关注今日：8 | 主题：312820
微信扫一扫
【求助】求DNA dot blot详细步骤
页码直达：
这个帖子发布于3年零291天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已关闭悬赏丁当:2
请问谁有DNA dot blot的详细步骤的，谢谢O(∩_∩)O~
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
(.hk) 搜索：DNA dot blot site:eduNote: dot blots can also be set up by hand simply by spotting small aliquots of each sample on to the membrane and waiting for the blot to dry. Repeated applications can be used to apply up to 30 ul of a dilute DNA sample.<font style="color:#. Cut a strip of uncharged nylon membrane to the desired size and mark out a grid of 0.5-cm x 0.5-cm squares with a blunt pencil. Place membrane on the surface of 6x SSC and allow to submerge. Leave 10 min.2. Add 1/2 vol of 20x SSC to DNA to give a final concentration of 6x SSC in the minimum possible volume. Denature the DNA 10 min at 100°C, then place in ice. If using positively charged nylon, add 1 M NaOH and 200 mM EDTA, pH 8.2, to each sample to give a final concentration of 0.4 M NaOH/10 mM EDTA, and denature.3. Place the wetted membrane over the top of an open plastic box so that the bulk of the membrane is freely suspended.4. Microcentrifuge DNA 5 sec, spot onto the membrane using a pipet, and allow to dry. Do not touch the membrane with the pipet when applying the samples. Up to 2 ul can be spotted in one application.5. Denature, neutralize, and immobilize DNA on uncharged nylon membrane. Rinse and dry a positively charged nylon membrane.6. Store membrane at room temperature.
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园关注今日：13 | 主题：398160
微信扫一扫
【求助】哪位大侠有western dot blot的详细操作步骤？
页码直达：
这个帖子发布于9年零137天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我用western blot方法检测纯化蛋白，做了很多次，膜上什么也没有，估计可能是由于蛋白分子量太大（185kD），电泳时未进入分离胶或没有转到膜上，非常焦急，因此，想用western dot blot来检测一下，但以前从未做过这种实验，请问，哪位大侠知道其详细的操作步骤？或我在哪些书中或网上可以找到其操作方法呢？这种方法用什么膜？PVDF膜？NC膜还是其他膜？蛋白需要像western blot那样变性处理吗？如果不用，该怎么处理？总之，什么也不知道，还请多多指点！
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
哪位大侠可以帮忙阿？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
还有，如果蛋白在沉淀里，我可不可以直接加入还原性的蛋白上样buffer，将蛋白变性后点到膜上呢？PVDF膜可以用吗？如果可以，应该怎么进行处理？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
附件里这个文件就是我从版上下的你可以试试版面搜索会有很多结果的
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
procedure:a. Label nitrocellulose membrane (using a pencil) to identify protein elution fractions.b . Pipette 2&l from each fraction onto the membrane, allow the membrane.c . When dry, incubate the membrane in blocking solution for 1 hour.d . After incubation, incubate (rotate or shake) the membrane with primary antibody solution (diluted in blocking solution), for 2 hours at room temperature.e . Wash the membrane in washing buffer (3 x 10 min).f . Incubate the membrane with secondary antibody-alkaline phosphatase enzyme conjugate solution (in blocking solution) for 1 hour.g . Wash the membrane in washing buffer (3 x 10 min).h . Incubate the membrane in substrate solution, until spots are visible.i . Stop the reaction – rinse the membrane in distilled water.j . Air dry the membrane.
