基因转染技术简介转染技术的选择对转染结果影响也很；的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率；内吞瞬时性转染的因素有多种，包括转染方法、操作技；的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常；DEAE-右旋用的转染技术：电的磷酸骨架相互作用；糖苷法细胞内吞；被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直；稳定转染；高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过
基因转染技术简介
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，因的质粒DNA送入细胞内， 磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定及应用特点见下表： 的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基 因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。转染方法转染方法 原理 应用 有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率磷酸钙法 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞稳定转染 内吞 瞬时性转染 的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒 DNA的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负DEAE-右旋用的转染技术： 电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被瞬时性转染 糖苷法
被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直稳定转染 高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要电穿孔法 瞬时性转染 膜上形成的小孔导入 求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重所有细胞 新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染稳定转染 为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。病毒介导法 色体中 对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。 逆转录病毒
特定宿主细胞
用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染瞬时转染 化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。应用腺病毒 色体中 特定宿主细胞 酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，稳定转染 目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。 阳离子脂质带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基瞬时性转染
体法 团形成复合物被细胞内吞 所有细胞
具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导Biolistic颗包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，瞬时性转染 尘等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶粒传递法 DNA在胞内逐步释放，表达 基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后稳定转染 即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细显微注射法 用显微操作将DNA直接注入靶细胞核 瞬时性转染 胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基;除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中（neomycin）。 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时，小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选PEI经常做为核心组成成分。 择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），
线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与 BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI温箱置6～24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染液继续培养。 效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。 PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。 2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：
(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24
GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子小时，使其达到50～60%板底面积。 PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下： 成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包供体DNA。 裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。 而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中③室温下放置5～10分钟，使DNA结合在脂质体上。 所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞37℃培养3～5小时。 毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。 (4)再于每孔中加入20üS的DMEM，继续培养14～ 24小时， (二)脂质体介导DNA转染法 (5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10üS的脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体DMEM，2mL/孔，再培养24～48小时。 N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium
Chloride(DOTMA)和Dioleoyl 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。 photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它适用稳定的脂质体转染方法如下： 于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。 最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。 它高5～100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 (3)在每孔中加入1mL、20üS的DMEM，37℃培养用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批48小时。 LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1～5μg和孵法进行。 育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量 的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转做猪成纤维细胞的转染，但细胞转染后死的一塌糊涂，染时间(2～24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染各位高手帮帮忙！ 时间以不超过24小时为宜。 脂质体的用法如下： 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔何一种细胞均可作为受体细胞。 板）： 1、操作步骤[方法一]： 1.
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每在转染日密度为90-95％。细胞铺板在2ml含血清，不含孔中加入2mL含1～2×105个细胞培养液，37℃CO2培抗生素的正常生长的培养基中。 养至40%～60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细2.
对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如胞)。 OPTI-MEM I培养基）稀释4.0ugDNA，轻轻混匀。 (2)转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每3.
使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10ul 1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 释2-50μgLR，终量100μL,轻轻混合A、B液，室温中置2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如钟）。 出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释量)。 的DNA混合。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入4.
混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 1mL不含血清培养液。 2000（第三步）。室温放置20分钟。 (4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃5.
（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2ml无血清配养基。 培养. 6.
直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。 (5)其余处理:如观察,筛选,检测等与其他转染法相同.
在37℃，5％CO2中保温24-48小时。无需去掉复合(6)注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响.
物或更换培养基。 2,快速脂质体转染法操作步骤(方法二): 或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。
将细胞以 5 x 10^5 个/孔接种于 6 孔板中培养 24h,使8.
在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物其达到 50%-60% 板底面积.
或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细 胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后在试管中配制 DNA-脂质体复合物.
将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。a,在 1ml 无血清 DMEM 中稀释 PSV1-neo 质粒 DNA 进行稳定表达需要数天或数周。 或供体 DNA.
b,旋转 1s,再加入脂质体悬液,旋转.
贴壁细胞的稳定转染： c,室温下放置 5-10min,使 DNA 结合在脂质体上.
转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养 基中，次日加入选择性培养基。 弃去细胞中的旧液,用 1ml 无血清 DMEM 洗细胞 1 我建议还是要在转染后4－6小时更换无双抗有血清的次后弃去,向每孔 中直接加入 1mlDNA-脂质体复合培养基。因为无血清的培养基营养成分肯定比不上有血物,37℃培养 3-5 天.
清的培养基。 脂质体转染技术步骤
再于每孔中加入含 20%胎牛血清的 DMEM,继续培养 14-24h.
脂质体转染技术步骤 脂质体转染技术步骤<<隐藏
脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体 DOTMA 和 DOPE
的混合物(1:1)。它适用 于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培吸出 DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含 10%胎牛养细胞中,是目前条件下最方面的转染方法之一. 转染率血清的 DMEM,2ml/ 孔,再培养 24-48h.
