[发明专利]一种检测猪肉组织中残留的头孢噻呋的高效液相色谱方法在审
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技术领域本发明涉及一种检测猪肉组织中头孢噻呋残留的高效液相色谱方法，属于生物检测领域。背景技术头孢噻呋（ceftiofur）又名赛得福，是第１个动物专用的第３代头孢菌素类抗生素。1988年，FDA批准了头孢噻呋钠用于治疗牛呼吸道细菌性疾病，此时该药在美国首次上市。此后FDA又陆续批准了头孢噻呋钠、盐酸头孢噻呋及头孢噻呋晶体自由酸用于１日龄鸡、火鸡，猪、肉牛、奶牛、马、山羊及绵羊等的呼吸道疾病的治疗。加拿大、日本及欧洲一些国家也相继正式批准用于猪、肉牛、奶牛、羊的呼吸道疾病的治疗。头孢噻呋抗菌谱广，抗菌活性强，对革兰阳性菌、阴性菌及厌氧菌都有很强的抗菌活性，而且对胃酸和β内酰胺酶较稳定，过敏反应少，体内残留非常低，在世界范围内得到广泛应用。目前，国内有多家公司相继研制出头孢噻呋注射液，但制剂的溶剂体系均为植物油、大豆油等油性介质。华南农业大学联合洛阳惠中兽药有限公司在国内首先研制出水性头孢噻呋注射液，由于其溶剂体系为水性，流动性好，易于吸收，肌注时不容易堵塞针头，对动物的刺激性小，具有广阔的市场应用前景。目前，在肉类组织中，对于头孢噻呋的检测方法有许多，液制连用(LC—MS)、气质连用(GC-MS)、ELISA等等。但是这些方法速度慢，容易受较多因素影响，准确率不高。而高效液相色谱法分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化分析精确度高，应用范围广；不受试样的挥发性和热稳定性限制，应用范围广；流动相种类多，可通过流动相的优化达到高的分离效率，因此越来越被重视和采用。目前还没有针对头孢噻呋残留检测的高效液相色谱法的专利。发明内容为解决以上技术问题，本发明的目的之一在于提供一种检测猪肉组织中头孢噻呋残留的高效液相色谱分析方法。本发明的目的之一是这样实现的：检测头孢噻呋残留的高效液相色谱分析仪，其关键在于色谱条件的设定和使用前柱子的清洗与活化。本发明主要采用高效液相色谱分析法检测猪肉组织中的头孢噻呋的残留，采用高效液相分析法的技术主要有三个方面，第一，净化条件的选择，提取、衍生后的样液净化采用C18柱、SAX阴离子交换柱和SCX阳离子交换柱3种不同的固相萃取柱。C18柱主要去除中性杂质，SAX柱主要去除阳离子化合物，SCX柱主要去除阴离子化合物。本实验考察了1根柱(C18柱)、2根柱(C18柱和SAX柱)和3根柱(C18柱、SAX柱和SCX柱)的净化效果，发现单独使用C18柱和使用C18与SAX柱的净化效果均不理想，样液中其它组分对测定有干扰。同时使用3根固相萃取柱，净化和富集效果较好。第二，流动相的选择，流动相采用乙腈-水(该体系均含0.1%TFA)或甲醇-水(含0.1%TFA)体系，发现乙腈-水体系优于甲醇-水体系。以乙腈-水(体积比10∶90)和乙腈-水(体积比90∶10)进行梯度洗脱，或以乙腈-水(体积比15∶85)等度洗脱，头孢噻呋衍生物(DCA)的分离效果都比较好，样液中的其他组分对测定无干扰。由于梯度洗脱进样前需要平衡，分析时间较长，故选择等度洗脱。流动相中乙腈比例增加，头孢噻呋衍生物(DCA)出峰提前，但分离度变差。第三，衍生化：头孢噻呋在动物体内主要以脱呋喃甲酸头孢噻呋(DFC)代谢物存在，DFC可与体内生物大分子(如血浆蛋白)结合。结合态的DFC不容易被水性溶液提取，因此要将结合态变成游离态。二硫赤藓糖醇可以把蛋白结合的DFC及母体药转化为DFC，游离的DFC与碘乙酰胺反应，生成具有紫外吸收的衍生物脱呋喃甲酸头孢噻呋乙酰胺(DCA)。有益效果：本发明检测方法具有分辨率高、速度快、重复性高、自动化操作分析精确度高，在室温下就可进行检测等优点。附图说明图1头孢噻呋标准溶液。