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霉菌毒素对水产养殖的影响及其防控措施
出处：中大水生通讯
作者：李杰
中国水产养殖网
近年来，随着鱼粉和鱼油价格不断上涨，植物性蛋白源在水产饲料中的使用越来越广泛。即使是肉食性鱼类的配合饲料，植物性原料也能占到50%~70%的比例。然而，随着植物性原料的广泛使用，霉菌毒素对饲料原料及其成品的污染问题也日益突出。1.霉菌毒素污染现状霉菌毒素是产毒真菌在谷物或者饲料上生长繁殖产生的一系列种类繁多的有毒代谢产物（NRC,&nbsp1993）。这些产毒真菌能够在谷物的生长、收获过程中生长，或是在饲料的储存、运输和加工过程中生长，因而会在这些过程中对谷物或者饲料造成霉菌毒素污染。据估计，全球每年约有25%甚至更多的农作物受到了霉菌毒素的污染(CAST,&nbsp2003)。杜妮（2014）对月期间来自全国13个省份的816份饲料及原料样品进行了检测，结果表明，97.67%的受检样品已经受到了霉菌毒素的污染，且高达88.60%的饲料及原料受到2种或2种以上霉菌毒素的污染，多种霉菌毒素共存的现象很普遍。在水产饲料制备的过程中，最常见的产毒真菌生物包括曲霉菌属、青霉菌属和镰刀霉菌属。而在鱼类营养中关注较多的毒素是黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马菌素B1、单端孢霉烯毒素，特别是脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）、T-2毒素和玉米赤霉烯酮。Santacroce等（2008）调查表明，花生、干椰子肉、棕榈仁、棉粕、玉米及其相应产品是动物饲料中的黄曲霉毒素污染的主要来源。百奥明(张丞等，2008)、奥迈生物科技(季海霞等，2015)、建明工业（黄广明，2015）等生物公司，对全国各地的霉菌毒素污染情况进行了调查，研究表明玉米及其副产品和DDGS（国产）类原料的霉菌毒素污染一直比较严重，且以玉米赤霉烯酮和呕吐毒素含量较高。程传民等（2014）对2013年小麦类饲料原料中霉菌毒素污染情况的调查表明，呕吐毒素对其污染较严重，且小麦副产品受到的污染程度远高于小麦。在水产商品料中，检出频率最高的是呕吐毒素(王金勇等，2012)。此外，调查显示，霉菌毒素污染的一个显著特点就是多种霉菌毒素共同存在。一种霉菌可以产生多种霉菌毒素，而多种霉菌也可以产生同种霉菌毒素，如曲霉菌和青霉菌均能产生赭曲霉毒素和环匹阿尼酸(Varga等,&nbsp2001)。同时，用含有不同霉菌毒素的饲料原料制成配合饲料时，会产生交叉污染，如谷物和豆粕的混合增加了黄曲霉毒素和镰刀菌毒素共存的机会(Smith,&nbsp2001)。多种饲料原料制成配合饲料大大增加了配合饲料受多种霉菌毒素污染的机会。此外，霉菌毒素之间能够产生相互作用，而霉菌毒素间的协同作用对动物的危害比任何一种霉菌毒素单独作用的危害都要大(Swamy,&nbsp2003)。总的来说，霉菌毒素污染已成为阻碍饲料业和水产养殖业发展的一大障碍。由于不同水产动物对霉菌毒素的耐受存在很大差异，因而水产饲料中各种不同的霉菌毒素也都具有一定的防控价值，其重要性和紧迫性应当引起我们的高度重视。2.霉菌毒素对水产动物的危害目前，关于霉菌毒素对鱼类影响的研究较少且不系统。对于动物，霉菌毒素中毒的症状包括摄食量下降，消化系统紊乱，影响内分泌、免疫和神经系统，诱发各器官癌变甚至死亡（Santacroce等,&nbsp2008）。种内和种间动物对霉菌毒素的敏感性差异很大，而且动物的生长阶段、营养、健康状况和环境条件也会影响动物对霉菌毒素的敏感性。黄曲霉毒素由曲霉菌真菌产生，按其化学结构可分为B1、B2、G1和G2（Cotty等,&nbsp1994），其中，以黄曲霉毒素B1的毒性最强。黄曲霉毒素具有致癌、致畸、致突变的作用，其作用的靶器官主要是在肝脏。早在40多年前，就有报道黄曲霉毒素B1对虹鳟是剧毒的。当虹鳟被饲喂极低浓度（0.4~20&nbspμg/kg）的黄曲霉毒素B1时，就能观察到虹鳟的肝癌和死亡(Halver等,&nbsp1969)。当浓度高于80&nbspμg/kg时，会引起急性中毒反应，包括肝坏死、水肿和出血(Roberts,&nbsp2002)。