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发酵培养基及其制备
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生物化学工程基础(第二章)
第二章 工业微生物学基础LOGO第一节工业生产常用的微生物一、 工业生产常用的微生物* ?从自然界中分离出来就能被利用；?对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。目前育种总趋势 从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。* 微生物有哪些特点？由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类 （alga）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产 用的生物。 目前人们对微生物的认识还是十分不够的。已经初步 研究的不超过自然界微生物总量的10%左右。 微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大 规模生产的不超过一百多种；微生物酶近千种，而在工业上利用的不过四五十种。 可见潜力是很大的。在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉 菌和放线菌。? 细菌（bacteria）：属于单细胞原核生物 （ unicellular prokaryote）， 以典型的二分分裂(binary)方式 繁殖。细胞生长时，环状染色体 （chromosome）被复制，细胞内 的蛋白质等组分同时增加一倍， 然后在细胞中部产生一横段间隔， 染色体被分开，继而间隔分裂形 成两个相同的子细胞。如间隔不完全分裂就形成链状 细胞。工业生产常用的细菌： 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 乳酸杆菌(Lactobacillus lactics) 醋酸杆菌(Acetobacter) 棒状杆菌(Corynebacterium) 短杆菌(Brevibacterium) 用于生产： 生产淀粉酶(amylase） 蛋白酶（proteinase） 乳酸(lactic acid) 醋酸(acetic acid) 氨基酸(amino acid) 肌苷酸(inosinic acid)? 酵母菌（yeast） 酵母菌为单细胞真核生 物（ unicellular eukaryote），在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖质较多的的酸性 环境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母（ petroleum yeast）较多地分布在油田周围的土壤中。?酵母菌大多为腐生，常 以单个细胞存在，以发芽 形式进行繁殖。母细胞体 积长到一定程度时就开始 发芽。芽长大的同时母细 胞缩小，在母子细胞间形 成隔膜，最后形成同样大 小的母细胞。如果子芽不 与母细胞脱离就形成链状 细胞，称为假菌丝 (pseudomycelium)。?工业上用的酵母菌：啤酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae)、 假丝酵母(Candida)、 类酵母 (Saccharomycodes) 用途：酿酒(Brewing)、制 造面包、制造低凝固点石油、 生产脂肪酶（lipase），以 及生产可食用、药用和饲料 用酵母菌体蛋白等。?霉菌（mould）霉菌不是一个分类学上的名词。凡生长在营养基 质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌(fungi)统 称为霉菌。 霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空 气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性(aerobiotic)，多腐生，少数寄生。霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，大多以无性孢子繁殖为主。生长方式:末端的伸长和顶端分支，彼此交错呈网 状。 长度:受遗传和环境影响，其分支数量取决于环境条 件。菌丝或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲 霉，半知菌类的曲霉、青霉等； 产品：enzyme preparation、antibiotic、 organic acid 、 steroid hormone.? 放线菌(Actinomycetes)放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式 见于液体沉没培养（submerged cultures）中。生长方式是菌丝末端伸 长和分支，彼此交错成网状结构，成为菌丝体。菌丝长度即受遗传性的控制，又与 环境相关。第二章生物工业菌种与扩大培养放线菌最大经济价值在于能 产生多种抗生素（antibiotics）。 从微生物中发现的抗生素，有 60%以上是放线菌产生的，如链 霉素、红霉素、金霉素、庆大霉 素等。常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和 诺卡氏菌属等。A: 担子菌（国外一些科学家对香菇 的抗癌作用进行了深入的研 究，发现香菇中的“ 1 ， 2β - 葡萄糖苷酶”及两种糖 类物质具有抗癌作用。Basidiomycetes ）：所谓的担子菌就是人们通常所 说的菇类(mushroom)生 物。担子菌资源的利用正 愈来愈引起人们的重视， 如多糖(polysaccharide)、 抗癌(anticancer)药物的开发。B：病毒(virus)? 形体微小，体积比细 菌小的多。 ? 没有细胞结构，是一 种独特分子的生物，主要由 核酸和蛋白质构成。 ? 营寄生生活，由于缺 乏独立代谢的酶体系，不能 脱离寄主而自行生长繁殖， 有专一性。人类免疫缺陷病毒 （ human immunodeficiency virus ，HIV ） 获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome， AIDS ）
噬菌体（phage）是病毒的 一种。 Ｑ：烈性噬菌体和温和噬菌 体概念与区别。 噬菌体在寄主细胞中的生长 繁殖过程可分为吸附、浸入、 增殖、成熟和释放。藻类（alga）培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60吨，而种植 大豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆 28倍。? ?培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得蛋白 质是小麦的20-35倍。 培植单胞藻，每年每公顷地培植的单胞藻暗5%干物质为碳 水化合物（石油）计算，可得60吨石油燃料。 可通过藻类将CO２转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%,合成的油与重油相同， 加工后可转变汽油、煤油、和其他产品。培植单胞藻，每年 每公顷地培植的单胞藻暗5%干物质为碳水化合物（石油）计 算，可得60吨石油燃料。 国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养 藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。单胞藻的农场藻类细胞工厂二、 微生物工业对菌种的要求目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种 多种多样，但作为大规模生产，对菌种先则有下列要求：(1) 廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。(2) 易于控制培养条件，酶活性高；发酵周期较短。 (3) 抗杂菌和嗜菌体的能力强。 (4) 菌种纯，不易变异和退化，不产生 任何有害的生物活性物质和毒素，保证 安全生产。在筛选所需的菌种时应考滤的一些重要的指标： （1） 菌种的营养特征：（2） 菌种的生长温度：（3） 菌种对所采用的设备及生产过程的适应性： （4） 菌种的稳定性： （5） 产物的得率和产物的浓度： （6） 产物容易回收：能满足（3）-（6），则有希望成为效益较高的 生产菌种。