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Western-blot 实验原理、实验步骤及试剂选择指南
作者：市场部
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Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的常用的方法之一。本文分别介绍western 的实验原理、实验步骤以及试剂选择指南。 &
实验原理：
Western技术是通过后，经PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验步骤：
1.收集蛋白样品
用适当的裂解液处理贴壁细胞、或组织样品。某些特定组分的蛋白的蛋白抽提，请联系欣博盛为您查询。&&
总蛋白抽提试剂盒
total protein extration
Acitve Motif
核蛋白抽提试剂盒
核蛋白/胞浆蛋白抽提试剂盒
线粒体蛋白/胞浆蛋白抽提试剂盒
收集完蛋白样本后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。&
BCA蛋白定量试剂盒
Acitve Motif
蛋白定量试剂盒
2.1 SDS-PAGE凝胶配置
2.2 样本处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
2.3 上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
转膜完毕后，立即将蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗掉膜上的转膜液。吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，4℃封闭过夜。
4. 一抗孵育
吸尽封闭液，加入稀释好的一抗，室温摇床上孵育1小时或者4℃孵育过夜。Western结果通常需要提供内参作为对照。通常选用Tubulin或Actin抗体，进行内参检测。
一抗欣博盛推荐Genetex抗体，GeneTex抗体所含盖的领域从神经学、血液血管学、免疫学、代谢机制、细胞信号传导、干细胞研究、老化、遗传学、感染疾病诊断与研究，乃至于斑马鱼模式动物抗体等，并提供完善的客制化抗体制备服务。目前该公司拥有的抗体总数已逾55,000种，而且每月仍有近百种新型抗体推出。其中，以小鼠单株抗体与兔多株抗体为该公司最具质量与价格优势的产品。网站链接如下：。网站有详细的各个领域的研究资料。
如需订购请联系Genetex全国总代理欣博盛。&
Neobioscience
核蛋白内参抗体
Histone H3.1 antibody
核蛋白内参抗体
Histone H2A.X antibody
膜内参蛋白
NaK ATPase antibody
5. 二抗孵育
吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或者4℃摇床上孵育1小时。SouthernBiotech能够提供多种不同标记的二抗。&
Rabbit IgG antibody (HRP)
抗山羊二抗
抗小鼠二抗
Goat Anti-Mouse IgG(H+L), Rat ads-HRP
Neobioscience
抗小鼠二抗
Neobioscience
6. 蛋白检测
6.1 ECL化学发光，显影，定影
将A和B两种试剂在离心管中等体积混匀；1 min后，将溶液平铺在膜蛋白面，暗室反应2min后去尽残液，包好，放入X-光片夹中。在暗室中显影定影。
6.2 凝胶图像分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目的条带和内参条带的净光密度值以及他们的比值。
关注欣博盛新浪微博&&& 生物通技术专题：既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。Western印迹要想做的好，当然每个步骤都不能马虎，看看这张图，从电泳，转膜，封闭，一抗，二抗到最后的检测，就像“发现号”升空的120万个步骤那样一个也不能少。如果忽视了其中的一步，结果做不出来，也是令人非常头痛的。