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
谢谢两位大侠！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
cobenlee procedure:a. Label nitrocellulose membrane (using a pencil) to identify protein elution fractions.b . Pipette 2&l from each fraction onto the membrane, allow the membrane.c . When dry, incubate the membrane in blocking solution for 1 hour.d . After incubation, incubate (rotate or shake) the membrane with primary antibody solution (diluted in blocking solution), for 2 hours at room temperature.e . Wash the membrane in washing buffer (3 x 10 min).f . Incubate the membrane with secondary antibody-alkaline phosphatase enzyme conjugate solution (in blocking solution) for 1 hour.g . Wash the membrane in washing buffer (3 x 10 min).h . Incubate the membrane in substrate solution, until spots are visible.i . Stop the reaction – rinse the membrane in distilled water.j . Air dry the membrane.请问兄弟，如何加一抗和二抗，是在干的膜上吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
pvdf膜一定不能干
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园[请教]western与dot-blot请教 - 实验交流 - 生物秀
标题: [请教]western与dot-blot请教
摘要: [[请教]western与dot-blot请教] 大家好，目前做western遇到了问题，请帮忙分析,谢谢!做western时，其中有一次显示出很弱的条带，因为太弱所以不确定。后增大二抗浓度后不见目的带。做Dot-blot，点样品和阴性对照的膜上都显色微弱,怀疑可能是DAB在样品上的沉淀线，一抗以及二抗对照直接用原液点膜显出色，但用稀释的一抗和稀释的二抗点膜做对照，一抗与二抗孵育的膜未显出，二抗显出。我的哪一环节出了问题呢？一抗有问题吗？谢谢！ 关键词:[二抗 一抗 稀释 条带 孵育]……
大家好，目前做western遇到了问题，请帮忙分析,谢谢!做western时，其中有一次显示出很弱的条带，因为太弱所以不确定。后增大二抗浓度后不见目的带。做Dot-blot，点样品和阴性对照的膜上都显色微弱,怀疑可能是DAB在样品上的沉淀线，一抗以及二抗对照直接用原液点膜显出色，但用稀释的一抗和稀释的二抗点膜做对照，一抗与二抗孵育的膜未显出，二抗显出。我的哪一环节出了问题呢？一抗有问题吗？谢谢！
只有把你的抗体的厂家和稀释的倍数贴上来我们才好帮你分析。一般常见的原因有几个：1，一抗的效价太低，稀释后失去作用。2，一抗和二抗在合适的比例下才会反应，太高或者太低都不反应。3，操作过程中洗膜的步骤也很关键。建议调整抗体的稀释度，多做几组，摸索以下条件
谢谢songwuqi, 我用的一抗是中山的,但买了好长时间(大约两年),1000倍稀释,二抗是PIERCE的,也是1000倍稀释.每次western结果膜上都是一片空白,曾经我以1:500一抗与1:500二抗做.仍没结果. 请帮忙分析,谢谢!
又将一抗做了梯度1：100，1：200，1：400，1：800, 1：00，1：00的二抗结合，结果都没有显出。而1：5000的二抗显色较好，是否能说明一抗失效？？请帮忙分析，谢谢！
相关热词：
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
官方微信号：shengwuxiu
电话：021-关注今日：8 | 主题：312820
微信扫一扫
【求助】求DNA dot blot详细步骤
页码直达：
这个帖子发布于3年零291天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已关闭悬赏丁当:2
请问谁有DNA dot blot的详细步骤的，谢谢O(∩_∩)O~
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
(.hk) 搜索：DNA dot blot site:eduNote: dot blots can also be set up by hand simply by spotting small aliquots of each sample on to the membrane and waiting for the blot to dry. Repeated applications can be used to apply up to 30 ul of a dilute DNA sample.<font style="color:#. Cut a strip of uncharged nylon membrane to the desired size and mark out a grid of 0.5-cm x 0.5-cm squares with a blunt pencil. Place membrane on the surface of 6x SSC and allow to submerge. Leave 10 min.2. Add 1/2 vol of 20x SSC to DNA to give a final concentration of 6x SSC in the minimum possible volume. Denature the DNA 10 min at 100°C, then place in ice. If using positively charged nylon, add 1 M NaOH and 200 mM EDTA, pH 8.2, to each sample to give a final concentration of 0.4 M NaOH/10 mM EDTA, and denature.3. Place the wetted membrane over the top of an open plastic box so that the bulk of the membrane is freely suspended.4. Microcentrifuge DNA 5 sec, spot onto the membrane using a pipet, and allow to dry. Do not touch the membrane with the pipet when applying the samples. Up to 2 ul can be spotted in one application.5. Denature, neutralize, and immobilize DNA on uncharged nylon membrane. Rinse and dry a positively charged nylon membrane.6. Store membrane at room temperature.
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园