第二节 菌种的衰退、复壮与保藏一、微生物菌种衰退的原因 1. 原因(1) 菌种保藏不妥;(2) 菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到不利的条 件，或是失去某些需要的条件；(3) 经诱变获得的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征的情况。 (4) 连续传代。第二节菌种的衰退、复壮与保藏2. 菌种性能的改变 (1) 菌种的外在特征改变异核现象导致微生物群体发生变异 自发突变导致菌种遗传性能改变 回复突变 (2) 菌种的生理状况改变生理生化特征改变营养需求改变衰退菌株的特点：个体或群体特征发生变化；生产能力 降低；代谢能力降低；发酵周期延长；抗不良环境能力降低。第二节菌种的衰退、复壮与保藏3 . 防止菌种衰退的措施如果菌种已经发生退化，产量下降，则要进 行分离复壮。菌种的分离: 因为在菌种发生衰退的同时，并不是 所有的菌体都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境 条件考验的，具有更强生命力。 ? 因此，对于已衰退的菌株采用单细胞菌株分离的措 施，即用稀释平板法或用平板划线法，以取得单细胞所长成的菌落（colony），再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来形状的菌株，甚至性能更 好的菌株（strain）。第二节菌种的衰退、复壮与保藏如对芽孢杆菌(Bacillus)，可先将菌液用沸水处理几分钟，再用平板进行分离，从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。 如果遇到某些菌株即使进行单细胞分离，仍不能达到复壮的效果，则可改变培养条件，达到复壮的目的。如AT3.942栖土曲霉(Aspergillus terricola)的产孢子能 力下降，可适当提高培养温度，恢复其能力。 同时通过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低 产菌株的培养条件。Ｑ：如何分离单细胞菌株（strain）？第二节菌种的衰退、复壮与保藏措施? 菌种的复壮? 提供良好的环境条件 ? 使用优良的保存方法 ? 定期纯化菌种? 通过分离达到复壮: 在琼脂平板划线、涂布或与琼脂培养基混合培养再分 离，达到―菌落纯 采用单细胞或单孢子分离法达到―细胞纯 ? 通过寄主体达到复壮: 将菌株接种到寄主细胞进行繁殖达到复壮。第二节菌种的衰退、复壮与保藏二 、菌种保藏（strain preservation）基本原理：根据菌种的生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代 谢活动处于不活波状态。 要求： 维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来优良的生产性能。保藏时首先选择优良纯菌种，最好是它们的休眠体如孢 子（ spore）、芽孢 (gemma)等； 要创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺 氧和缺乏营养物质的，即可达到降低其代谢活动，延长其保 存期的目的。第二节菌种的衰退、复壮与保藏保存方法：应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要 考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保存方法，以便长 期保藏。 酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封保藏法。 霉菌：沙土管保藏法。 细菌和放线菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。 放线菌可 用沙土或冷冻保藏法保藏。保藏应注意的问题：菌体状态：休眠体 基质：营养贫乏 操作过程：不应对细胞造成伤害第三节菌种的选育工业生产中微生物育种的基本方法包括自然选育、诱变育 种、抗性菌种选育、代谢控制育种及基因重组定向育种等。就是要改善菌种的特性，使能提高产量、改进质量、降低成本、改进工艺、方便管理及综合利用等。 代谢控制育种主要有两个方面：改变代谢通路的育种 改变代谢自动调节系统的育种第三节一、自然选育菌种的选育采样 ? 增殖培养 ? 第一次平板分离→第一次原种斜面 第二次平板分离→第二次原种斜面? ?第三次平板分离→第三次原种斜面第四次平板分离→第四次原种斜面 初步工艺条件摸索→ 复筛?种子培养 较优菌株1－3株 保藏及进一步做生产性能试验 或作为育种的出发菌株 某些必要试验和 毒性试验等? ? ?第三节菌种的选育二、诱变育种按照生产的要求，根据生物的遗转和变异的理论，用 人工的方法造成菌种变异，再经过筛选、而达到菌种选育 的目的。诱变育种一般采用物理、 化学诱变因素使微生物DNA 的碱基排列发生变化，以使 排列错误DNA模板形成异常 的遗转信息，造成某些蛋白 结构变异，而使细胞功能发 生改变。第三节菌种的选育原种（出发菌株）?纯化?斜面培养?完全 培养基同步培养?离心洗涤?玻璃珠震荡分散? 过滤?单细胞或孢子悬浮液 ? 自然分离（对照液）活菌计数 诱变处理 ? 诱变处理预备实验 ? 处理液活菌计数 平板分离 ? 形态变异并计算其变异率 斜面培养 ?初筛、复筛 ?自然分离和再复筛 保藏及扩大试验第三节菌种的选育诱变育种方案设计? ? ? ? 出发菌株的选择 诱变剂的种类及选择 突变株的筛选 突变株的发酵试验Q1：如何选择出发菌株？ Q2：诱变剂的种类有哪些？如何选择？Q3: 简要说明突变株的筛选方法？第四节 生产菌株的改良原生质体融合的步骤1. 标记菌株的筛选：对两亲株要进行标记，以提高筛选率。 2. 原生质体的制备：用相应的酶脱去菌体的细胞壁，制得完整的原生质体。3. 原生质体的融合与再生：两原生质体在促融因子的存在下 ，发生融合，重建细胞壁，形成新的细胞。4. 融合子的选择：在选择培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而选择融合子。 Q:什么是原生质体？如何选择生物酶制剂制备原生质体？第四节 生产菌株的改良第四节 生产菌株的改良二、DNA重组技术 第一代基因工程? 目标DNA片段的获得 ? 与载体DNA分子的连接 ? 重组DNA分子引入宿主细胞 ? 重组体的选择与鉴定 ? 外源基因的表达第四节 生产菌株的改良第四节 生产菌株的改良第二代基因工程?蛋白质工程的实践依据是DNA指导的蛋白质的合成，因 此，人们可以根据需要对负责编码某种蛋白质的基因进行重新设计，使合成出来的蛋白质的结构符合人们的要求。蛋白质工程是以蛋白质结构与 功能的关系为基础，通过周密的分 子设计，把蛋白质改造为合乎人类 需要的新型蛋白质 。第四节 生产菌株的改良 蛋白质工程内容 ? ①根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白 质；? ②确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。 在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空 间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新 的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。第四节 生产菌株的改良蛋白质工程的方法与基础?定点诱变技术(site-directed mutagenesis，site―specific mutagenesis) ：在一个插入了外源DNA片段 的质粒上，对该DNA片段在预定位置上进行结构的改 变。 ? 重组DNA技术、DNA测序技术以及寡核苷酸的快速 合成技术。? ?e.g.人干扰素?有三个Cys(17、31、141)。 天然IFN?中Cys 17受糖基化保护，31位与141位两个 Cys形成正常的二硫键。而工程菌生产的无法进行糖基化，导致Cys l7与Cys31或Cysl41形成二硫键，甚至与别的肽链上的Cys连接，其结果是产物活力下降，且不稳定，因 而有人将Cys 17的密码子TGT定向诱变成AGT(Ser)。?突变后菌株产生的IFN―?活力由3?107U／mg提高到2?108U／mg，而且稳定性大大提高。第四节 生产菌株的改良第三代基因工程?代谢工程或途径工程(metabolic engineering ／pathway engineering)，1991由美国加州理工 学院化学工程系教授Bailey首先提出的。?