与其他鲑科鱼类和诸如斑点叉尾t、罗非鱼等暖水性鱼类相比，虹鳟对黄曲霉毒素B1更为敏感(Manning,&nbsp2001)。赭曲霉毒素A&nbsp(OTA)，由曲霉菌和青霉菌产生，被认为是世界上第二大霉菌毒素。其作用的主要机制可能是通过抑制苯丙氨酸tRNA的合成、线粒体ATP的产生以及诱导氧化应激来干扰细胞功能。动物研究表明，OTA是一种肾毒素和肝毒素、免疫抑制剂、强有力的致畸原和致癌物(EI-Syed等,&nbsp2009)。关于OTA在鱼和虾上的毒理学效应的研究很少。在给虹鳟腹腔注射急性中毒剂量后，会导致死亡率、变性率、肾脏和肝脏坏死的概率增加(Doter等,&nbsp1973)。相同的，在给斑点叉尾t饲喂有OTA污染的饲料（2和4&nbspmg/kg）后，观测到增重和饲料效率的降低，肝脏和肾脏的病理性损伤，死亡率的增加(Manning等,&nbsp2005)。海鲈也表现出了对OTA的敏感性，据估计，其急性致死剂量为285μg/kg体重(EI-Sayed等,2009)。伏马菌素至少由28种不同的化合物组成，可分为A、B、C三组。这些化合物中，B组的毒性最强。伏马菌素B1是被研究得最广泛和最彻底的(Sulyok等,&nbsp2007)。其主要作用机制是干扰鞘脂类的代谢。而鞘脂类是细胞壁的组成部分，对细胞的存活、分化、抗逆性和凋亡有重要作用(Hannun等,&nbsp2002)。用含有20~720mg/kg伏马菌素B1的饲料饲喂斑点叉尾t幼鱼后，观测到了摄食量和饲料利用率的降低、抗体产生的受损、肝损伤和血液学指标的变化(Yildirim等,&nbsp2000)。在最低含量下，只观测到了对摄食量的影响，而在最高含量下还观测到了高死亡率。尼罗罗非鱼对伏马菌素B1与斑点叉尾t一样敏感(Tuan等,&nbsp2003)，而鲤鱼的反应则更为严重，还表现出了大脑中的神经中毒和退行性改变。单端孢霉烯毒素是一大类主要由镰刀菌属真菌产生的化学相关的真菌毒素。根据其化学特性，它们通常被分为A、B、C、D四种。其中被研究较多的是T-2毒素、呕吐毒素（DON）和双乙酸基草镰刀菌醇（DAS）。单端孢霉烯毒素是强大的蛋白质合成抑制剂，作用于60s核糖体亚单位(Rocha等,2005)。它们能影响细胞分裂，抑制线粒体功能，诱导细胞凋亡。它们能很容易地通过机体的屏障，如皮肤、肺和肠道的黏膜，而且不需要激活就能发挥有害的作用。细胞更新速度较高的组织对单端孢霉烯毒素更为敏感。单端孢霉烯毒素的毒性对动物的影响包括生长阻滞，卵巢功能的降低和生殖障碍，免疫应答的改变，厌食和呕吐(Rocha等,&nbsp2005)。Manning等（2003）发现斑点叉尾t在摄入T-2毒素水平为1.3~5.0&nbspmg/kg的饲料后，其胃、头肾和体肾会发生病变。当T-2毒素水平为1和2&nbspmg/kg时，斑点叉尾t对爱德华氏菌的抵抗力也会下降(Manning等,&nbsp2005)。此外，当用T-2毒素水平为15&nbspmg/kg的饲料饲喂虹鳟时，观测到了生长的降低，水肿，肠道和血液学指标的改变(Poston等,&nbsp1982)。Woodward等（1983）报道称，通过人工感染玉米，使饲料DON的含量为1.0~12.9&nbspmg/kg时，能引起虹鳟幼鱼的肝增重、摄食量和饲料效率的逐步降低。近来，Hooft&nbsp(2010)报道称，通过自然感染的玉米，实际饲料的DON含量为0.3~2.6&nbspmg/kg，会导致虹鳟幼鱼（24g）生长和营养利用的显著下降。当用DON含量为0.3（对照）~2.0mg/kg的饲料饲喂鱼时，其影响仅仅是摄食量的下降，并没有发现粗蛋白和总能的表观消化率系数上的不同。然而，当用DON含量为1.4和2.6&nbspmg/kg的饲料饲喂虹鳟幼鱼时，发现了肝脏的组织学病变（Hooft,&nbsp2010）。不同种类的鱼对DON的敏感性不同，这可能是由于不同种类鱼的肠道菌群将DON转换为其低毒性的代谢产物的能力不同。玉米赤霉烯酮，由几种镰刀菌属的真菌产生。由于其结构与雌激素具有相似性，能与雌激素受体结合表现出弱雌激素活性，因此具有雌激素作用，能扰乱许多动物的繁殖。它广泛存在于谷物中。腹腔内注射玉米赤霉烯酮，会导致虹鳟卵黄蛋白原和放射带蛋白质的产生（Celius等,&nbsp2000），影响鲤鱼精子的数量和质量（Sandor等,&nbsp1990）。