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原核表达蛋白
原核表达系统是通过原核生物来获得外源蛋白的体系，主要包括：大肠杆菌表达、枯草芽孢杆菌表达、链霉菌表达等，其中大肠杆菌系统应用最为广泛，一般所说的原核系统主要是指大肠杆菌表达。
原核表达服务
原核系统特点
宿主菌生长快，培养简单，操作方便；
价格低廉；
遗传背景清楚，基因安全；
蛋白表达量高。
无法对表达时间及表达水平进行调控；
表达产物的生物活性较低，原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善。
大肠杆菌表达原理：Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后，其蛋白构象就发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，发生转录。详情见
系统优点：遗传背景清楚，成本低，生长快、技术操作简单，培养条件简单。
系统缺点：不能对表达产物进行翻译后修饰，含有大量内毒素，容易形成包涵体。
枯草芽孢杆菌表达
枯草芽孢杆菌是目前芽孢杆菌应用最多的，它转化、转导方式比较完善
枯草芽孢杆菌系统介绍及原理 枯草芽孢杆菌系统优缺点
非致病性，除个别对人体有害；
没有明显的密码子偏爱性，同时表达不容易形成包涵体；
培养简单，细胞壁组成简单无脂多糖，在分泌蛋白时不会混入内毒素；
质粒和噬菌体都可以作为克隆载体；
含有大量蛋白酶，会使目的蛋白降解；
存在限制和修饰系统，质粒分化和结构不稳定；
难形成感受态细胞，并且持续时间短，转化率低，克隆效率低；
链霉菌表达
链霉菌系统介绍及原理
链霉菌系统优缺点
链霉菌表达系统是继大肠杆菌表达系统和枯草杆菌表达系统之后又发现的具有研发价值的原核表达系统，它广泛用于工业生产，其工业规模生产抗生素技术历史悠久。链霉菌不同于大肠杆菌，它们只有单层细胞外壁，可以把蛋白分泌到培养基中，对此已经研究了近10年，每年都有不少相关报道。
致病性小；
链霉菌表达系统中表达的蛋白通常是可溶的；
可使外源基因分泌表达，简化纯化分离步骤；
工业规模发酵技术相当成熟；
外源基因的引入比大肠杆菌复杂；
难以转化或转化率低；
链霉菌表达系统还不够完善；
原核与真核系统比较
原核表达系统
真核表达系统
宿主菌生长快，培养简单，操作方便
可以进行翻译后修饰如糖基化、磷酸化、寡聚体等高级结构的正确折叠
可为分泌型，提纯工艺简单
遗传背景清楚，基因安全
可用为基因药物，辅助疾病治疗
不能对蛋白进行加工修饰
周期相对较长，表达量低，操作繁琐
是否含有内含子
否（表达简单，不能对蛋白修饰加工）
是（可以对蛋白进行加工修饰得到成熟的蛋白）
原核表达系统主要是正调控、负调控
真核表达系统主要是正调控，负调控少
原核蛋白表达高
真核蛋白表达低
磷酸化修饰
乙酰化修饰
γ-羧化修饰
只有哺乳动物有
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&&大肠杆菌表达重组蛋白，包涵体中很多目标蛋白
大肠杆菌表达重组蛋白，包涵体中很多目标蛋白
最近做蛋白纯化，破碎没有问题，上清用镍柱纯化后，发现表达量很低，包涵体中含有大量目标蛋白。求助。这是怎么回事
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扫描下载送金币包涵体及其应对策略；班级：生物化工10级；姓名：张义凯学号：；摘要：在介绍包涵体形成原因、特性及利弊的基础上,；关键词：包涵体；形成；避免；去折叠；蛋白质复性；包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆；在基因重组技术得到迅速发展之前，研究者就已经发现；重组异源蛋白在细菌(大肠杆菌)中高效表达易形成包；在原核表达过程中，包涵体的形成原因
包涵体及其应对策略
班级：生物化工10级
姓名：张义凯
摘要：在介绍包涵体形成原因、特性及利弊的基础上,重点阐述了包涵体的避免方法及复性前准备、主要复性方法。 关键词：包涵体；形成；避免；去折叠；蛋白质复性