代谢工程是一门利用重组DNA技术对细胞物 质代谢、能量代谢及调控网络信号进行修饰与改造，进而优化细胞生理代谢、提高或修饰目标代谢产物以及合成全新的目标产物的新学科。代谢工程的基本流程.doc第四节 生产菌株的改良 代谢工程常用的术语? constructive metabolic engineering? inverse metabolic engineering ? Pathway、flux、metabolic network、node? metabolic flux analysis（MFA）? elasticity coefficient ? flux spit ratio 、 flux-based analysis(FBA) ? metabolic control analysis(MCA) ? flux control coefficient? flux summation theory第四节 生产菌株的改良? 代谢工程把量化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子生物学综合技术结 合起来，以“设计-操作-分析”反复交替进行、螺旋式逼近 目标的，在较广范围内改善细胞性能，以满足人类对生物的 特定的需求。第四节 生产菌株的改良代谢工程的代谢网络分析方法 ? ①1973年Kacser等人提出的重点研究对目标产物具有重大 意义的关键代谢节点和关键酶的代谢控制分析(metaboliccontrol analysis，MCA)；? ②Aiba与Matsuoka于1979年提出的通过测定细胞代谢物 质的流量变化，以拟稳态假设为前提应用数学模型推断细胞内代谢流分布的代谢流分析(metabolic flux analysis， MFA)；? ③1998年Edwards和Palsson提出的基于生理与环境限制的流基分析(flux-based Analysis，FBA)。第四节 生产菌株的改良代谢工程操作的设计思路? ①提高限制步骤的反应速度，如利用代谢工程手段提高 头孢霉素产量的成功；? ②改变分支代谢流的优先合成，如1987年Sano及我国的吴汝平等人通过改变分支代谢流优先合成提高氨基酸的 产量； ? ③构建代谢旁路，如Ariatidou等人通过构建代谢旁路降 低微生物中的乙酸积累；第四节 生产菌株的改良代谢工程操作的设计思路? ④引入转录调节因子，如2000年Vander等人在长春花悬浮细 胞中引入转录调节因子导致吲哚生物碱的大量生成；? ⑤引入信号因子；? ⑥延伸代谢途径，如1998年Shintaini等克隆广生育酚甲基 转移酶通过延伸代谢途径，使广生育酚转化成o―生育酚；? ⑦构建新的代谢途径合成目标产物，如植物合成医药蛋白脑 啡肽、抗原、抗体等； ? ⑧代谢工程优化的生物细胞；? ⑨创造全新的生物体。第五节种子扩大培养目的：为发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。 原因：发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发 酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩 短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机 会。种子扩大培养的任务，不但要得到纯 而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、接 种数量足够的培养物。第五节 种子扩大培养一、 种子扩大培养阶段A： 实验室种子的制备： e.g 产黄青霉菌(P.chrysogonum)原始菌种? 斜面试管 ? 250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 ~28°C ，4~14天 ? 成熟 （在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 °C冰箱保存）e.g. （ Glutamic acid-producer ）固体试管斜面（32 °C ，18~24小时） 小三角瓶培养（摇床）大三角瓶培养（摇床）谷 氨 酸 生 产 菌? e.g.yeast：原始菌种（出发菌种） ? 10mL 麦汁试管 （25 °-27 °C ，3天） ? 250mL 三角瓶培养（25°C， 2天） ? 1000mL 三角瓶培养（25°C， 2天） ? 5-10 L卡氏罐(15 °C-20 °C ，3-5天）B：生产车间种子制备种子罐的作用：使有限数量的孢子发芽、 生长、并繁殖成大量的 菌丝体，满足发酵罐的 需要。（菌体生长和产物形成）。种子罐级数的确定? 种子罐级数是指制备种子逐级扩培的次数。 依据：菌种生长特性 孢子发芽及菌体繁殖的速度 所用的发酵罐的容积。种子罐(seeding tank)的级数 产物的品种 生产规模 工艺条件种子罐级数越少越好：简化生产工艺和控制减少接种带来的染菌机会 e.g. Glutamate fermentation 一级种子扩培 实验室种子 种子罐 发酵罐e.g. penicillin fermentation 实验室种子 一级种子罐二级种子扩培 二级种子罐 三级种子扩培 三级种子罐 发酵罐 发酵罐e.g. Streptomycin fermentation 实验室种子 一级种子罐二级种子罐(Streptomyces griseus)－－灰色链霉菌种龄与接种量：种龄(seed age)指种子罐中培养的种子开始移入下 一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 在种子罐中，培养时间延长－－菌体量增加－－ 基质消耗及代谢产物积累－菌体量不在增加－老化 适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生 长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为适 宜。 过老：生产能力下降，菌体自溶。 过于年轻：前期生长缓慢，发酵周期延长，产物 形成时间推迟，甚至造成异常发酵。接种量(seed volume)指移入的种子的体积和接种后培 养液的体积比。 Antibiotic: 7%-7.5% glu: 1%接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的 时间，使产物形成提前到来。种子多，种子液中含有大量的体外水解酶，有利于对基 质的利用。但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液 粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。 生产菌迅速被占据了整个培养环境，减少染菌机会。制霉菌素生产中，1%比10%效果好，0.1%与1%效果相当。 趋势：采取大接种量及丰富培养基。 如谷氨酸: 大接种量20%, 高生物素。 有的采用双种法: 两只种子罐 一只发酵罐如卡那霉素：双种比单种的发酵单位（fermentation titer unit）提高8%，到达产量 高 峰的 时间提前。倒种法：以适宜的发酵液倒出适量给另一个发酵罐作 为种子。如 链霉素：倒种法比单种法的发酵单位提高12%。二、影响种子质量的因素? 原材料质量如四环素、土霉素生产中配制孢子培养基的麸皮 （wheat bran）、霉菌用的大（小）米、琼脂的牌号的不 同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。 原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的 不同，如微量元素Mg++、Ca++ 、Ba++能刺激孢子的形成。P含 量的多少也影响种子的质量。 氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，加入其他的营养物 （麸皮水解液、豆饼水解液、玉米浆），也对种子质量多少 有些影响。?一般情况：培养基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。种子罐和发酵罐培养基成 分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各成分的数量根据目的各自确定。? 总之，各成分选择得当，才能发挥菌种的特 征，提高产量。? 培养条件 温度、pH值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影 响种子质量。制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量影响很大。