图2空白肌肉HPLC色谱图。图3空白肌肉添加1μg/g的HPLC色谱图。图4连续给药后肌肉样品HPLC色谱图。具体实施方式1.溶液配制：头孢噻呋储备液(100mg/L)：称取10.0mg头孢噻呋标准品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，-20℃保存，可使用6个月；头孢噻呋中间液(5mg/L)：吸取250μL100mg/L头孢噻呋储备液至5mL容量瓶中，用0.025mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)定容，摇匀(现配现用)；0.025mol/L磷酸缓冲液(pH7，0)：将3.4g磷酸二氢钾溶于900mL水中，用450g/L氢氧化钾溶液调节pH值至710，用水定容至1L；0.05mol/L硼酸缓冲液：称取19g硼酸钠和3.7g氯化钾，用水定容到1L；4g/L二硫赤藓糖醇溶液：称取1.0g二硫赤藓糖醇，溶于250mL0.05mol/L硼酸缓冲液中(现配现用)；40g/L碘乙酰胺溶液：称取2.0g碘乙酰胺，溶于50mL0.025mol/L磷酸缓冲液中(现配现用)。2.色谱条件：C18柱(250mm×416mm，5μm)；流动相：乙腈-水-三氟乙酸(体积比15∶85∶011)；流速：110mL/min；柱温：30℃；紫外检测波长：266nm；进样量：25μL。3.样品处理：提取与衍生：称取110g组织样品于50mL离心管中，加入14mL4g/L二硫赤藓糖醇溶液，均质，然后放入恒温振荡水槽仪中37℃保温20min。加入3mL4%碘乙酰胺溶液，摇匀，室温下静置衍生30min，离心10min(4℃，20000r/min)，取出上清液于25mL比色管中。残渣中加入6mL01025mol/L磷酸缓冲液，混匀，离心10min(4℃，20000r/min)，合并上清液，用25%磷酸溶液调节pH值至2.5～2.6，用水定容至25mL。取出10.0mL定容液，离心15min(4℃，20000r/min)；净化：将提取与衍生最后所得的上清液过C18固相萃取柱，保持流速1～2mL/min，再依次用5mL磷酸缓冲液和3mL0.01moL/L氢氧化钠溶液淋洗，用2mL乙腈-水(体积比15∶85)洗脱并收集于含5mL水的试管中，保持抽真空2min。取出收集的试管，加入5mL水，摇匀，过SAX固相萃取柱，保持流速1～2mL/min，用1mL水润洗试管，加入柱中，用2.5mL乙腈-体积分数为5%乙酸(体积比5∶95)洗脱并收集于另一含5mL水的试管中，保持抽真空2min。取出收集的试管，加入5mL水，摇匀，过SCX固相萃取柱，保持流速1～2mL/min，用1mL水润洗试，加入柱中，用2.5mL乙腈-0.1mol/L氯化钠(体积比5∶95)洗脱并收集，保持抽真空2min。取出收集的试管，摇匀，供测定；标准品处理：移取适量头孢噻呋中间液至50mL离心管，加入14mL4g/L二硫赤藓糖醇溶液，然后放入恒温振荡水槽仪中37℃保温20min。加入3mL40g/L碘乙酰胺溶液，摇匀，室温下静置衍生30min，加入6mL0.025mol/L磷酸缓冲液，用25%(体积分数)磷酸调节pH值至2.5～2.6，用水定容样液至25mL。其余操作步骤同“净化”操作；标准曲线制作：准确称取空白匀浆组织适量，添加100μＬ头孢噻呋系列标准工作液，使得样品中头孢噻呋浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10μg/g。按“净化”方法处理和测定，将去呋喃羰基头孢噻呋乙酰胺的色谱峰面积（A）与相对应的药物浓度（C）作线性回归，求得标准曲线方程和相关系数，共作3个批次；检测限和定量限：准确称取适量空白匀浆组织，添加头孢噻呋系列标准工作液适量，配置成系列加标样品，按“净化组织样品前处理方法”处理样品，再按设定的色谱条件进行HPLC分析测定。