&& “工欲善其事，必先利其器”，要想有好的实验结果，好仪器是相当重要的，因此让我们先来看看什么样的仪器能让我们无后顾之忧，顺利痛快的一步到位。&
&&& Western 印迹的仪器主要就是电泳系统和电转移系统了，最好的品牌当然是Bio-Rad和Amersham（GE Healthcare）的Hoefer系列了，现在国内出品的物美价廉的电泳系列产品，也是不错的选择，几乎每个实验室都需要至少一套Mini Cell吧？如果还没有你该怎么挑选呢。
一、Bio-Rad经典Mini系列&&& Bio-Rad Laboratories由 David Schwartz 先生和妻子化学家Alice Schwartz于1957 年创建，总部位于加州 Hercules，下设三大部门――生命科学部，临床诊断部和工业材料部，其中生命科学部成功跻身世界排名前五名。在2004年，Bio-Rad还低价收购了因侵犯知识产权限于困境的MJ Research，使得伯乐在PCR领域的市场份额骤然扩大。Bio-Rad生命科学部产品包括蛋白组研究产品、层析仪与填料、蛋白质和核酸电泳产品等，不过最为普通实验室熟悉的莫过于蛋白电泳Mini系列和层析仪。只要是提到SDS-PAGE，Bio-Rad绝对是每个实验室首先考虑的品牌，经典就是经典呀。&&& Mini-PROTEAN3电泳系统与Mini Trans-Blot转移系统这一套Mini系列可谓是Bio-Rad最多人熟悉和称道的产品了。自上个世纪50年代Raymond利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛性质来延缓蛋白质的迁移率从而达到分离蛋白的目的以来，经过这么多年来的发展， SDS-PAGE电泳技术已经基本成熟了。而且在操作手段方面也越来越简便，越来越准确。Mini Protein Cell的出现使得Western的制胶和电泳的消耗成本更经济、操作更简便快速――这种简便也间接促进了Western技术的更广泛采用。而Mini-PROTEAN 3 自被生产出来那天就可以说是“踩在巨人的肩膀上”，因为它吸取了Bio-Rad之前第一代和PROTEAN 2微型垂直电泳仪的优点，并在其基础上进行了优化，所以获得了全球实验人员广泛的认同与喜爱。
&&& Mini-PROTEAN 3的优点可以概括为8个字――用途广泛，操作简便。由于Mini-PROTEAN 3可以用于SDS-PAGE变性电泳、非变性电泳、Tric-Tricine电泳、等电聚焦和酶谱分析，以及dsDNA、ssDNA和RNA的电泳分离，因此可以说只要实验室有一套Mini-PROTEAN 3，足以应付常规垂直电泳需要了。Mini-PROTEAN 3体现了Bio-Red不断改进的努力方向――设计人性化，令操作更简便――这在各个细节都可以体现，比如说为了防止制胶过程出错，Mini在玻璃板，夹合器（固定玻璃板的装置）以及电泳槽里等处分别都有注明正反位、夹板高度或正负极；方便的夹子取代了以前需要拧4个螺丝来固定玻璃板的麻烦。由于未交联的聚丙烯酰胺本身是神经毒素，因此每个实验者都希望操作能简单快速，尽可能减少讨厌的意外“事故”――漏胶的发生。Mini-PROTEAN 3巧妙的设计使得配胶快速方便的同时更大大减少漏胶的几率。除此之外，Mini的加样容量也是可以多样选择的，包括10-well (30 &l)，15-well (15 &l)，10-well (50 &l)，12-well (20 &l)，9-well (30 &l)，IPG comb (7 cm IPG strip)。&&& 电泳结束后就要转膜。同系列的Mini Trans-Blot可以说是Mini-PROTEAN 3的“完美拍档”，它们组合在一起就是做Western印迹实验的最好选择之一了。说它好，当然是有原因的，由于Mini Trans-Blot在转移过程当中的三个关键步骤里设计巧妙，帮助转移顺利进行，提高了转膜效率，因此才会得到如此多的用户的赞赏。