如土霉素生产菌种龟裂霉菌的孢子，在北方干燥地区 孢子斜面长的快，在含少量水分的试管斜面培养基下部孢 子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜 面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。一般相对湿度40~45%时孢子数量最多，孢子颜色均匀， 质量较好。培养时间和冷藏时间的影响?如土霉素菌种孢子斜面培养四天左右，即 于4?C冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体自溶， 而培养五天以后冷藏，20天未发现自溶。?链霉素生产菌，斜面孢子在6? C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低8%，比 冷藏三个月降低5%。三、种子质量的控制措施 必须保证生产菌种的稳定性 提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌侵入 ? 菌种稳定性的检查：少量菌种--无菌生理盐水--递增稀释--平板划线培养。挑出形态整齐，孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定 其生产能力。?无菌检查：显微镜观察、种子液进行无菌检验、生化分析。 种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、 异常现象及镜检是否有杂菌。四、 种子质量的判断：考察种子在发酵罐中所表现出来的生产能力。 感官判断：看颜色、问气味理化指标测定：1. pH值 2. 培养基灭菌后的糖、氨基氮 3. 菌体形态、浓度 4 . 产物量5. 残糖浓度6. 酶活力 （如土霉素生产，淀粉酶的活力与发酵单位有 一定的关系）。培养基及其制备培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的的多种营养物质的混合物。 培养基组成 对菌体生长繁殖 产物的生物合成产品的分离精致产品的质量和产量§1 培养基的选择一、培养基的类型和用途天然培养基(complex /undefined medium):合成培养基(defined medium): 半合成培养基(semi-defined medium)：鉴别培养基(differential medium)：选择培养基(selected medium)： 固体培养基（solid medium）：半固体培养基（semi-solid medium）：液体培养基（ liquid medium）： 种子培养基（seed medium ） 发酵培养基（ fermentation medium ）发酵培养基（fermentation medium）：供菌体生长和合成大量代谢产物用的培养基。 要求此种培养基的组成丰富完整，营养成分浓度和 粘度适中，利于菌体生长，又利于合成大量的代谢产物。 发酵培养基的组成要考虑菌体在发酵过程中的各种 生化代谢的协调，在产物合成期，使发酵液pH值不出现 大的波动。 不同的菌体，不同的产品，对培养基的要求是不同 的。不同的发酵产品，培养基的状态、粘度、各成分的 含量也是不同的。但是，基本的营养需求是一致。因此， 应根据不同的情况选择发酵培养基。二、发酵培养基选择的依据?1.根据不同菌种或细胞的特点2.根据不同的用途??3.根据不同的目的4.根据经济效益分析选择培养基 5.根据产物特点??不同的发酵产物，不同的菌种所选择的发酵培养基是不同 的。 白酒 (chinese spirit)发酵：固体发酵培养基； 果酒(fruit spirit)发酵：fruit juice or fruit sauce ； 啤酒(beer) 发酵：麦芽汁(wort)液体培养基； 酒精(alcohol)发酵：淀粉糖化醪(starch mash) ；氨基酸(amino acid)发酵：水解糖液加其他营养成分；柠檬酸(citric acid)发酵：淀粉液化醪(starch dextrinizate mash)；乳酸(lactic acid)发酵：淀粉糖化醪(starch mash) ；甲烷(methane)发酵：复杂的有机废物发酵； 抗生素(antibiotic)发酵： 淀粉糖化醪(starch mash) +豆饼粉+麸皮粉；三、发酵培养基选择的原则：1．必须提供合成细胞和发酵产物的基本成分。 2．有利于提高培养基中产物的浓度，以提高单位容 积发酵罐的生产能力。3．有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。4．尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化． 5．有利于减少培养基原料的单耗。(单位营养物质所合成产物数量多）6．原料价格低廉，质量稳定，取材容易。 7．所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影 响，利于提高氧的利用率降低能耗，并尽可能减少产生 “三废”的物质。培养基成分应考虑的因素组分（包括这些组分的来源和加工方法）配比缓冲能力 粘度 消毒后营养破坏的程度 原料的杂质含量对菌体生长和产物形成有影响。目前参照经验配方，结合所用菌种和产品的特征， 采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，进行逐个单因子试 验，观察因子对菌体生长和产物合成量的影响。再综合 各因素的影响，采用正交试验或均匀设计得到一个适合 该菌种的生产配方，以获得高产。四、配制培养基应注意的问题１．考虑碳源、氮源时，要注意快速利用碳／氮源和慢 速利用碳／氮源的相互配合，发挥各自优势，避其所短。 ２．选用适当的碳氮比。C源做为C架又做能源，碳源较氮源多。过多，容易形成较低pH。 不足，菌体衰老和自溶。N源作营养和氨基的来源 过多，菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利 于代谢产物 的积累。不足，菌体繁殖量少，从而影响产量。培养基的碳氮比碳氮比不当，影响菌体按比例地吸收营养物质，直接影响 菌体生长和产物的形成。 根据元素组成：酵母菌的碳氮比约为100?20；霉菌的碳氮 比约为100?10。一般发酵工业的碳氮比约为100 ? 0.2~2.0，但在氨基酸发酵中，碳氮比就高。如谷氨酸发酵C:N=100:15~21，若碳氮比为 100:0.2~2.0，则会出现只长菌体，而不产谷氨酸的现象。 C/N随碳水化合物及氮源的种类以及通气搅拌等条件而异， 很难确定统一的比值。Q：谷氨酸发酵的碳氮比为什么与其它发酵工业不同？3．要注意生理酸性盐、生理碱性盐和pH缓冲剂的 加入和搭配。生理酸性盐：如(NH4)2SO4为氮源时，由于NH4+被吸 收，而造成培养基pＨ降低。 生理碱性盐：如以KNO3为氮源时，由于硝酸根被利 用，会引起培养基pＨ值的升高。在生产中，采用NH4NO3作为氮源，但NH4 +和NO3并不是等速被微生物吸收， NH4 +吸收较快， NO3- 随后 才吸收。 工业生产中常用无机氮源有氨水或尿素作为氮源。尿素被菌体的脲酶分解产生氨，提供菌体的氮素营 养。五、培养基的设计与优化?“正交试验设计” ①根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；②根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头， 并安排实验； ③根据正交表给出的实验方案，进行实验； ④对实验结果进行分析，选出较优的“实验”条件以及对 结果又显著影响的因子。一般来讲，对实验结果的分析有两种 方法：极差分析法和方差分析法。Q: 培养基设计在发酵过程优化的地位和作用?响应面分析法(response surhce analysis将数学与统计学结合起来，采用了合理的实验设计，能以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，科学地提供局部与整体的关系，从而取得明确的、有 目的的结论。响应面分析方法以回归方法作为函数估算的工具，将多因子实验中因子与实验结果的相互关系，用多相式 近似，把因子与实验结果(响应值)的关系函数化，依此 可对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间、因子 与因子之间的相互关系，并进行优化。§2 工业发酵培养基碳源：供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞 以及代谢产物的基础。氮源：主要构成菌体细胞物质和代谢产物，即蛋白质、 氨基酸等之类的含氮代谢物。