高,优于磷酸钙法,比它高 5-100 倍,能把 DNA 和 RNA
转染到各种细胞.
用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定.
用 LR 进行转染时,首先需要优化转染条件,应找出该批
LR 对转染某一特定 细胞适合的用量,作用时间等,对每3,稳定的脂质体转染法:
批 LR 都要做.先要固定一个 DNA 的量和 DNA/LR 接种细胞同前述,细胞长至 50%板底面积可用于转染. 混合物与细胞相互作用的时间,DNA 可从 1-5ug 和孵 DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前.
育时间 6h,开始, 按这两个参数绘出相应 LR 需用量的在每孔中加入 1ml 含 20%胎牛血清的 DMEM,37℃培曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确 定出转养 48h.
染时间.因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 吸出 DMEM,用 G418 选择性培养基稀释细胞,使细胞24h 为宜. 生长一定时间, 筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法 细胞种类:COS-7,BHK,NIH-3T3,Hela 和 Jurkat 等任何进行.
一种细胞均可作为 受体细胞.
1,操作步骤(方法一):
细胞转染技术总述 (1)细胞培养:取 6 孔培养板,向每孔中加入 2ml 含(1-2)
x 10^5 个细胞 的培养基,37℃,18% CO2 培养基 一,细胞转染途径 40%-60%汇合时.
转染大致可分为物理介导,化学介导和生物介导三类途(2)转染液制备:在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染 1 径.电穿孔法,显微 注射和基因枪属于物理介导技术; 化个空细胞所用的 量). 学介导方法很多, 如经典的磷酸钙共沉淀法, 脂质体 转A 液:用不含血清培养基稀释 DNA 使浓度为 1-10ug,终染方法,和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有量 100ul.
较为原始 的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒B 液:用不含血清培养基稀释 LR,使终浓度为 2-50ug,终介导的转染技术.
1, (1) 物理介导
轻轻混合 A 液,B 液,室温中置 10-15min,稍后会出现微电穿孔法:靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细浊现象,但并 不妨碍转染.
(3)转染准备:用 2ml 不含血清培养基漂洗 2 次,再加入 优点:转染效率较高
1ml 不含血清培养 基.
缺点:需要昂贵的仪器(电穿孔仪);对细胞的损伤较大,每(4)转染:把 A/B 复合物缓缓加入培养基中,摇匀,置 37℃次转染需要 更多的细胞和 DNA;每种细胞电转的条件温箱中 6-24h, 吸除无血清转染液,换入正常培养基继续都需要进行多次优化.
(2)显微注射:借助显微注射器直接把 DNA 注入核内,使二,理想的细胞转染方法
之整合入受体细胞基 因组中.
理想细胞转染方法,应该具有转染效率高,细胞毒性小,重优点:转染效率高,可用于瞬时转染和稳定转染
复性好,安全, 简单等优点.病毒介导的转染技术,是目前缺点:导入 DNA 时需要一个细胞一个细胞注射,不适合转染效率最高的方法,同时具有细胞 毒性很低的优势.但大量转染 是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很(3)基因枪:依赖携带了核酸的高速粒子将核酸导入细胞强 的选择性,在一般实验室中很难普及.其它物理和化学内.
介导的转染方法,则各有 其特点.
三,细胞转染分类
2, 化学介导
瞬时转染:是指外源基因进入受体细胞后,存在于游离的(1)磷酸钙共沉淀法: 磷酸钙有利于促进外源 DNA 与靶载体上,不整合到细胞 的染色体上.
细胞表面结合,氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按 一定的比例稳定转染: DNA 整合到宿主细胞的染色体中.
混和,形成极小的磷酸钙-DNA 复合物沉淀黏附在细胞四,报告基因
膜表面,借助 内吞作用进入细胞质.沉淀颗粒的大小和质是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因, 是一个其表量对于转染的成功至关重要. 达产物非常容易被鉴 定的基因.把它的编码序列和基因 优点:能用于任何 DNA 导入哺乳类动物,瞬时转染和稳表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它 目的基因定转染.
相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达缺点:转染效率低:进入细胞的 DNA 只有1%-5%可以进产物来标定目 的基因的表达调控.
入细胞核,其中 只有不到1%的 DNA 可以与细胞 DNA 常用的报告基因系统:半乳糖苷酶报告系统,荧光素酶报整合, 在细胞中进行稳定表达. 重复性不佳: pH 值,钙离告系统,荧光蛋白 报告系统(GFP)等.
子浓度,DNA 浓度,沉淀反应时间,细胞孵育时间乃至各五,转染方法
组分加入顺 序和混合的方式都可能对结果产生影响.