尽管关于霉菌毒素对鱼类影响的知识是有限的，但显而易见的是，在鱼饲料中使用霉菌毒素污染过的饲料原料会严重影响养殖鱼类的健康，之后则可能会造成巨大的经济损失。而且，在陆生动物的生产中，饲料中如果有霉菌毒素存在，霉菌毒素可能会部分转移到肉、奶和蛋中（Goyarts,&nbsp2007），水产养殖中可能也存在同样的问题。因此，为消除霉菌毒素所带来的危害，对霉菌毒素进行有效的检测和防控非常重要。3.霉菌毒素的检测方法目前，检测霉菌毒素的方法有很多。根据其可行性，以及生产中不同的需求，我们将这些方法分为定性和定量两大类。定性方法一般是为了简便快速地获得一个初步的结果，可检出限制水平下的霉菌毒素，常作为筛选方法使用。目前使用比较普遍的是酶联免疫法(ELISA)。此法操作简便、成本较低，可在短时间内完成大量样品的分析，具有广阔的应用前景，且多种霉菌毒素的ELISA检测试剂盒已经商业化。定量方法通常用于霉菌毒素的进一步准确定量，包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和薄层色谱扫描法（TLC）等。其中，谷物中大多数霉菌毒素，如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素和玉米赤霉烯酮等，均是采用HPLC。且HPLC结合荧光或紫外检测器法，具有准确度和灵敏度高、检测限低、自动化程度高等优点，已经在国际上得到了广泛的使用。但对于单端孢霉烯毒素而言，GC检测则具有更高的灵敏度。尽管霉菌毒素的检测技术已经有了很大的发展，但由于饲料及其原料生产、加工、运输和贮藏条件的复杂多变，其检测仍存在较大的困难。我们应建立科学合理的霉菌毒素监测体系，找到各个环节的关键控制点，使饲料霉菌毒素的检测和防范科学化、系统化和规范化。4.霉菌毒素的防控措施霉菌毒素的可行性控制措施可分为两个阶段，即防霉（阻止霉菌的生长和霉菌毒素的产生）和脱毒（去除饲料中已经存在的霉菌毒素）。防霉即是要从源头抓起，包括培育防虫、防倒伏和防霉的作物品种，在饲料贮存过程中控制温度及湿度，以及通过添加防霉剂来防止霉菌的生长。研究表明，霉菌大多数属于中温型微生物，最适生长温度一般在20~30℃。例如，镰刀属真菌的最适生长温度为20℃，青霉菌属真菌为25℃，曲霉菌属真菌为30℃。水分是决定饲料中霉菌生长的另一重要因素。当饲料中水分含量超过15%时可导致饲料霉菌的大量生长繁殖，当水分含量达到17%~18%时为真菌繁殖产毒的最适条件。因此，饲料应贮存于阴凉、干燥、通风、清洁的环境下，并尽可能的缩短贮存时间以减少霉菌的生长机率。此外，在饲料生产中，添加防霉剂可有效地抑制霉菌生长，延长饲料的保质期。防霉剂种类包括丙酸及其盐类、双乙酸钠（SDA）以及诸如苯甲酸、山梨酸等有机酸。目前市场上使用的防霉剂主要为前两种或多种防霉剂组成的复合型防霉剂。如果作物在生长或存储过程中感染了霉菌，它的代谢产物，即霉菌毒素会一直存在于作物乃至饲料中，此时再添加防霉剂也无济于事。此时，需要采用物理清除、霉菌抑制、化学降解和使用吸附剂等措施来消除原料及饲料中霉菌毒素对动物的危害（Devegowda等,&nbsp2002）。中和饲料中霉菌毒素最有效的方法就是在这些霉菌毒素被肠道吸收之前将它们吸附并形成无活性的物质，也就是在饲料生产过程中添加霉菌毒素吸附剂或结合剂。按照吸附剂或结合剂的有效成分，可将其分为3大类：一是黏土类和铝硅酸盐类。此类吸附剂由于表面带有负电荷，形成负电荷吸附中心，从而具有吸附各种阳离子和极性分子的能力。因此，此类吸附剂适于吸附带有极性基团的霉菌毒素，如黄曲霉毒素；但是对于那些极性不强的霉菌毒素（如玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素），则吸附能力较弱（Santin等,&nbsp2002）。市场上常见的此类产品包括膨润土、沸石粉、水合铝硅酸钠钙（HSCAS）等。二是活菌以及活菌产生的酶类。此类吸附剂的作用机理为利用活菌或者酶类对霉菌毒素分子中特定的功能性原子团进行降解，使霉菌毒素的毒性降低或是完全去除。但是，受制于饲料加工过程中的高温高压等逆境条件，动物消化道内降解条件的复杂性，降解产物的不确定性，以及酶的特异性等因素，这种方法尚未成熟，还需进一步研究。