功能：构成菌体成分；作为 酶的组成分或维持酶的活性；调节渗透压、pH值、氧化还 原电位等。 无机盐：铅、镁、硫、磷、钾、钠、氯、锌、钴、锰。 特殊生长因子：其功能是构成辅酶的组成分，促进生 命活动的进行。如生物素、硫胺素、肌醇等，但需要量是 极少的。 水：营养物质必须溶解于水中，才能透过细胞膜被微 生物利用。诱导剂、前体和促进剂：胞外酶合成需要诱导物、有 些需要促进剂，抗生素需要前体。糖蜜一、工业常用的碳源??????葡萄糖：纯葡萄糖、水解淀粉 乳糖： 纯乳糖、乳清粉 淀粉：大麦、花生粉、燕麦粉、黑麦 粉、玉米、野生植物、薯类等 蔗糖：甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、 精白糖 糖蜜：糖厂的下脚 醋酸、乙醇、亚硫酸纸浆废液、食品工厂的下 脚、农作物秸秆等等。糖蜜（molasses)是制糖厂生产糖时的结晶母液，是 糖厂的副产品，含有丰富的糖、氮素化合物和无机盐、 维生素等，它是微生物工业物美廉价的原料。在工业 生产中，常将糖蜜进行处理，用于生产过程。 糖蜜中主要含有蔗糖，总糖含量可达50%~70%。 糖蜜分为甘蔗糖蜜(cane molasses)和甜菜糖蜜 (beet molasses) ，二者在糖的含量和无机盐的含量都有所不 同，使用时应注意。 糖蜜常用在酵母和丙酮丁醇的生产中，抗生素等 微生物工业也常用它作为碳源。 酒精工业中若用糖蜜代甘薯粉，则可省去蒸煮、制 曲、糖化等过程，简化了酒精生产工艺。e．g． Alcoholic fermentation（C6H12O５）n C6H12O6 水解 发酵 n C6H12O6 2 C2H5OH+2 CO2 + Q所以 100Kg 淀粉理论上可以产酒精量 X= 2 ? 46 ? 100/162=56.79 Kge．g． Glutamate fermentation（C6H12O5）n C6H12O6 水解 发酵 n C6H12O6 C5H9O4N+ CO2 +H2O + Q所以 100Kg 淀粉理论上可以产谷氨酸的量 Ｙ＝1 ? 147 ? 100/162=90.74 Kg 培养基成分用量的多少大部分根据经验而来。但对于主产物代谢途径清楚的物质如酒精，可通过物料平衡计算加以确定。次级代谢产物生物合成途径了解有限，化学计算比较困难 , 可根据物料平衡计算了碳源转化为青霉素的得率.Cooney(1979)根据化学反应计量关系和经验数据得出下式:10 C6H12O6 +12NH3+3O2+6H2SO4+6C8H8O12（苯乙酸） ６C１６H１８O４N4S+12CO2+54H2O 青霉素的理论得率为每克葡萄糖得1.1克青霉素G． 在确定培养基碳源数量时，还应考虑用于菌体生长所需的 消耗及氮源的来源、加工方法和有效成分的含量。 制备培养基，也应考虑水分。 培养基用量大，应就地就近选用廉价原料。 e．g． Lys 发酵培养基的碳源由山芋淀粉改为山芋粉，成 本降低15％。山芋粉中还有生物素、镁盐等。二、工业生产的氮源??无机氮源 尿素、硫酸铵、硝酸铵等 有机氮源 豆饼粉(soybean cake powder)、 花生饼粉(peanut powder)、 麸皮或麸皮水解液(bran hydrolysis liquid)、 玉米浆(corn steep liquor)等。 根据：现有的工艺条件 菌种生长和合成产物时pH的变化 最适pH的控制范围综合考虑选用生理酸／碱性物质及用量，从而保证在整个发酵过程中pH都能维持在最佳状态。三、 生长因子（growth factor）生物素（biotin） 维生素（vitamin） 甘油（glycerol） 氨基酸（amino acid）0 油酸（oleic acid） 嘌呤（purine） 吡啶 (pyridine) 麸皮水解液(bran hydrolysis liquid 其他农副产品 玉米浆(corn steep liquor) 糖蜜（ molasses ）四、前体物质、促进剂、抑制剂前体（precursor）：指某些化合物加入到培养基中， 能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物中去，而其自 身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而 有较大的提高。 e.g. 青霉素发酵中加玉米浆（corn steep liquor），发 酵单位（ fermentation titer unit）由20?g/ml提高到100 ?g/ml 。 玉米浆中含有苯乙胺，它被优先结合到青霉素分子中去， 从而提高产量。有些前体物质，例如苯乙酸、丙酸等浓度过高时，对菌 体会产生毒性。有些菌体还有将前体氧化分解的能力。在生产中常采用少量多次地加入前体， 总添加量按等 摩尔计算，但应考虑菌体氧化、分解的那部分前体。发酵生产中常用的前体产物青霉素Ｇ青霉素Ｖ 金霉素 链霉素 红霉素前体苯乙酸及衍生物苯氧乙酸 氯化物 肌醇、精氨酸 丙酸、丙醇?产物VB12葫萝卜素 L-异亮氨酸前体钴化物?-紫罗兰酮 ?- 氨基酸???????L-色氨酸L-丝氨酸邻氨基苯甲酸甘氨酸??抑制剂（inhibitor）： 在发酵过程中能产生抑制作用的物质在发酵过程中加入某些抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一个代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或使正常 代谢的某一中间物积累起来。e.g.微生物发酵法生产甘油。在发酵液中加入亚硫酸氢纳，它与代谢过程中产生的乙醛生成加成物，反应式如下： CH3CHO+NaHSO3 CH3 CHOSO2Na OH这就使乙醇代谢途径中的乙醛不能成受氢体，而使NADH在细胞中积累，从而激活? -磷酸甘油脱氢酶的活性，使磷酸二羟基丙酮取代乙醛作为NADH 的受氢体，而还原为 ? - 磷酸甘油，其水解后即形成甘油。亚硫酸氢纳是乙醇代谢的抑制剂，促使甘油形成。溴化剂能抑制金霉素形成的代谢途径，促使四环素的生 成。促进剂(promoter)：既不是营养物，又不是前体，但 却能提高产量的添加剂。巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉素生产 菌自溶推迟，延长产物的分泌期。 酵母甘露聚糖可诱导 -甘露糖酶的产生，促使甘露糖 链霉素转化为链霉素(streptomycin)。 控制生物素(biotin)的量，可以促使谷氨酸从细胞内分 泌到细胞外。 聚乙烯醇衍生物可防止菌丝结球，提高糖化酶 (saccharifying enzyme)的产量。 表面活性剂(surface active agent) ：在底物和产物均 不溶或微溶于水的发酵中，表面活性剂有增加渗透性 (perviousness)、促使固体物分散从而强化传质和传氧的作 用。Q：1、前体、抑制剂、促进剂、生理酸性盐和生理碱性 盐的概念及作用。2、发酵培养基配制的原则？如何控制培养基碳氮比？3、培养基的组分对发酵有何影响？配制时应注意哪些问题？§3 淀粉水解糖的制备意义：很多微生物都不能直接利用淀粉(amylum)、纤维素 (cellulose)、酪蛋白(casein)，因为它们不含淀粉酶和糖化酶 。 发酵生产之前，必须将淀粉水解为葡萄糖。 将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化（淀粉水解糖的质量对菌体的生长和产物的形成均有重要 saccharification ），制得的糖液叫淀粉水解糖。的影响。 Q： 如何提高淀粉的出糖率，保证水解糖的质量？淀粉水解糖液必须达到的指标??? ? ? ? ? ? ?1. 糖液葡萄糖含量：90%2. 糖液洁净，呈杏黄色或黄绿色3. 透光率：90%以上 4. 糖液不含糊精(dextrin) 5. 糖液不能变质 6. 转化率：90%左右转化率=水解糖液数量（升）?含糖量（% ） ?100% 投入淀粉量（公斤） ?原料淀粉中含纯淀粉% ? 1.11一、淀粉水解糖制备的方法淀粉原料原料淀粉的性质和水解使用的催化剂(catalyst)酸解法（acid hydrolysis process) 水解的方法 酶解法( enzymatic hydrolysis process)酸酶结合法(acid- enzymatic hydrolysis )葡萄糖（glucose） 淀粉水解糖液 麦芽糖(maltose) 复合糖类（二糖、低聚糖等） 其他分解产物（氨基酸、脂肪酸等）? 酸解法：以酸(无机酸或有机酸)为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。?优点：生产方便、设备简单、水解时间短，设备生产能力大?缺点：高温高压、酸性条件、过程复杂、副反应多、损失大?