以最低检出浓度计算，S/N≥3时的加标样品浓度为检测限，S/N≥10时的加标样品浓度为定量限。回收率与精密度本实验以猪肉作为样本，取适量标准品加入到1.0g样品中，使添加量在猪肉中200、μg/kg，每个添加水平各取24份试样，按上述过程进行处理，加标平均回收率为90%～91%，相对标准偏差(RSD)1.8%～3.5%，结果满意。应用取阳性样品猪肉按照样品处理和测定方法进行处理和测定，样品中其它组分对测定无干扰，据处理功能(间隔为0.5nm)和Origin7.5求积分功能，得到J=5.2×10-15cm3·L·mol-1；再由(2)式求出R0值。一般认为药物对BSA的荧光猝灭作用主要源于212位色氨酸残基。当c(E)∶c(BSA)=1∶1(相对分子质量以2000计)时，E=1-IF/I0F=0.13，由(1)式求出r值，得r=2.15nm。
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医生建议：如果使用头孢类药物效果不好的话建议您可以做一个药物敏感试验，之后再根据检查的结果是用敏感的抗生素进行治疗。
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说说头孢用药的那些事——一个执业药师的日常总结
说说头孢用药的那些事，你中招了没？一个执业药师的日常总结李长青写在开篇前的感受参加2015执业药师资格考试顺利通关，在朋友圈里晒出自己的成绩单，高兴的显摆了一下。朋友们纷至沓来的线上祝贺，起初觉得没什么，自己幻想着回头领到证书可以挂出去，多赚点人民币。可后来，我感觉身上的担子重了些。在班车上、在洗澡时、在家人生病时、或者在朋友圈里，认识我的朋友们，同事们会问及我一些用药问题。“店员推荐我换这个药，行吗？”“孩子感冒了该不该吃消炎药啊？”“这药说明上写着一天三顿，我可不可以少吃一顿？”等等。虽然自己初出茅庐，药师水平尚停留在“纸上谈兵”，但看着那些信任的眼神，“不知道”的字眼难以吐口。于是我赶紧翻书，赶紧查资料，尽最大的努力给大家找到科学依据。今天总结了一些头孢用药的那些事吧！分享给大家，希望我的点滴努力能够换来亲朋好友的早日康复。
一、听说吃头孢类消炎药，都不能喝酒吗？问这个问题的朋友是我老家的妹夫，他曾经感冒后喝了酒，后来在药店买了头孢吃，当天晚上就头晕、胸闷、呼吸憋气、迷迷糊糊的、好像濒死的感觉。事后才知道是因为吃头孢药喝酒造成的。这种反应在药学里专业名词叫“双硫仑样反应”。头孢菌素母核（7-ACA）上如果存在双硫仑分子结构，那么在服药期间或者之后的5-7天内饮酒、服用含有乙醇的药物比如藿香正气水，中药酒剂，食物（比如豆腐乳，啤酒鸭等）以及外用乙醇均可以抑制乙醛脱氢酶的活性，使乙醛代谢为乙酸的路径受阻，导致乙醛的过量堆积，引起双硫伦样反应。临床表现为颜面部及全身皮肤潮红，眼结膜发红、发热感、头晕、头痛、胸闷、气急、出汗、呼吸困难、言语混乱、话语多，视物模糊、步态不稳、狂躁、意识障碍、晕厥、腹痛、腹泻、咽喉刺痛、震颤感、口中有大蒜味、还可以出现心动过塑、血压下降、烦躁不安、濒死感等等严重的症状出现。但并不是所有头孢都会出现以上反应，如果分子结构中没有双流仑类似结构的头孢菌素比如头孢拉定、头孢氨苄、头孢呋辛酯等等则无此反应。总之大家如果感冒吃药了还要有场合应酬的话，请尽量不喝酒！