第一就是在夹板盒，由于转膜过程中的气泡问题对于实验结果有很大的影响――试想一下，在特异带显色处正好有一个气泡，那么本来可以很漂亮的结果就付之一炬了，甚至可能会造成假阴性结果。Mini Trans-Blot的夹板盒通过两块海绵与封口式设计帮助减少气泡的存在，同时夹板盒多孔的设计也可以在压制过程中使缓冲液均匀的渗出，减少气泡。其次，转膜槽的人性设计。试问一下，在转膜中最怕什么，我想大部分人都会说是正负极弄错，Mini Trans-Blot为了防止这种造成整个实验完全失败的情况出现，在转膜槽的正负极上明确的用大范围的红与黑这两种颜色标志出来了，这样出错的可能性就大大降低了。第三，就是Mini Trans-Blot的冷却装置。Mini Trans-Blot有一个冷却盒，听起来好像很复杂，其实就是一个塑料盒子，但是这个盒子在转膜过程中却可以起重要作用，众所周知，转膜过程中发热不仅会造成气泡的形成，而且很有可能会影响蛋白的正常转移，因此大多数转移是在冰上进行的，但由于空气的隔热现象往往效果不是很明显，利用Mini Trans-Blot，实验人员可以在冷却盒中装入缓冲液将其冰冻起来，转膜时就可以起到冷却的作用。除了以上这些，Mini Trans-Blot还有一次可以转两块膜，低电压过夜转膜以及令人放心的外观设计等方面的优点。Mini-PROTEAN 3加上Mini Trans-Blot一套价格不便宜，要1000多美元呢。现在那个超薄硬质玻璃板也可以单买了，以前可是十套打包的。
&&& Bio-Rad除了这个“镇店之宝”外，还有适合于13.3 x 8.7 cm gels的Criterion系列（Mini系列是8.6 x 6.8 cm），这一系列无论是电泳系统还是转移系统都和Mini相似，但是它可以容纳更多块胶，为蛋白质组分析提供便利。而且有线电极和板电极两种方式供选择。除此之外，还有更大尺寸的the Trans-Blot Cell(16 x20cm，26.5 x28cm)适合特别的需要的实验来选择。
二、电泳世家Hoefer&&& 也许国内的研究人员不那么熟悉Hoefer，但是这个1967就成立的公司在电泳产品领域可谓赫赫有名。多年来一直专注于核酸和蛋白电泳分离技术，使得其产品质量和设计一直处于领先地位，在国外真正属于“顶级”口碑的电泳产品。被GE收购了的Amersham则是大家非常熟悉的品牌（包括独步天下的原法码西亚的蛋白纯化王国），而多年为Amersham代工生产单向电泳产品的正是Hoefer。2003年Hoefer成为著名的哈佛生命科学全资子公司，GE（Amersham）目前继续销售Hoefer的各种产品，而且8月期间还有。老实说GE的这一单向电泳系列一直算是良心价，和美国Hoefer的价格差不多，如果算上这么大的折扣优惠，在美国也买不到这个价格呢！
&&& GE（通用电气公司）有一个很有名的创始人――托马斯?爱迪生，自1896年爱迪生电灯公司和休斯顿电气公司合并成立GE公司以来，GE秉承着“梦想启动未来”的理念逐渐成为了一家多元化的科技、媒体和金融服务公司。2004年4月，GE宣布成功收购Amersham公司所有股票，自此GE Healthcare在生命科学领域的发展生机勃勃，充满朝气，继续拓展Amersham在基因组，蛋白质组，分离纯化，检测试剂等领域打下的王朝。&&& 在蛋白电泳与印迹系统方面，Amersham做得标准全面，有各种的可以放置不同凝胶数目、凝胶面积和厚度的电泳槽可供选择，通常可以分成三类：微型、中型和大型，另外电转印迹系统也有多种选择，比如说如果你想做半干转移，那么就可以选择Hoefer TE70或Hoefer TE77，如果是要做全湿转移，那么Hoefer TE22或TE62是可以考虑的购买对象。所以如果你刚开始接触蛋白电泳和Western印迹，那么可以考虑一下GE公司（Amersham）的产品，因为这些产品不仅购买放心，而且在产品服务方面也相当不错，能够找到众多有用的资料。别具一格Hofer MiniVE&&&& Amersham在电泳仪器方面挑选范围广，而在蛋白垂直电泳系统中一定要提及的就是Hofer MiniVE了，这一设计完整、使用方便的新一代电泳仪器融合了蛋白电泳与Blot两方面装置配备，设计独特，而且在前一段时间GE公司大减价活动中，全套MiniVE只要560美元，只用花一套仪器的钱就可以用作两种用途，这么著名的品牌，真是难得物美价廉啊（如果连同电泳电源还可以再打折哦，晕...）