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别[1]。 1 包涵体的发现： 在基因重组技术得到迅速发展之前，研究者就已经发现，细胞内人工引入反常的蛋白质（这些蛋白质可以看作是细胞的外源蛋白质），这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。这些蛋白质聚集的形态是明显的球形，这些球形的物质全部是蛋白质，并且通过非共价键的作用力形成，必须使用变性剂如十二烷基硫酸钠（SDS）或者盐酸胍才能溶解。自从基因工程的蛋白质在大肠杆菌表达以后，人们逐渐发现这些外源蛋白质基因在细胞中的过量表达同样形成不溶性的状态[2] 。 2 包涵体的形成及其性质： 2．1包涵体的形成
重组异源蛋白在细菌(大肠杆菌)中高效表达易形成包涵体。此外，由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然的同源蛋白质，有时也可形成包涵体。包涵体的形成有两种模式，其前体物分别为非天然态单体蛋白和寡聚蛋白质。大量的单体蛋白经扩散后聚集在一起形成包涵体，而寡聚蛋白质则既可通过扩散也可被直接转运(依赖于微管)而形成包涵体[3,4]。 2．2包涵体形成的原因 在原核表达过程中，包涵体的形成原因多且复杂，主要原因如下：外源性重组蛋白在高表达时，由于蛋白折叠辅助因子不足，在蛋白折叠之前分子间连接的疏水表面暴露在外面，导致折叠中间体大量堆积，并且这些中间体对蛋白酶的降解有抑制作用；对于大量折叠错误蛋白的出现，重组细菌体内缺乏相应的反应机制来恢复蛋白的正确折叠；促进细胞表达的蛋白多肽的溶解和正确折叠功能的丧失；蛋白或多肽自身结构在热力学和动力学上失衡；一些环境因素(如高温、酸性介质)能明显刺激包涵体的形成，因此控制介质组成成分、培养基和基因表达条件也可以减少包涵体的形成；一般，含硫氨基酸越多越易形成包涵体，脯氨酸含量明显与包涵体的形成呈正相关，因此，通过改变重组蛋白连接区的氨基酸序列可以减少包涵体的形成。 2．3影响包涵体形成的因素 高效表达的重组异源蛋白在大肠杆菌中形成包涵体的影响因素有很多，在此只介绍几个主要方面： 一、温度：提高温度有利于包涵体的形成.较高的培养温度由于加快了蛋白质的合成速度，增加了无活性蛋白质集聚物的形成速度和疏水作用，因此促进了包涵体的形成。 二、表达水平：不管包涵体的形成机理如何，重组异源蛋白的过量表达有利于包涵体的形成，而通过降低表达量来提高异源蛋白的可溶性并不容易奏效。 三、细菌遗传的性状：相同的重组质粒在不同的大肠杆菌菌株中表达异源蛋白，其可溶性与不溶性流分的比例可能不同，有时甚至相差很大。一般来说，大肠杆菌染色体DNA上的热休克基因表达产物(如Hsp，GroEL和PPIase等)有助于重组异源蛋白的正确折叠而形成可溶性流分，同理，灭活这些基因则有可能促进包涵体的形成。 四、异源蛋白氨基酸序列及突变：天然的人γ-干扰素在大肠杆菌中往往以包涵体的形式表达，但通过基因人工合成或定点突变技术改变其天然氨基酸序列，则可获得高比例的可溶性蛋白流分。相反，对于另一些异源蛋白而言，在大肠杆菌中突变体比天然分子更易形成包涵体。有研究报道，突变使蛋白质的热稳定性降低，P22尾棘蛋白突变体随着温度的上升，其生物活性不断地降低甚至完全丧失而最终形成聚集体，且聚集与突变存在着量性效应。突变影响多肽链形成正常的折叠蛋白，它或是减弱蛋白质折叠后的稳定性；或是降低折叠速度，使非天然蛋白质的浓度升高，这样就有利于包涵体的形成。 2．4包涵体的性质 高效表达的重组异源蛋白在大肠杆菌中形成的包涵体大部分存在于细胞质中，在某些条件下，包涵体也能在细胞间质中形成。包涵体基本上由蛋白质组成，其中大部分(占50%以上)是克隆外源蛋白的表达产物，它们具有正确的氨基酸组成，但空间构象往往是错误的，因此没有生物活性。由于包涵体中的蛋白质组成大部分都失去了天然的空间构象，且所有的分子紧密集聚成颗粒状，因此在水溶液中很难溶解，只有在高浓度的变性剂(如烟酸胍和尿素等)溶液中才能形成均相。 2．5包涵体形成的生物学意义 包涵体虽然由无活性的蛋白组成，但包涵体形成对于重组蛋白的生产也提供了几优势：
一、包涵体具有高密度，易于分离纯化；
二、重组蛋白以包涵体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解；
三、对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白而言，包涵体形成无疑是最佳选择。 3 包涵体的研究在蛋白质工程领域的意义 基因工程和蛋白质工程的兴起与发展为人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质成为可能。但在多种重组基因已在原核表达系统中高水平表达，但多以没有生物活性的形式的包涵体存在，这使蛋白质工程的进一步发展遇到了瓶颈。所以研究包涵体的研究（包括形成、性质、避免、复性等）对于解决恢复和利用重组基因表达的蛋白具有重要意义。 4 减少包涵体形成的策略 4．1减少包涵体形成的策略 一、降低重组菌的生长温度：降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。