要求：淀粉颗粒不宜过大、大小要均匀。淀粉乳浓度 也不宜过高。??酶解法：利用专一性很强的淀粉酶和糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。 淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下完成的，故酶解法又有双酶水解法(double-enzyme)之称。?优点：酶反应条件温和，不需要高温、高压和耐酸的设备；酶 的作用专一性强，淀粉水解的副反应少，水解糖液纯； 可在较高的淀粉乳浓度下水解；可用粗原料；糖液颜色浅，较纯净、无苦味、质量高。?缺点：酶解时间长、需要专门的设备，酶是蛋白质，易引起糖 液过滤困难。 液化（liquefaction/dextrinization):淀粉转化为糊精及低聚糖 糖化(saccharify): 糊精及低聚糖进一步水解为葡萄糖? 酸酶法：是先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解为葡萄糖的工艺。?如玉米、小麦等谷物原料的淀粉，淀粉颗粒坚硬，所以液化采用酸法。?淀粉G值（DE值）10-15中和糖化?优点：酸液化速度快，糖化时可采用较高的淀粉乳浓 度。?酶酸法：是将淀粉乳先用 淀粉酶液化到一定的程度，然后用酸水解成葡萄糖。?如碎米淀粉，若用酸水解，往往水解不均匀，出糖 率低。?优点：可采用粗原料淀粉，淀粉浓度（13Be'）较酸法（10Be' ）高，生产易控制。时间短，淀粉水解副反 应少。二、 淀粉酸 水解的原理淀 粉直链淀粉(amylose)：?- 1，4葡萄糖苷键缩合，聚合度小。支链淀粉(amylopectin)： ?-1，4键、?- 1，6键，聚合度大。淀粉水解过程的变化： 淀粉颗粒结构破坏，糖苷键断裂，其分子逐渐 变小。先变成糊精、低聚糖、麦芽糖，最后才能生成 G。 糊精：若干种分子大于低聚糖的碳水化合物的总称。 具有还原性、旋光性、能溶于水，不溶于酒精，因分子大小的不同，糊精与碘可呈现不同的颜色。淀粉 ? 糊精（兰?暗紫? 紫? 红褐? 暗红? 红? 浅红）A 淀粉的水解反应淀粉水解总的趋势是大分子向小分子转化，随着淀粉 水解程度的增加，糖化液的还原性不断增加。 淀粉(amylum) 糊精(dextrin) 糖(oligosaccharides ) 葡萄糖(glucose) 淀粉水解的化学反应可简单表示如下： （C6H10O5)n+nH2O n (C6H12O6) ？ 低聚理论上，淀粉转化为葡萄糖的转化率为180.16/162.14 ?100%=111.1% 实际转化率只有90%。 当葡萄糖值超过60时，由于G复合分解反应产生其他有 味物质（龙胆二糖有苦味）及有色物质。B淀粉的水解反应动力学(kinetics)amylum? 淀粉的水解反应 watercatalyst该反应属于单分子一级化学反应类型。(why?) 其反应速度常数K推算：一级化学反应的速度与浓 度成正比关系。 则 -dc/dt ?C即 -dc/dt=KC? ? ? ? ? ? (1)K---为反应速度常数 C---为表示淀粉的浓度若用c0---水解开始的浓度, t---时间ct ---t时间消耗的浓度（ c0 - ct）---经过t时间后，所剩下的未起反应的浓度则(1)为： -d（ c0 - ct ）/dt＝ K（ c0 - ct ）即d ct /dt＝ K（ c0 - ct ） ? ? ? (2)d ct /dt－－淀粉水解反应速度表示在任何时间，水解速度等于反应速度常数Ｋ与（ c0- ct ）浓度的乘积。将(2)积分得（浓度从0到ct ，时间从0到t） ： Ｋ＝2.303/ t{ lg(c0 / c0 - ct)}实验测定 c0 、c0 - ct 、t的数值代入上式，即可求的反应速度常数。水解反应速度常数Ｋ与下列因素有关Ｋ＝? ? ?? ?? ? ?------催化剂的活性常数， HCl 的氢离子能100%的解离， ?=1； H2SO4， ?=0.5~0.52；H3PO4， ?=0.3；HAC， ?=0.025? HCL是一种良好的催化剂。 ?------酸的当量浓度。 Ｎ越大，则Ｋ越大，但实际酸的浓度不可能太 大。?水解常采用稀酸。?-------多糖的水解性常数，可衡量多糖水解的难易程度。 棉花(cotten）为1； 淀粉(amylum)为400； 蔗糖(sucrose)为100000。 ?------温度对水解速度影响的常数。即在水解过程中，温度可加速淀粉水解反应的进行。例如：0.1%盐酸水解淀粉 温度 K值 119°C 0.125 133 °C 0.470 138 °C 0.77 143 °C 1.2C淀粉水解的副反应? 葡萄糖的复合反应水解 淀粉 热、酸 葡萄糖 糖苷键聚合 ? -1，6键聚合成龙胆二糖 ? 葡萄糖的分解反应 水解 淀粉 乙 葡萄糖 热、酸 分解 5-羟甲基糠醛 甲酸、 ?-1，6 键聚合成异麦芽糖酰丙酸、有色物质。 在淀粉的酸水解过程中，葡萄糖因分解损失的量在1%，但 5-羟甲 基 糠 醛是 产 生 色 素 的 根 源，增加精制的困难。 5-羟甲基糠醛 的含量高，则色素的形成量增多。淀粉酸水解的反应 淀粉（amylum） 酸水解葡萄糖（glucose）复合反应 分解反应（disaccharide）复合二糖5-羟甲基糠醛oligosaccharide )复合低聚糖有机酸、有色物质酸水解过程中的反应：淀粉的水解反应 葡萄糖的复合分解反应是Q：如何控制水解条件，降低复合分解反应的发生？D淀粉酸水解的工艺流程淀粉 水 盐酸 中和脱色 原料 调浆冷却酸水解过滤除杂糖液淀粉酸水解条件的选择1. 淀粉的质量?酸法水解的重要特点是非专一性。表 2-1项目 水分酸水解对淀粉质量的要求指标(%) 11~14 0.3~0.5 0.01~0.02总蛋白质 水溶性蛋白质脂肪粗纤维0.04~0.060.01`0.022. 淀粉乳浓度的选择：?淀粉乳浓度低，DE值高，色泽浅。浓度高，复合反应易发生，色泽深。淀粉乳浓度与水解糖液DE值之间的关系 浓度（°Bx） 26 DE值 93.01 24 22 20 19 18 17 1689.17 89.27 89.92 91.1 91.3 92.77 92.81从表中可以看出，随着淀粉乳的浓度下降，DE值上升，表明糖液中杂质少，淀粉乳的浓度过低，则设备利用率降低。 故淀粉乳的浓度在18~19 °Bx(10.5~12 Be' )3.酸的种类和用量：? ? ?盐酸(hydrochloric acid)：催化效能为 100 硫酸(sulphuric acid) ：催化效能为 50.35 草酸(oxalic acid): 催化效能为 20.45?一般用盐酸，其量占干淀粉的 0.6～0.7%，pH 调至 1.5左右。４.糖化压力和时间２.５--２.８公斤／cm2 水解１５?--２０?排气一般压力为注意：保持正压取样时，保证能代表釜内液体的浓度 及时放料（５－１０分钟放完）５. 糖化设备结构的影响糖化锅的容积不宜过大 , 一般70--80m3, 蒸汽锅体不能太高或太矮。 常采用的径高比（aspect ratio）1：1.5糖化锅的附属管道也应保证进出料迅速，物料受热均匀，有利于升压，有利于消灭死角，尽量缩短辅助时间。6.糖化终点的控制从糖化曲线可以看出, DE值到达最高点后即不在( 葡 萄 糖 纯 度 %)10090 80 70 60A B C上升，相反会随着糖化时间的延长而稍有下降。(why?). 糖化终点的检验： 用无水乙醇检验无 白色沉淀或碘液检验无色，15 20 30时间(分)即为终点 。淀粉酸糖化的曲线F水解糖液的中和、脱色除杂1.中和：目的是降低酸度；除去蛋白质中和剂 纯碱： 温和，糖液质量好，但产生的泡沫多，难控制 烧碱： 易造成局部过碱，使糖焦化，产 生焦糖 中和时注意 ?C 不要反中和，边中和边测定pH值,温度在80 ?C以下,一般控制60- 702.脱色除杂?活性炭吸附法用量： 相当于干淀粉量的0.6～0.8％ 脱色温度: 65 ?C pＨ值: 4.6~5.0 离子交换法 新型磺化煤? ?3. 过滤脱色后要进行过滤，其目的是除去中和、脱色糖化液中凝 聚的蛋白质及其他不溶性杂质和加入的脱色剂，以制得澄清的 糖化液。发酵工业中糖化液的过滤通常是用板框过滤机。过滤 后再调节糖液的pH值至6.7 ~ 7.0。?四、 酶法制糖的理论基础及工艺酶法制糖工艺是以作用专一性的酶制剂作为催化剂 将淀粉转化为糖的工艺。1. ?－淀粉酶的水解作用淀粉 液化液 ?－淀粉酶能水解淀粉及其产物中的1．4-糖苷键，不能水解? -1．6-糖苷键，但能越过? -1．6-糖苷键继续水解?-1．4-糖苷键，而将?-1.6糖苷键留在在水解产物中 。 直链淀粉: 葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖。?-淀粉酶的性质?