。&&& 说它是好货，那么到底MiniVE是好在哪儿呢？其实在众多电泳仪器倍出的江湖，MiniVE有三招让其独步武林，第一招就是操作简便，节省时间。由于有时蛋白电泳使用频率很高，所以实验人员当然会希望操作简单啦。MiniVE配胶过程就三步：load→ clamp→cast，只需把玻璃板放上去，夹紧，然后灌胶就完事了。漏胶？那是极少发生的事。细微之处见真功，MiniVE的设计有一些过人之处。比如Spacer有T边，大大减少侧边漏胶的几率；而将玻璃装到模块上的时候，两边底部的玻璃/Spacer/玻璃处都有Guide Foot，顶一下“三件套”的上面就可以保证足部完全对齐防止底部漏胶。装玻璃的时候如果传统的“插进模块”就容易导致Spacer和玻璃之间“走位”，MiniVE的模块两个侧边和底部都可以打开，将装好的玻璃平放，合上夹边再拧螺丝就行；底部的封边也很特别，有3档，一个是密封档，可以密封底边后直接倒胶；一个是半开的电泳档，允许电泳液均匀连通胶底部，另一个当然就是完全打开以便装卸玻璃了。所以MiniVE并没有单独的倒胶架子，将底部封条推到密封位置后就可以将模块“挂”在电泳主槽的边上倒胶了，不用担心胶面不平哦。Amersham产品做工精良，值得信赖的。第二招，高品质大容量。MiniVE与一般蛋白电泳相比，有个很大优势，就是其蛋白胶可薄至0.5mm，而且凝胶大小是10×10.5cm(W×H)，比一般的10×8cm要长了30%，这样的好处就是增加了蛋白分辨率，使一些“难舍难分”的蛋白组分“分道扬镳”，达到更好的分离效果。
第三招，Western印迹，MiniVE采用的转移槽是“盒式”的，润湿的转移膜和滤纸、海绵组成“三明治”结构夹在“盒式”的转移模块中，闭合后每个转移模块只用350毫升的缓冲液，放入主槽中；而电泳主槽里只放预冷的去离子水作为降温，就可以直接转膜了。这种转移方法不用整个电泳主槽装满电泳转移缓冲液，可以节约不少缓冲液（1.2―1.7升）呢，而且可以减少不均匀的发热。Amersham除了这种微型的电泳系统，还有Hofer其它系列，比如SE250垂直电泳仪，这种电泳系统配有热交换模块，可以消除smile现象（一种由于热量交换不及时而引起的蛋白带波动现象，生物通注）。再比如凝胶大小为18×16cm的SE600 Ruby，以及为了蛋白质组学研究的需要开发的Ettan DALT six和Ettan DALT twelve，这两种电泳系统分别可以进行6块和12块凝胶的电泳，这可以说是“库斯拉级”的电泳系统啊！
三、国产品牌&&& 国产电泳仪，国内的老牌六一是大家非常熟悉的产品，价格的绝对优势令其历时数十年而屹立不倒。电泳仪这玩意本来技术含量不比芯片扫描仪什么的，只要设计合理好用，电极丝笔直耐用分离效果好，塑料槽晶莹剔透美观易清洗，价格合理就好。国内品牌现在材料都没话说，高透明度聚碳酸脂注塑成型，铸造模具非常精密。关键就是设计，好不好用，分离效果好不好。最近新冒头的后起之秀，北京百晶生物技术有限公司的产品就值得关注--越是新出品的电泳槽，在设计上就越值得期待，无他，只因具体设计上可以参考其他著名品牌优缺点，扬长避短，结合更多使用人多年的心得和期望进行改进--站在巨人的肩膀上自然有高度。
&&& 这个百晶其实是美国海湾基因集团公司在中国设置的以出口为主兼顾国内市场的外向型生产加工基地，专业研发和组装生产“Baygene”品牌电泳及配套仪器，将美国工程师的人性化设计理念和国外制造的高精度模具组合起来，核心进口器件及不同程度的国产化率集成的国产货。包括高、中、低压电泳仪电源；垂直、水平电泳仪；可整支高温消毒的移液器；超薄型磁力搅拌器；手掌式、台式离心机；高精度恒温循环器；常温、低温干式恒温器；显微镜数码图像系统等。其中最为值得称道的就是Baygene BG-verMINI 迷你垂直电泳仪。因为设计更人性化，操作更简便。1．首先，跑蛋白电泳最重要是必须效果好。 BG-verMINI 迷你垂直电泳仪（标配）凝胶尺寸是82×97mm(W×H)，分离长度比一般迷你型凝胶82×73cm长25%。