P4寻根问底：
根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
解析：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
寻根问底（P6）：
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E.coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？
（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3&末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。
此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。
模拟制作讨论题（P6）：
1. 你模拟插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
提示：不能。因为一般基因有上千个碱基对。
2. 如果你操作失误，碱基不能配对。可能是什么原因造成的？
解析：可能是剪切位点或连接位点选得不对（也可能是其他原因）。
P6旁栏思考题：
想一想，具备什么条件才能充当&分子运输车&？
解析：能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点及对受体细胞无害等。
【拓展阅读】
1.磷酸二酯键
磷酸二酯键全称为3&,5&－磷酸二酯键，是核酸中核苷酸的连接方式，组成了核酸的一级结构。在核酸中一个核苷酸核糖上第3位的羟基与下一个核苷酸核糖上第5位的磷酸羟基脱水缩合成酯键，该酯键称3&,5&－磷酸二酯键。若干个核苷酸间以3&,5&－磷酸二酯键连接成的多核苷酸链为核酸。在链的一端的一个核苷酸核糖上第5位连接的磷酸只有一个酯键，称此核苷酸为DNA链的5&磷酸末端或5&端。另一端核苷酸上第3位的羟基是自由的，所以此核苷酸称为3&羟基末端或3&端。链内的核苷酸第5位上的磷酸已形成二酯键，第3位上的羟基也已参与二酯键的形成，故称核苷酸残基。
2. 影响限制性内切酶活性的因素
（1）DNA纯度
在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。
（2）核酸内切限制酶的缓冲液
核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。
使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液。
不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同，这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液，在进行双酶解或多酶解时，若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好，则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同，可采用以下三种方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA，然后补足适量的NaCl，再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；
先用一种酶进行酶解，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。
（3）酶切消化反应的温度
DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37℃，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。
（4）DNA的分子结构
DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响，如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍。
有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异。
限制性内切酶反应的终止 通常是采用65℃条件下温浴5min；
加终止反应液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10 mol/L）螯合Mg2 ，以终止反应。
【五年高考回放】
1．［2006四川高考］用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是(&& )　　　
A．常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒
B．DNA连接酶和DNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶
C．可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒
D．导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达
解析：构建重组质粒必需的工具酶是限制性内切酶和DNA连接酶，其作用部位是磷酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键，而DNA聚合酶的作用是在DNA复制过程中用于连接碱基间的氢键，故B选项错误。
2．［2006江苏高考］我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是&& (&&& )
A．基因非编码区对于抗虫基因在棉花细胞中的表达不可缺少
B．重组DNA分子中增加一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失
C．抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘作物，从而造成基因污染
D．转基因棉花是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的
解析：基因具有特异性，一种基因只能控制一种性状的表达。抗虫基因能表达出致毒蛋白，导致害虫因食用抗虫棉后死亡，而不能产生对抗生素的抗性。因此，转基因棉花是否具有抗虫特性是不能通过检测棉花抗生素的抗性对来确定的。
3．[2005江苏高考]在植物基因工程中，用土壤农杆菌中的Ti质粒作为运载体．把目的基因重组入Ti质粒上的T-DNA片段中，再将重组的T-DNA插入植物细胞的染色体DNA中。
(1)科学家在进行上述基因操作时，要用同一种&&& &&&&&&&&分别切割质粒和目的基因，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就可通过&&&&&&& 而黏合。
(2)将携带抗除草剂基因的重组Ti质粒导入二倍体油菜细胞，经培养、筛选获得一株有抗除草剂特性的转基因植株。经分析，该植株含有一个携带目的基因的T-DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论上，在该转基因植株自交F1代中，仍具有抗除草剂特性的植株占总数的&&&&&&&&&&& ，原因是&&&&&&&&&&&& 。
(3)种植上述转基因油菜，它所携带的目的基因可以通过花粉传递给近缘物种，造成&基因污染&。如果把目的基因导人叶绿体DNA中，就可以避免&基因污染&，原因是&&&&&&&&&&&&&&&& 。
答案：(1)限制性内切酶&&& 碱基互补配对
(2)3／4&&& 雌雄配子各有1／2含抗除草剂基因；受精时，雌雄配于随机结合
(3)叶绿体遗传表现为母系遗传，目的基因不会通过花粉传递丽在下一代中显现出来
解析：1）在切割质粒和目的基因时，要用同一种限制性内切酶，使其产生相同的黏性末端，然后加入适量的DNA连接酶，质粒的黏性末端与目的基因的黏性末端就会通过碱基互补配对而结合，形成一个重组DNA分子。
（2）既然该植株可以看作是杂合子，我们假设该杂合子的基因类型为Aa，其中A为抗除草剂基因，a为不抗除草剂基因，则Aa自交后&1AA：2 Aa：1aa，故具有抗除草剂的植株占总数的3/4。
（3）叶绿体DNA为细胞质基因，故把目的基因导入叶绿体后，给基因的遗传方式就属于细胞质遗传，其特点为母系遗传，且后代一般不出现一定的分离比。因此，目的基因就不会因为有性生殖而导致花粉把此性状传递给近缘物种，从而避免了基因污染。
4．［2003上海高考］&人类基因组计划&中的基因测序工作是指测定&& （&& ）
A．DNA的碱基对排列顺序&&&&&&&&&&&&&&&&& B．mRNA的碱基排列顺序
C．蛋白质的氨基酸排列顺序&&&&&&&&&&&&&& D．DNA的基因排列顺序
解析：&人类基因组计划&就是分析测定人类基因组的核苷酸序列，而基因是有遗传效应的DNA片段，所以&人类基因组计划&中的基因测序工作就是测定DNA（基因）的碱基对排列顺序。本题答案为A。
5．［2003上海高考］下列关于基因工程的叙述，正确的是（&& ）&&&&&&&&&&&&&
A．基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因
B．细菌质粒是基因工程常用的运载体
C．通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理运载体DNA
D．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体
解析：在基因工程操作过程中，需要用同一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA和运载体DNA；细菌质粒是基因工程常用的运载体，目的基因导入的受体细胞有多种，不仅仅是受精卵。
6.［2002上海高考］下列高科技成果中，根据基因重组原理进行的是（&& ）
①我国科学家袁隆平利用杂交技术培育出超级水稻 ②我国科学家将素云金杆菌的某些基因移植到棉花体内③我国科学家通过返回式卫星搭载种子培育出太空椒④我国科学家通过体细胞克隆技术培养出克隆牛
A、①&&&& B、①②&&& C、②②③&&&& D、②③④
解析：培育太空椒利用的原理是基因突变，体细胞克隆技术培养出克隆牛是利用了细胞的全能性。超级水稻的培育和抗虫棉的培育根据的原理是基因重组。
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