二、添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。 三、基因人工合成或定点突变：通过基因人工合成或定点突变技术改变其天然氨基酸序列，则可获得高比例的可溶性蛋白流分。 四、供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。 4．2减少包涵体形成的实例分析
Moore等人将T4噬菌体脱氧胞昔酸(dcMP)脱氨酶基因(cd)插入pET3c载体，转化到大肠杆菌pLysS株中，构建了pET3c-pLys S系统。用该系统高效表达T4噬菌体dCMP脱氨酶。导致该酶成为一种无活性包涵体复合物的一部分。作者采用一种增菌培养基能够限制包涵体的形成。作者试验了3种细菌培养基： （ 1 ）M9+cA肉汤(无机盐和酪蛋白氨基酸)。 （ 2 ） TBYE (1 %胰胨，0.50%酵母抽提物、0.8%Nacl及磷酸盐)。 （ 3 ）胰陈-磷酸盐(2%胰胨、1. 5%酵母抽提物、0.8%NaCI及磷酸盐)。 把该系统细胞分别在3种培养基中30度震荡培养，结果表明，30 C时：用胰胨-磷酸盐培养的细胞、诱细胞总抽提物和可溶性组分的酶量相等，说明没有酶在包涵体中积累；用TBYE培养:细胞总抽提物的酶量较可溶性组分多，表明部分酶不溶，存在于包涵体；而在M9+CA中培养的细胞虽能合成大量的酶，但在可溶性组分中却没有出现，说明此时产生的酶几乎全部存在于包涵体中。作者认为，使用增菌培养基可能有助于在其他表达系统增加可溶性蛋白的产量[5]。 5 包涵体的复性 5．1包涵体分离纯化的意义
包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%~95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂。 5．2蛋白质折叠复性的一般原则 包涵体蛋白质折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程的竞争。复性时，最好使蛋白质达到一定的纯度。为减少聚集，蛋白质浓度应很低，一般在10~100 g/L较好。复性应尽量不采用突然改变变性剂浓度的办法，否则会导致折叠中间体的聚集[6]。 5．3复性前准备 5．3．1破菌 基因工程菌发酵液经离心浓缩后，通常使用高压匀化或机械、化学与酶相结合的方法来破碎含包涵体的宿主菌细胞，再通过低速离心或过滤除去破碎液中可溶性蛋白后获得包涵体。包涵体具有高度抗剪切的能力，用上述破碎法破碎后仍可保持完整的结构。另外，为了提高破碎效率，可以加入一定量的溶菌酶。 5．3．2洗涤 为了除去包涵体上粘附的杂质(如膜蛋白或核酸)，应在离心沉淀后用温和去污剂(TritonX2100)和EDTA或变性剂(尿素、盐酸胍等)洗涤。洗涤液通常为低浓度的变性剂，因为过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2mol/L尿素在50 mmol/L Tris缓冲液(pH值7.0~8.5)、1mmol/l EDTA中洗涤。多数情况下，可以通过调整洗涤条件使包涵体中外源蛋白纯度达到90%以上，从中提取的蛋白可以直接用作抗原。 5．3．3溶解 一般用强的变性剂(如6~8 mol/L尿素、6mol/L盐酸胍或强碱)通过离子间的相互作用打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键使得多肽伸展。一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性条件下长期保温时。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等;而对于有些没有二硫键的蛋白，加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶[7]。 5．4包涵体的复性方法 包涵体蛋白的体外复性是基因工程蛋白生产过程中最关键和最困难的一步，三亿文库包含各类专业文献、中学教育、应用写作文书、高等教育、各类资格考试、17包涵体及其应对策略等内容。　