①热稳定性 在60?C以下较为稳定，超过60?C，酶明显失 活；在60?C~90?C之间，温度升高，反应速度加快，失活也加快。?②作用温度 最适作用温度为60?C~70?C，耐高温酶的最适 作用温度90?C~110?C。?③pH稳定性 在pH6.0~7.0时较为稳定，pH5.0以下失活严 重。最适pH为6.0。?④与淀粉浓度的关系淀粉乳的浓度增加，酶活力的稳定性提高。?⑤钙离子浓度对酶活力的影响?-淀粉酶是一种金属酶，每个酶分子至少含有一个钙离子，有的可达 10个钙离子，钙离子使酶分子保持适当的构想，从 而可维持其最大活性与稳定性。?另外，在钙离子存在的情况下，酶活力的pH范围广。2. 淀粉酶液化条件及程度控制? 淀粉的糊化与老化淀粉的糊化是指淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失， 互相接触变成湖状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现 象。 淀粉的老化实际上是分子间已断裂的氢键、糊化淀粉又重新 排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶的过程。 发生糊化现象时的温度称糊化温度。不同原料的糊化温度范 围不同。在酶法糖化时， ?－淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作 用，使淀粉很难液化，因此，必须采取相应的措施控制糊化淀粉 的老化。 淀粉的老化程度可通过冷却时形成的凝胶体强度来表示。?淀粉液化的方法与选择一次加酶液化法 加酶的方法 二次加酶液化法 三次加酶液化法 酶耐温性 中温酶法高温酶法高温-中温酶法 原料粗细 淀粉质原料直接液化法 精制淀粉液化法 加热的方式 低压蒸汽喷射液化法常温液化法液化方法的选择?淀粉液化效果：液化液均匀程度、蛋白絮凝、液化液的稳定性等?液化原料的特点：蛋白含量、不溶性淀粉颗粒、老化的凝胶强度?生产条件的差异：蒸汽压力及稳定性液化液的用途：?一般使用耐高温的淀粉酶，采用二次加酶法，低压喷射液化。? 蒸汽喷射液化工艺及条件该工艺的特点是利用喷射器将蒸汽 直接喷入淀粉乳的薄膜，在短时间内通过 喷射器快速升温至要求的温度， 完成糊 化、液化。此法液化效果好，蛋白质等杂 质凝结在一起，“不溶性淀粉颗粒”在高 温下分散，从而使所得的液化液既透明又 易于过滤，淀粉的出糖率也高。?二次加酶液化工艺流程淀粉 水 碱液 0.15%氯化钙 耐高温?-淀粉酶（2/3酶）pＨ喷射液化器 95~97?C5.0~7.0保温液化（60分种）二次喷射（145 ?C ，3~5分钟）二次液化罐（95~97 ?C ） 加入耐高温淀粉酶（加1/3酶， 30分钟） 碘液检验后结束液化。 液化条件：30％－40％的淀粉乳浓度、pＨ值5―7、 95 ?C － 97 ?C。 淀粉酶的加入量，随着酶活力的高低而定，但一 般控制在5－8单位／克淀粉。液化程度控制在液化过程中，淀粉液化水解成较小的分子。液 化程度不能太低，因为：Ａ 液化程度低，液化液的黏度就大，难于操作； 液化程度低，淀粉易老化，不利于糖化，特别会使糖 化液的过滤性较差； Ｂ 葡萄糖淀粉酶属于外酶，水解是由底物分子 的非还原末端开始，底物分子越小，水解的机会就越 小，因此会影响到糖化的速度；Ｃ液化程度高，不利于糖化酶与底物的结合．Q:液化程度对酶法糖化有什么影响？为什么要控 制液化的程度？液化程度也不能太高，因为：葡萄糖淀粉酶是先与底物分子生成络合结构，而后发生水解作用， 使葡萄糖单位逐个从糖苷键中裂解出来，要求底物 分子有一定的大小。液化超过一定程度，不利于糖 化酶生成络合结构，影响催化效率，使糖化液的最 终ＤＥ值偏低。 正常液化条件下，控制ＤＥ值在10－20之间为 好。3. 糖化酶的水解作用?糖化酶对底物作用从非还原末端开始将? -1.4和? -1.6糖苷键水解,也能水解麦芽糖。? ? ? ? ?必须控制糖化酶的用量和底物的浓度。 糖化的温度pＨ值决定于所用的糖化剂的性质。 曲霉糖化酶：一般温度为60 ?C， pH4.0~5.0； 根酶糖化酶：一般温度为55 ?C， pH5.0；大生产中，根据酶的特征，尽量采用较高的温度和较低的pH值？Q :国外在糖化生产中加入葡萄糖苷酶？４.糖化工艺条件及控制液化液灭酶（100 ，10分钟)－－用酸调pH值4.24.5 ，同时降温冷却 60 ?C－－ 加糖化酶保温数小时 －－用无水酒精检验无糊精存在时－－加热90 ?C －－保温30分钟--降温60~70 ?C过滤－－糖液。液化液的糖化与酶制剂的用量有关。用量与酶活 力有关。酶活高，用量少；液化液浓度高，加酶量多。 生产上：３０％淀粉时，酶量按８０－１００单 位／克淀粉。低压蒸汽二次喷射液化糖化的工艺流程1-调浆配料罐 2.8-过滤器 4.10-喷射加热器 5-缓冲器 6-液化层流罐 7-液化液储罐 11-灭酶罐 12 板式换热器13 糖化罐 15 压滤机 16糖化暂贮槽 18 贮糖槽五、淀粉水解糖的质量对发酵的影响?若淀粉水解不完全，有糊精存在，不仅造成浪费，而 且糊精存在使发酵过程中产生大量泡沫，影响发酵正 常进行，甚至引起染菌的危险。?若淀粉水解过分，葡萄糖发生复合反应生成龙胆三糖、 异麦芽糖等非发酵性糖，葡萄糖还会发生分解反应生 成羟甲基糠醛，并进一步与氨基酸作用生成类黑素。 这些物质不仅造成浪费，而且还抑制菌体生长。?若淀粉原料中蛋白质含量多，当糖液中和、过滤时除去不彻底，培养基中含有蛋白质及水解产物时， 会使发酵液产生大量泡沫，造成逃液和染菌。 淀粉原料不同，水解工艺条件不同，水解糖液中含 生物素量不同会影响发酵过程中生物素量的控制。??Q: 淀粉水解糖考核的指标有哪些？§4?糖蜜原料? ?糖蜜原料的分类 甘蔗糖蜜（beet molasses） 甜菜糖蜜（cane molasses） 高级糖蜜（high test molasses） 糖蜜原料的性质和组成 糖蜜的预处理 一般处理：澄清处理，除去灰分和胶体物质 特殊处理：降低生物素，甘蔗糖蜜生物素高Q: 简述不同发酵产品糖蜜的预处理方法§6 其他物质?? ? ? ? ?农作物纤维下脚料； 森林和木材工业下脚料； 工厂纤维和半纤维素下脚料； 城市生活纤维物质； 亚硫酸盐废液； 食品工业的下脚； 这些物质均可经过一定的处理用于 发酵产品的生产。Q: 生物炼制？生物炼制?利用农业废弃物、植物基淀粉和木质纤维素材料为原料， 生产各种化学品（乙烯、乙醇、丙烯酸、丙烯酰胺、1,3-丙二 醇、1,4-丁二醇、琥珀酸 ）、燃料（沼气、乙醇汽油、生物 柴油 ）和生物基材料（PLA、PTT、尼龙工程塑料 ）和生物 可再生原料的修饰（大豆蛋白改性纤维）等。 。 美国国家再生能源实验室（U.S. National Renewable Energy Laboratory, NREL）将生物炼制定义为以生物质为原?料，将生物质转化工艺和设备相结合，用来生产燃料、电热能和化学产品集成的装置。生物炼制?未来的生物炼制将是生物转化技术和化学裂解 技术的组合，包括改进的木质纤维素分级和预处理 方法、可再生原料转化的反应器优化设计、合成、 生物催化剂及催化工艺的改进。?由木质素纤维制工业乙醇的生物炼厂正在开发上述技术，乙醇将成为高级生物炼制的主产品。生物炼制?根据近来研究开发的不同情况，生物炼制分为：①木质纤维素炼制：用自然界中干的原材料如含纤维 素的生物质和废弃物作原料； ②全谷物炼制：用谷类或玉米作原料； ③绿色炼制：用自然界中湿的生物质如青草、苜蓿、 三叶草和未成熟谷类作原料。 根据美国生物质规划，能源部将在2010年建成??第一座基于农业废弃物的大规模综合性生物炼厂。?生物炼制模型 用稀酸预处理，再用过量石灰解毒，此工艺 产生大量废渣，最近美国NREL有中试厂改进了此 工艺过程，还有一些工艺极具工业化应用潜力，其 中欧洲和加拿大的蒸汽裂解原来是用于纸浆厂。 还有一些玉米转化技术可望组合到这类全玉米生物炼制模式中，其中有些技术已在工业规模上实施，处于不同的技术阶段，相关技术大致有以下几 种：?*糖平台技术：从木质纤维素生物质分离出糖。 用稀酸水解半木质素纤维生成5碳糖和6碳糖，但其副产品对发酵微生物有毒。?*发酵技术：将糖或混合糖转化生成燃料和化学 品，已开发了转化混合糖为乙醇的酶，用基因组合方 法可以有效地转化水解玉米淀粉在有氧条件下生成 PDO。?*研磨技术可以粉碎玉米芯，生成糖，同时开发了淀粉液化和糖化技术。?我国生物质资源的来源主要是哪些？ 现代的生物质产业概念，是指利用可再生的有 机物质，包括农作物、树木等植物及其残体、畜禽 粪便、有机废弃物，通过工业加工转化，进行生物?基产品(Biobasedproducts)、生物燃料(Biofuels)和生物能源(Bioenergy)生产的一种新兴产业。?我国每年有7亿t作物秸秆、2亿t林地废弃物、25亿t畜 禽粪便及大量有机废弃物，另外每年有1000多万公顷农田 因覆盖石油基塑料地膜而导致土壤肥力衰退，尚有1亿多 公顷(稍少于现耕地面积)不宜垦为农田，但可种植高抗逆性能源植物的边际性土地。?