本人用的是 Invitrogen 公司的 Lipofectamine2000 在 (2) 脂质体转染法:
24 孔板转染单层贴壁细 胞.(别的方法可以参考生产商中性脂质体是利用脂质膜包裹 DNA,借助脂质膜将 提供的 protocol)
DNA 导入细胞膜内.带正 电的阳离子脂质体,DNA 并1,转染前 1 天将 0.5～2×105 细胞接种于 24 孔培养板,没有预先包埋在脂质体中,而是带负电 的 DNA 自动 并加入 500ul 不含抗生 素的完全培养基,以保证转染时结合到带正电的脂质体上,形成 DNA-阳离子脂质体复细胞汇合达 90～95%.
合物,从而吸附到带负电 的细胞膜表面,经过内吞被导入2,准备复合物 细胞.
(1) 将 0.8ug DNA 稀释于 50ul 无血清无抗生素的培优点:适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞,可用于养液中轻轻浑匀.
瞬时转染和稳定 转染;转染效率高,比磷酸钙法高 5-100 (2) 将 2ul Lipofectamine2000 稀释于 50ul 无血清无抗倍;能够把DNA和RNA转染到各种 细胞, 转染的稳定生素的培养液中, 轻轻浑匀,室温孵育 5 分.注意:必须在 性好, 可重复性高, 转染时最好不加血清和抗生素. 25 分内进行.
(3) 5 分后将它们混合,并轻轻浑匀,室温孵育 20 分.
缺点: 阳离子脂质体细胞毒性相对较高, 对部分细胞可3,吸去培养板的培养基,用 PBS 或无血清培养基(最好)能会干扰细胞的代谢.
清洗细胞 2 次. (3) 多种阳离子物质介导:
4,将复合物(总体积 100ul)加入培养孔,前后摇动培养板DEAE-葡聚糖介导的转染, 其原理还不清楚, 可能是通使其分布均匀.
过内吞噬作用而使 DNA 转导进入细胞核,此法只适合5,将细胞放入培养箱孵育 4～6h 后,可以更换含血清培暂时转染实验,转染效率与 DEAE-葡聚糖浓度以及 细养液去除复合物(也可 不用).
胞与 DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关6,24～48h 后可以观察转入基因表达情况.
系,可采用较高浓度的 DEAE-葡聚糖(1g/L)作用较短时7,稳定转染:换含血清培养基 24h 后将细胞以 1:10(或更间 (30 分钟-1.5 小时), 也可用较低浓度(250g/L) 的 高比例)传代,1 天后更换筛选培养基筛选.
DEAE-葡聚糖作用较长时间(8 小时).
8,优化:要保证细胞汇合率达 90～95%(比较高);DNA/ 3,生物介导 Lipofectamine2000 比率 1:0.5～1:5,一般细胞 1:2～3.
病毒介导的转染:以病毒作为载体,通过病毒感染的方式 将外源 DNA 导入到 细胞中, 其中以逆转录病毒及腺贴壁细胞的脂质体转染 病毒转染系统最为常用.
一、实验材料 优点:整和效率高, 可使外源基因在宿主细胞中长期表达,1、宿主细胞CHO(贴壁细胞) 适用于难以转染 的原代细胞. 2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000(invitrogen公司) 缺点:存在潜在的安全危险性.