二、头孢都有四代了，是不是头孢二代就比一代强呢？这样理解正确吗？我搜了下面的资料，证明这种观念是不完全正确的。首先普及一下头孢抗生素进行代别区分的依据。是根据二抗二性来区别的。二抗是指依据抗菌谱，抗菌活性，二性是指，对酶的稳定性（可以理解为酶越稳定，越不容易耐药），对肾脏的毒性。详细见下表： 图中所示表头部分代表的是抗菌谱、肾毒性、稳定性，“+-”号代表的是抗菌活性。依据抗菌药物合理使用原则，头孢三代和四代都属于限制性或者特殊限制性用药，大医院的副高级别以上的医生才有处方权。我们今天只分析头孢一代和二代的比较。会发现在G+菌的抗菌活性一代反比二代要强。在G-菌的抗菌活性上一代就不如二代了。在安全性和对酶的稳定性方面二代优于了一代。因此二代好于一代，不能一言以概之，如果只是轻度的阳性菌感染，一代头孢（+++）就远好于二代（+）。记得去年，我老公生病，高烧39度几天都没有退下，实在不行，去大医院看病吧，打车费38块，看病开药一共只花了19.5元（一针退烧针，一盒感康一盒头孢氨苄胶囊），三甲医院没有给输液反而打了退烧针，只开了口服药。当时还不太相信能治好呢，可是第二天烧下去了，病好转了，连服5天头孢氨苄胶囊就痊愈了。在去医院之前我们在药店买药也不下100多块了，都用的是好药贵药，看来治病用对药比用好药更重要。
三、一天4次的药，可不可以少吃一顿呢？答案当然是不可以。说明书做出给药次数是有科学依据的。是基于药物的最大治疗效果和安全性来制定的科学用法。比如头孢菌素类药物属于繁殖期杀菌剂。本类药物为时间依赖型抗菌药物，给药原则应按每日分次给药，提高 T?MIC%超过MIC90浓度维持时间占给药间隔时间的百分率），使之达到满意的杀菌效果。如果没有按时按次服药，血药浓度就有一个时段低于最低有效浓度，杀菌能力就会减弱，不仅影响治疗效果，还会诱发细菌耐药。这也就解释了很多人为什么吃对了药，但还老不好，一个可能因素就是咱没有按照科学服用方法服用。一天四次服用的药物一定要每间隔6个小时吃一次药，哪怕是深更半夜也要起来吃药。如果一天三次的药物，给药时间间隔是8小时一次，可不是咱们传统的理解早中晚用餐前后服用。严格的服药时间可以保证持续的杀菌效果，不要怕麻烦，病好了才不麻烦呢。
四、提倡科学合理使用抗生素，能口服不输液，能吃药不打针，看看头孢一代药能帮你治疗哪些病！头孢氨苄胶囊 【典】【基】【医保（甲）】【抗菌谱】金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎球菌、大肠埃希菌、肺炎杆菌、流感杆菌、痢疾杆菌等敏感菌【适应症】使用与轻中度感染。1. 扁桃腺炎，扁桃腺周炎，咽喉炎2. 支气管炎，肺炎，支气管肺炎3. 哮喘，支气管扩张感染以及手术后胸腔感染。4. 急性及慢性肾盂肾炎，膀胱炎，前列腺炎及泌尿生殖系统感染。5. 中耳炎、外耳炎、鼻窦炎6. 口腔感染：上颌骨周炎、上颌骨骨膜炎、上颌骨骨髓炎、牙槽脓肿、根尖性牙周炎、智齿周围炎、拔牙后感染7. 眼部感染：睑腺炎，眼睑炎、急性泪囊炎。8. 皮肤感染：毛囊炎、疖、丹毒、蜂窝组织炎、脓包、痈、座疮感染、皮下脓肿、创伤感染、乳腺炎、淋巴管炎。【注意事项】1.有胃肠道疾病史者，尤其是有溃疡，局限性肠炎货肾功能不全的慎用。2.头孢氨苄主要经肾脏排出，肾功能不全者需酌减剂量。3.头孢氨苄可头孢胎盘屏障，并可有乳汁分泌，妊娠及哺乳期妇女须权衡利弊。【用法用量】成人剂量：口服。一般一次250～500mg，一日4次，高剂量一日4g。肾功能减退的患者，应根据肾功能减退的程度，减量用药。单纯性膀胱炎、皮肤软组织感染及链球菌咽峡炎患者每12小时500mg。儿童剂量：口服。每日按体重25～50mg/kg，一日4次。皮肤软组织感染及链球菌咽峡炎患者每12小时口服12.5～50mg/kg。 以上是笔者半日之内，呕心沥血之作，如果你有心看完，那就和我一样成为药学知识传播的志愿者吧，动动手指分享到朋友圈，赠人玫瑰，手留余香！祝福身边的亲朋好友猴年康健！远离病魔痛楚！
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规格1.5g*600
产品包装600支
有效期未知
批准文号国药准字H
产品说明书
【药品名称】
注射用头孢呋肟钠
【英文名】
Cefuroxlme Sodium for Injection