这些农林废弃物和边际性土地，对生物质产业而言，是一 笔宝贵的物质财富。--欧阳平凯?根据我国生物质资源的特点和技术潜在优势，可以将 燃料乙醇、生物柴油、生物塑料以及沼气发电和固化成型 燃烧作为主导产品。 如果能利用全国每年50%的作物秸秆、40%的畜禽粪便、 30%的林业废弃物，开发5%（约550万公顷）的边际性土地 种植能源植物，建设约1000个生物质转化工厂，那么其生 产能力可相当于5000万t石油的年生产能力，即一个大庆 油田(年产4800万t)。??而且每增加1000万公顷能源植物的种植与加工，就相 当于增加4500万t石油的年生产能力，可见生物质产业的 潜力之大。§7 培养基的灭菌与空气净化第一节 培养基的灭菌一、灭菌的意义和方法:干热灭菌与湿热灭菌 区别 在哪？ 空罐灭菌与实罐灭菌 过滤灭菌与化学药剂灭菌 间歇灭菌与连续灭菌Q: 消毒与灭菌的概念及区别二、 湿热灭菌的原理?基本要求：杀死培养基中混杂的微生物， 满足纯种培养的要求。Q:湿热灭菌为什么效果好？1. 微生物的热阻热阻相对热阻概念致死温度 致死时间2. 微生物的热死规律－－对数残存规律加热－－微生物失活－－酶、蛋白质变性－－杀死 培养基中微生物受热死亡的速率与残存的微生物数 量成正比即：dN/dt = － KN式中： N--- 培养基中残存的活菌数（个） t－－受热时间（min) K－－反应速度常数（min-１)（比死亡速率）微生物减少的速度与任一瞬间残存的 菌数成正比； 在一定温度下，比死亡速率Ｋ值，随 为微生物不同而不同。在相同温度下， Ｋ值越小，微生物越耐热。 同种微生物在不同温度下灭菌K值不 同。灭菌的温度越低，Ｋ值越小。?从0→t, No → Nt积分得t ? dN ? ? ? ?k ?0 dt ?N0 ? ? N ? NtNt ? N0e? ktN0 1 t ? ln k Nt----对数残存定律2.303 N 0 t? lg k Nt灭菌的时间 污染的程度（No）灭菌的程度（Nt）k值t ：表示理论灭菌时间一般只用于工程计算中，在实践过程中，因蒸汽的 压力问题（不稳定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚 至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素， 都会影响灭菌效果实际生产中，通常采用 经验数值：间歇灭菌，121℃，20―30分钟 连续灭菌，130℃，20―30s，在 维持罐 中保温6-8分钟。?N0 ： 芽孢性细菌总数 + 芽孢数对于如何Nt取值？ 如果取Nt= 0，那么，t → ∞，这显然是与 现实情况不符。通常取Nt = 10-3 Q: 这个数值如何理解？灭菌1000次，有一次是失败的，残留了一 个活菌体。这个数值的取值的大小，也间接反 应了该生产过程中的技术管理水平。?3.培养基灭菌温度的选择(why?)培养基加热灭菌时：杂菌死亡和培养基营养成分破坏灭菌时，微生物的死亡属于一级化学反应类型 在其他条件不变时，反应速度常数与温度的关系遵循 阿累尼乌斯方程Ｋ＝Ａe-E/RT式中：Ａ－比例常数E－杀死杂菌所需的活化能 R－气体常数 T－绝对温度?在灭菌的过程中，伴随微生物的死亡，培养基中的营养成分也遭到破坏。由于大部分培养基的破坏为一级分解反应，其反应动力学方程式为：dc ? ? k ?c dt?式中：c――反应物的浓度，mol/L；t――反应时间，min； k′―营养成分破坏的反应速度常数，min-1dc ? ? k ?c dt?在灭菌的同时，培养基中的营养成分也遭到破坏，其他 条件不变，则反应速度常数和温度的关系可用阿累尼乌 斯方程表示：k ? ? A?e式中：?′――比例常数；? E ? / RTE′――反应所需的活化能,，J/mol； R――气体常数；8.314 J/mol? k； T――绝对温度， K；?在灭菌时，随温度变化，菌体死亡速度常数和培 养基成分破坏速度常数都在变化。当温度Ｔ１升高到Ｔ２时，分别应用阿累尼乌斯公式可得杀灭芽孢的活化能Ｅ大于营养成分破坏的活化能E?。 随着温度的上升，微生物死亡速度提高，且超过了 培养基养成分分解破坏的速度。工业生产中采用高温瞬时 灭菌就是考虑杀死杂菌，而使营养成分破坏减到最低。--k2 ln k1 E ? k '2 E? ln k '1--“高温瞬时灭菌法”的理论依据。三、培养基的灭菌 1. 培养基灭菌的操作连续灭菌：指培养基经过蒸汽灭菌后连续的进入 发酵罐。连续灭菌的流程2连续灭菌的流程3连续灭菌的流程4间歇灭菌： 培养基全部流入发酵罐后，在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，在冷却到接种温度。 升温阶段 保温阶段 降温阶段 空罐灭菌（空消）： A. 洗罐、排出冷却管中冷却水 B. 在0.2MPa下，30分钟，染菌时可延长。 均有灭菌效应发酵培养基实罐灭菌： 先预热90 ℃ ，根据罐容 大小确定，一般121℃， 5-10分钟泡敌实罐灭菌：种子培养基实罐灭菌 A. 进料完毕，核量、 复测pH B. 先夹层预热至90100 ℃ ，再关闭夹层蒸 汽，通内层蒸汽，121 ℃ 30分钟 C. 降温时要通无菌空 气保持罐压0.2MPa防止0.2MPa下保持30分钟尿素罐灭菌：105℃保持5分钟管道灭菌：接种管道、尿素管道、 油罐管道、空气管道， 0.15MPa 40~60分钟。负压产生。2. 影响培养基灭菌的因素培养基的成分 pH值 培养基的颗粒大小 泡沫 培养基微生物的数量 微生物细胞的含水量和耐热性 菌龄 空气排除的情况3. 培养基灭菌时间的计算发酵罐装有85m3培养基，121 ?C 灭菌。原污染程度为每mL有2＊105个芽孢菌，有5＊103个一般细菌，灭菌常数为1.8min-1 。4. 连续灭菌的优点? ? ? ?优越性受热时间短营养破坏少 发酵罐利用率高 使用蒸汽均衡，自动化控制 回收冷却水，蒸汽消耗60-70%Ｑ：１.解释：热阻、致死温度、致死时间 ２.试根据对数残存规律，说明如何确定灭菌时间？§8 空气的净化一、通风发酵对无菌空气的要求? ?空气中微生物的分布 空气含菌量的测定 培养法 粒子计数器 发酵对空气无菌程度的要求 将自然界的空气经过压缩、冷却、减湿、过滤等过 程，达到一定的质量指标。?无菌空气的质量要求? ? ? ?1. 无菌空气的压强：0.2-0.4MPa（表压） 2. 相对湿度小于70% 3.空气温度比培养温度高10-30度 4.空气的洁净度，一般取10-3为指标微生物最大允许数 游离菌/m3 5 100 沉降菌个/皿.30min 1 3洁净度 尘埃最大允许数/平方 级别 米 ?0.5um 100
350,000 ?5um 0 20001000003000003,500,00010,500,00020,00061,800500NA1015二、空气净化的方法? ?加热灭菌 辐射杀菌??静电除菌介质过滤除菌布朗扩散运动原理拦截截留作用 惯性撞击截留作用 重力沉降作用 静电吸引三、空气过滤除菌一般的流程?对空气除菌流程的要求流程设备有空压机，附属设备要求尽量采用新技 术，提高效率，减少设备，精简设备流程，降低设备 投资、运转费用和动力消耗，简便操作。 流程的制定要根据所在的地理、气候环境和设备条 件考虑。?流程：空气吸气口→空气粗滤器→空气压缩机→一级空 气冷却器→二级空气冷却器→除油除水→空气贮罐→ 旋风分离器→丝网除沫器→空气加热器→总空气过滤 器→分空气过滤器→无菌空气空气过滤除菌流程1空气过滤除菌流程1空气过滤除菌流程2空气过滤除菌流程3四、空气过滤介质???纸类过滤介质 应用时需将３－６张滤纸叠在一 起使用，过滤效果相当好，但强度 不大。 纤维状或颗粒状过滤介质 棉花、玻璃纤维、活性炭。 微孔滤膜类过滤介质五、介质过滤效率?介质过滤效率是指被介质层捕集的尘埃颗粒与空气中原有颗粒数之比。即：η=(N1-N2)/N1=1-N2/N1=1-PNI-过滤前空气中的尘埃颗粒； N2- 过滤后空气中的尘埃颗粒；η- 过滤效率P- 穿透率六、影响过滤效率的因素及提高 措施??因素 ：介质纤维直径；介质滤层厚度；介 质填充密度；空气流速。 措施：（1）设计合理的空气预处理设备，选择合适的空气 净化流程，达到除油水和杂质的目的。 （2）设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率 高的过滤介质。 （3）保证进口空气清洁度，减少进口空气的含菌数 。 （4）降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过 滤介质能在干燥状态下工作。
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