3、6孔细胞培养版
4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)
5、转染级质粒
二、实验步骤 invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24下面的脂质体是老板给的，说明手册上不是以24孔板举孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细的例子。我参照比例改了一下翻译过来，供参考，其中胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以有个问题，就是80μL培养基培养液有点少，感觉没有6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！ 覆盖板底。以后我再补充 1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。LipoTAXI? 脂质体转染贴壁细胞步骤 (我的接种密度是3-4×105/ml.)转染时，细胞要达到I．准备转染的细胞 90-95%的融合。 1． 接种在24孔板0.27-0.67×105指数生长期细胞，在2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 大约80μL培养基中过夜培养。 2000 per well (总体积250 ul)(温育5min) II．准备复合物溶液 3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well(总2． 在eppendof管中加入22.5μL DMEM－SA ，加入体积250 ul) 2.5－7.5μL（2μL）脂质体,混和成转染复合物 4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。 3． 加入1－3μg（1μg）质粒DNA，稳定转染要设定阴5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细性对照。 胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。 4． 温柔摇匀，在室温下放置15－30min 6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养III．加入活化溶液 板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温5-6小时。 5． 吸去培养基，（用无血清培养基洗一到两次） 7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％6． 加入50μL DMEM到转染混和液（总体积80μL），的CO2中48-72h检测转染水平。 然后在振摇同时，将此混和液逐滴加入组织培养基，。 8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：7． 孵育4－6小时，在潮湿的孵箱，37℃，低于5％CO210或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的（倒掉液体） 培养基。 8． 加入80μL DMEM＋S两倍于正常血清浓度，孵育过三、个人经验： 夜。（加入160μLDMEM＋S不需两倍） 我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验9． 用160μL新鲜完全培养基更换培养基。 之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎10． 孵育细胞24－72小时，依赖细胞表型，报告系统，不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是和启动子活性，或者进行稳定转染。（不同时间点观察荧个人经验，与大家分享。 光细胞） 1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要11． 按照1：10的比例分离细胞，孵育过夜。 让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超12． 逐滴加入选择性培养基，在滴加的过程中要不断振过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞摇。并且是合适的浓度。 状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态13． 每4－7天更换培养液，大约一周两次。 都会发生变化了。 14． 在一到两周内稳定的克隆形成，同时阴性对照的细2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做，胞死掉。
细胞太少，容易死的。 脂质体介导DNA转染法
3.无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的脂质体(lipofectin regeant, LR)试剂是阳离子脂质体Propyl]-n,n,n-Trimethylammonium 话，就用它代替PBS洗细胞两遍(我曾比较过OPTI-MEMN-[1,2,3-Dioleyoxy 与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高)。Chloride(DOTMA)和Dioleoyl 注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]，用于把吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果DNA转染入悬浮或贴壁培养的细胞中，是目前最方便的洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞转染方法之一，转染效率高，优于磷酸钙法，能把DNA受影响就更大了，死亡细胞会增多。 和RNA转染到各种细胞。 4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。无血清用LR进行转染时，首先需优化转染条件，找出该批LR培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的，这里有血的对转染某一特定细胞适合的用量及作用时间等，对每批教训！ LR都要做到：第一，固定一个DNA的量和DNA/LR混5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1～5μg和孵育要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒，我做的结果都不好。 时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的6.48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高。 曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染 时间(2-24h)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以三亿文库包含各类专业文献、各类资格考试、高等教育、文学作品欣赏、行业资料、生活休闲娱乐、专业论文、转染步骤95等内容。　
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南京慧基生物技术有限公司
GenEscort TM Ⅰ 使用说明书
一．产品介绍
GenEscort TM I 是针对一些常用贴壁细胞设计的经济型产品，该试剂由一种不可降解的分枝状PEI 衍生物与其它组分复合而成。对绝大多数贴壁细胞系具有较高的转染效率，特别适用于各种常规细胞如 293，CHO，COS，A549，LLC，B16F10等细胞的转染。可进行寡核苷酸和siRNA 运送。也能用于体内的动物实验。
GenEscort TM I 与传统的脂质体相比无论在转染效果和实验操作上都有明显的优势，主要表现为：
经济实惠，适用于大多数常用的贴壁细胞系。
转染效率高，细胞毒性低。
使用较少的DNA 量即可获得高的转染效率。
培养基可含或不含血清，可以用PBS 或不含血清的培养基稀释DNA 进行转染，转染过程中不需换液。
转染方法操作简单，转染过程快速。
转染的重复性好，可进行寡核苷酸和siRNA 运送。
需要较少的转染条件优化
二．运输与储存
运输：常温
储存：2－8℃
一年； －15℃ 至―20℃
三．转染前的准备与注意事项
1．细胞接种
为了取得较高的转染效率，推荐使用在50代以内的细胞进行转染实验。要求在转染前24小时对细胞再次传代，在培养基中加入抗生素对转染效果没有影响。转染时细胞密度一般应为60-80%，但这因细胞株的不同而变化，对最常用的细胞株建议细胞密度为70-90%。以24孔板的转染为例，最理想条件是在转染前24小时，每孔接种(500 ul )0.5－2×105个细胞。在大多数情况下，如果在细胞贴壁后(接种几小时后)即进行转染，也可以得到相近的结果。表1列举了不同细胞培养装置的推荐细胞数量。
2．DNA 的质量
为了取得较高的转染效率，推荐使用高纯度的质粒。仅仅根据DNA 电泳条带的情况估计DNA 的量和纯度是不够准确的。建议对提取的质粒DNA 的量和纯度进行检测，DNA 含量 (μg/mL)=50 × (260 nm的读数) × 稀释倍数，通过检测质粒DNA 在260nm 和280nm 的OD 值的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度，OD260/OD280值应该≥1.8。转染时不同品质的DNA 用量不同，以24孔板转染为例，使用酚氯仿沉淀法提取的质粒DNA 一般每孔需要加入≥2μg 质粒DNA ，而使用Qiagen 分离柱或类似方法提取的质粒DNA 一般每孔需要
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