【主要成分】
本品的主要成分是头孢呋肟钠，其化学名称为(6R,7R)-7-［2-(2-呋喃基)乙醛酰胺基］-3-(羟甲基)-8-氧-5-硫杂-1-氮杂双环［4,2,0］辛-2-稀-2-羧酸7-(Z)-(O-甲基肟)氨基甲酸脂-钠盐。
本品为白色或淡黄色的结晶性粉末。
【药理、毒理】
头孢呋肟的抗菌作用机制是通过阻止细菌细胞壁的合成。其对革兰氏阳性球菌中的肺炎球菌、溶血性链球菌具有很强的抗菌作用。又其对细菌产生的一些β-内酰胺酶相对稳定，因此对某些产酶菌亦可有效。
【药代动力学】
肌注本品0.75g后，血药浓度达峰时间0.40±0.10小时，平均血药峰浓度为25.0(2.97μg/ml，消除半衰期为1.03(0.45小时。据文献报道本品在肌注8小时内的血药平均浓度1.3mg/ml，静注0.75g和1.5g后15分钟血药浓度分别为50和100μg/ml，消除半衰期约80分钟。用药后8小时，89%的原药由肾脏排出。本品的血清蛋白结合率约30%。
【适应症】
用于敏感细菌所致的以下感染：
（1）呼吸道感染症：急、慢性支气管炎，感染性支气管扩张症，细菌性肺炎，肺脓肿和术后胸腔感染。
（2）耳、鼻、喉感染症：鼻窦炎、扁桃腺炎、咽炎。
（3）泌尿道感染症：急、慢性肾盂肾炎、膀胱及无症状的菌尿症。
（4）皮肤、软组织感染症：蜂窝组织炎、丹毒、腹膜炎及创伤感伤。
（5）骨及关节感染症：骨髓炎及脓毒性关节炎。
（6）产科和妇科感染症：骨盆炎。
（7）淋症：尤其适用于不宜用青霉素治疗者。
（8）其他感染：包括败血症及脑膜炎；腹部骨盆及矫形外科手术；心脏、肺部、食管及血管的手术；全关节置换手术中预防感染。
【用法与用量】
可供内肌注射、静脉注射、静脉滴注。
（1）肌内注射：0.25g注射用头孢呋肟钠加1ml注射用水或0.75g注射用头孢呋肟钠加3ml注射用水，轻轻摇匀使成为不透明的混悬液。
（2）静脉注射：0.25g注射用头孢呋肟钠最少加2ml注射水用或0.75g注射用头孢呋肟钠最少加6ml注射用水，使溶解成黄色的澄清溶液。
（3）静脉滴注：可将1.5g注射用头孢呋肟钠溶于50ml注射用水中或与大多数常用的静脉注射液配伍（氨基糖苷类除外）。
（4）一般感染或中度感染：一次0.75g，一日3次，肌内或静脉注射。
（5）重症感染：剂量加倍，一次1.5g，一日3次，静脉滴注20～30分钟。
（6）婴儿和儿童按每日注射30～100mg/kg，分3～4次给药。
【不良反应】
偶见皮疹及氨基转移酶升高，停药后症状消失。与青霉素有交叉过敏反应。据文献报导，长期使用本品可导致非敏感菌的增殖，胃肠失调，包括治疗中、后期甚少出现的假膜性结肠炎，罕见病例出现短暂性的血红蛋白浓度减少，嗜酸性白血球增多，白血球和嗜中性白血球减少，停药后症状消失。肌注时，注射部位会有暂时的痛感，剂量较大时尤其如此，可与1%的盐酸利多卡因配伍使用。
【禁忌症】
对头孢类抗生素过敏者禁用。
【注意事项】
（1）对青霉素有交叉过敏史患者慎用。
（2）高剂量使用本品时，忌与强利尿剂（如呋塞米）合用。
（3）妊娠早期慎用。
（1）0.25g （2）0.75g（按C16H16N4O8S计算）
遮光，密封在阴凉保存。
【有效期】
暂定一年半。
通用名：注射用头孢呋辛钠生产商：意大利Esseti Farmaceutioi S.r.l规
格：1.5g*600经销商：安徽经典药业有限公司-vip
供应价格：预约购买供应价格更新时间：日
装：600计价单位：支
剂 型：注射剂批准文号：国药准字H
商品名：意大利（新 药：
医保类型：中药保护品种：
OTC：政府定价：
产品编号：P48150委托加工：
优质优价中成药：标签信息：
质量标准：委托加工：
国家基本药物：国家最高指导零售价：0.00元
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