由此增加了蛋白分辨率，分离了粘连的蛋白组分。同时又可以兼作82×73cm迷你型凝胶，达到省时省液、快速方便的效果。兼顾到了多种使用习惯。2：其次，只是效果好就可以吗？在当今越来越讲究效率的今天光是效果好还不够，还得必须操作简单不漏胶。那么让我们来看看 BG-verMINI 迷你垂直电泳仪如何实现简单方便的。它具有独特的灌胶装置，可同时灌1-2块胶。制胶过程只需三步：把带固定垫条的玻璃固定在主槽上，再将主槽放在独特的灌胶装置上，即可完全放心的灌胶。任何人都能在1分钟内操作完成，没有任何漏胶的可能。凝胶制成后卸掉灌胶装置，凝胶板无需二次移动（不用拆下玻璃板），将主槽整个放入壳体中即可电泳。最大限度避免了玻璃板移动过程的失误以及凝胶渗漏等等。在国内外相关产品都需二次移动的情况下，此特点更加彰显突出和有效。3．液体搅拌：槽体底部留有1cm空间，便于电泳或转印时放置磁力棒进行搅拌，以使温度和离子强度均匀，实现电泳或转印的最好效果。若不用此功能时，可放置减液板（电泳配件）填充其空间，以减少缓冲液量。4．充分接触：电极的正极结构为V字形设计，两侧有气泡出孔，电泳时不会有气泡在电极周围存留，保证了电极与缓冲液的充分接触，达到了散热的良好效果。5．缓冲液量自由放置：槽体宽大，充分达到了足量缓冲液带来的极佳散热效果。既避免了用户自制“冰盆”冷却的尴尬， 又避免了凝胶谱带的“笑脸”现象。需要节省缓冲液时，减液板又可以发挥作用啦。上下槽合计最低缓冲液量为400ml。6．多板制胶：需要提前制成大量凝胶板冷藏保存的用户，我们也准备了多板制胶器供选择，每次可制4块凝胶。7．转印电泳：配套的聚碳酸脂模具成型BG-blotMINI迷你转移槽，内置冷却装置―冰盒，其快速吸收了转印过程的热量，克服了无冰盒转印的发热现象。具有限位功能的转移槽，配以颜色明显的转印夹和电极，确保了转印过程的正确定向。8．低廉价格：报价只是原装产品的几分之一，是值得支持的国产品牌。（生物通作者张迪 吴青）
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联系信箱：western blot完整实验需要哪些仪器
主要就是SDS-PAGE电泳仪和转膜仪,摇床,离心机,不需要别的仪器了,试剂药品倒是要很多
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即送15丁当
【讨论】western blot实验都需要哪些仪器？
页码直达：
这个帖子发布于3年零240天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
实验室想建一个western-blot实验平台，想请问整个下来大概需要多少钱？国产的和进口的两个方案？主要仪器包括电泳仪，转膜仪，封口机，摇床，凝胶成像仪，其他耗材。现在有电泳仪，凝胶成像仪，但是时间太长了，想再买新的。最贵的应该就是凝胶成像仪吧？什么品牌的好呢？大概多少钱？各位了解这方面咨询的可以分享下吗？谢谢！！
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western blot 实验需要用到的东西， 如下--一电泳：电泳仪 、制胶板、 电泳槽
。推荐使用Bio-Red公司的，稳定耐用 就是有些贵。国产的有个公司叫天能的，也做这方面的产品。二转膜：如果是使用湿转的话，只要在有电泳仪的基础上再买一套湿转的槽，就ok了。如果想使用干转的话，还需要另外购买半干转仪，我们实验室用半干转，价钱大概是免税15000元左右，也是Bio-Red公司。三漂洗：只需要购买一个脱色摇床就ok。国产其林贝尔TS-1,1500元左右。四显影：如果使用传统的x光片，需要准备一个暗室，还有就是买个红外灯就可以了。如果要用直接扫描显影的话，需要购买一台成像系统，不是凝胶成像，是针对膜上蛋白的成像系统，我们实验室用的是odyssey近红外双色扫描系统，免税价格大概为56000美金，也有国产类似的产品，价格会稍微便宜些。以上就是大概需要用到的东西了 ，希望可以帮助到你，祝实验顺利。
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