此外，在规模化的饲料生产中添加此类吸附剂还存在操作困难、成本较高、脱毒效率难以检验等问题。三是酵母或酵母细胞壁类。其有效成分为酵母细胞壁内的葡甘露聚糖（GM）。研究表明，葡甘露聚糖对黄曲霉毒素有较好的吸附作用（Aravind等,&nbsp2003）。而且，应用葡甘露聚糖吸附剂对饲料进行脱毒不会产生其它有害物质，而且也不会影响到饲料的营养价值、适口性等（Bronius等,&nbsp2005）。但是，另有研究表明，其对玉米赤霉烯酮、T-2毒素、呕吐毒素以及赭曲霉毒素A的吸附力则相对较弱（Yiannikouris等,&nbsp2002）。而且利用不同种属酵母制成的产品对霉菌毒素的吸附能力差别较大（Bronius等,&nbsp2005）。因此，此类吸附剂还需进一步研究以改善其吸附能力。5.结语随着我国水产养殖业和饲料业的迅速发展，霉菌毒素污染饲料原料及饲料，其带来的危害与损失也显得尤为重要。同时，霉菌毒素还可残留在动物体内，通过食物链进而危害人类健康。因此，我们有必要对霉菌毒素进行深入的研究和防控，积极采取措施从生产的各个环节去降低或消除霉菌毒素污染的机率。从而实现水产养殖业和饲料业的健康可持续发展，保障人类的水产品安全。（完）1、来源：《中大水生通讯》第58期2、作者：广州市诚一水产科技有限公司&nbsp李杰/文3、微信号：gzchengyi2013 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过氧化氢造氧化应激模型
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过氧化氢造氧化应激模型，用人脐静脉内皮细胞，浓度125，250，500，，作用3，6，12，24小时。为什么每次到12小时就和六小时理论值相反，及没有时效关系。12小时的反而损伤程度轻，试验重复了三次。
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你做什么方向的，之前我们直接用不同浓度的过氧化氢刺激细胞，结果不太好，后来停掉了
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药理。我根据文献上介绍去做的，但是结果不好。
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有的文献上提到egf,pdgf,过氧化氢都能造模，你试试
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这个好像不太好结果，我也正在做，衰老模型
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【题　名】利心冲剂对心力衰竭大鼠模型的氧化应激和凋亡相关基因的影响
【作　者】高想 蒋日磊 蒋凤荣 唐艳芬 姜卫东 张锋莉
【机　构】江苏省南通市中医院内科 南京中医药大学病理教研室
【刊　名】《医学研究杂志》2010年 第6期 49-52页　共4页
【关键词】利心冲剂 心力衰竭大鼠模型 氧化应激 凋亡相关基因
【文　摘】目的探讨利心冲剂调控心力衰竭大鼠模型氧化应激抗细胞凋亡的分子机制。方法实验分组：正常组、模型组、卡托普利治疗组、利心冲剂低剂量组、利心冲剂高剂量组。腹腔注射阿霉素（ADR）5mg/kg，每5天1次，共3次，复制大鼠心力衰竭模型，左心室插管术测定血流动力学指标；血清学检测氧化指标SOD1、MDA；Real time PCR检测氧化应激及凋亡相关基因SOD1、PGC-1α和Bcl-2、Bax。结果利心冲剂治疗组和模型组比较，形态学显示心肌细胞变性坏死明显减轻；左心室收缩内压显著升高；氧化应激相关指标SOD1、PGC-1α升高、MDA降低；凋亡相关基因Bcl-2升高、Bax/Bcl-2降低；均有显著性差异（P〈0.05）。 结论利心冲剂调控氧化应激相关基因SOD1、PGC-1α，降低凋亡相关基因Bax/ Bcl-2表达，减轻心肌细胞凋亡，改善心脏收缩与舒张功能。
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