　2、如何得到比较纯的包涵体 对于包涵体的纯化,包涵体的前处理是很重要的。 ...五、包涵体的纯化 复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似,这里不再赘述... 　一、包涵体: 1.1 包涵体的定义、组成与特性: ...加上剧烈的处理条件,使蛋白的高级结构破坏,因此重组...2.2.2.5 其它 提高复性率的策略还有许多,如:非... 　大肠杆菌包涵体表达重组蛋... 4页 免费 包涵体蛋白的分离纯化 3页 免费 包涵体蛋白的变复性研究 6页 免费 包涵体及其应对策略 8页 1财富值 第七章 亲和层析技... 　减少包涵体形成的策略 1、 降低重组菌的生长温度,降低培养温度是减少包涵体形成的...结合溶菌酶处理,然后 g 离心,可使大部分包涵 体沉淀,与可溶性蛋白... 　包涵体形成的机理及防止办法 包涵体形成的机理: 包涵体的形成是一个由许多蛋白质...包涵体及其应对策略 8页 1下载券 包涵体 2页 7下载券 铁酸铜在形成氧缺位体... 　2、如何得到比较纯的包涵体 对于包涵体的纯化,包涵体的前处理是很重要的。 ...五、包涵体的纯化 复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似,这里不再赘述... 　血红蛋白H包涵体染色_计算机硬件及网络_IT/计算机_专业资料。「参考值」 正常人不见血红蛋白 H 包涵体。 「临床意义」 HbH 在 1 小时内即变 性沉淀而产生 HbH... 　2.包涵体的处理 . 洗涤:沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液 包涵体洗涤缓冲液重悬后...组氨酸标签与 GST 相比有许多优点:首先,由 于只有 6 个组氨酸,分子量很小,...关注今日：12 | 主题：401638
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【求助】什么是蛋白包涵体？
页码直达：
这个帖子发布于8年零86天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
文献上总提到"蛋白的表达主要以包涵体形式存在”，请问什么是蛋白的包涵体？
不知道邀请谁？试试他们
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包涵体就是指由于蛋白的空间构象与原来不服，如折叠不对，导致蛋白质的溶解性降低，就会聚集到一起，形成包涵体。通常这类蛋白要先用尿素变性，再通过其他方法复性，回复其本来的构型。
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如果都以这种态度对待科研，还是回家种地去吧。用搜索引擎能解决的问题，就不要拿出来问了。我相信问问题的效率绝对没有自己搜索来的快。
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我认为楼主想知道的是:将许多来自真核生物的基因放到大肠杆菌中表达,而大肠缺乏真核系统翻译后折叠修饰的功能,导致外源蛋白折叠不对,空间构象与原来不符，使蛋白质的溶解性降低，聚集到一起，形成包涵体,大肠杆菌表达外源蛋白常以包涵体形式存在。是这个意思吗
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确实应该自己先搜索。转帖于“包涵体表达的蛋白的复性”。一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。1.2包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。1.2.6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
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学习了···········
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我也学习了一遍
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谢谢，重新学习一遍
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