复合性免疫缺陷陷病毒定量测定7.70e 4

人类免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒产品说明书
人类免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒使用说明书Operation Introduction for Quantitative Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) PCR Fluorogence Diagnostic Kit前言:本试剂盒利用一对人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的特异性引物、一个特异性荧光探针,采用逆转录酶、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分,并应用RT-PCR技术实现对HIV-1 RNA gag基因区域的扩增。选取的靶区域是gag基因区域中部的一段保守区,长度102bp。gag基因位于HIV-1基因组的5’端约790—2292nt处,编码核衣壳蛋白等结构蛋白。试剂盒同时利用荧光探针(Taqman探针和杂交双探针)检测技术,该探针能与引物扩增区域中间的一段模板发生特异性结合,随着PCR过程的进行,荧光信号发生相应的变化,使用在线监测的荧光PCR检测仪,即可同时实现对靶核苷酸序列的扩增及自动检测。本试剂盒还应用了竞争性内标技术,该内标与靶序列共用一对引物,而只在探针结合部位与靶序列有所不同。这种在提取、逆转录以及PCR扩增效率方面均与待检测样本核酸片段相同的竞争性内标的加入,即可实现对待检测样本RNA的提取和逆转录等过程的全程监控,还可以监控PCR反应的进程,对样本中影响PCR反应体系的各种因素进行修正,从而实现对血浆样本中HIV-1 RNA的定量检测。本试剂盒还对引物和探针进行了优化,使得对HIV-1 B,B’,C,E等中国主要流行亚型有相似的扩增效率。本品用于人血浆样本中的HIV-1 RNA的定量测定,适用于HIV感染的辅助诊断,抗HIV-1药物治疗的效果的检测。抗病毒药物的疗效评价主要直接依赖两个指标:血浆中HIV RNA滴度和CD4+细胞数。在抗病毒药物治疗的跟踪中,本试剂盒可定量测定血浆中HIV RNA滴度,动态地反映治疗中HIV RNA滴度的变化,为疗效评价提供指标。当前对HIV/AIDS的诊断主要依靠实验室检测,即HIV抗体检测。抗体检测很大程度上降低了HIV经血传播的危险性,但由于窗口期的存在,仍然不能完全避免。P24抗原检测可将“窗口期”缩短5-6天,但其在外周血中的存在时间非常短。而核酸检测方法可将“窗口期”缩短10-15天,更进一步降低了HIV经血传播的危险性。HIV核酸检测的对象还包括HIV阳性母体所生的婴儿、阳性患者的性伴侣、静脉吸毒者和可疑的血清反应者。试剂盒原理RT-PCR本试剂盒利用一对人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的特异性引物,采用逆转录酶、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分,应用RT-PCR首先对HIV-1 RNA上的靶序列实现逆转录生成 cDNA,然后对cDNA进行PCR扩增。FQ-PCR采用FQ-PCR对前期RT-PCR产物进行扩增。FQ-PCR采用荧光探针(Taqman探针或杂交双探针)检测技术,除常规的一对引物以外,PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5'端标记一个荧光基团,3'标记另一个荧光基团。此时5'端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团,因此正常情况下检测不到该探针5'端荧光基团发出的荧光信号。但当溶液中有模板时,模板变性后低温退火时,引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换;Taq酶的5'—3’外切酶活性将探针5'端连接的荧光基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光,切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。使用在线监测的荧光PCR检测仪监测PCR过程中的荧光信号,即可同时实现对靶核苷酸序列的扩增及自动检测。扩增靶序列选取的靶区域是HIV gag基因区域中部的一段保守区,长度102bp。gag基因位于HIV-1基因组的5’端约790—2292nt处,编码核衣壳蛋白等结构蛋白。本试剂盒还对引物和探针进行了优化,使得对HIV-1 B,B’,C,E等中国主要流行亚型有相似的扩增效率。竞争性内标本试剂盒包含有一个竞争性内标,该体外合成的内标与靶序列共用一对引物,而只在探针结合部位与靶序列有所不同。这种在提取、逆转录以及PCR扩增效率方面均与待检测样本核酸片段相同的竞争性内标的加入,即可实现对待检测样本RNA的提取和逆转录等过程的全程监控,还可以监控PCR反应的进程,对样本中影响PCR反应体系的各种因素进行修正,从而实现对血浆样本中HIV-1 RNA的定量测定。防污染扩增本试剂盒采用尿嘧啶糖基酶(UNG)—dUTP系统对临床样本中的靶序列实现选择性扩增,从而达到对扩增产物的预防污染。UNG可识别并裂解掺入U的DNA链,但对含T的DNA却不能起作用。扩增体系中用dUTP代替dTTP后,造成扩增产物均为含U的DNA链,而自然界的DNA均为含T的。因此体系中UNG在扩增之前选择性地裂解含U的扩增产物,使其无法随后被体系扩增,而自然存在的靶DNA仍然正常进行扩增。试剂盒规格:24tests/盒试剂盒组成*)校准品具体拷贝数请参照校准品包装盒内给定值试剂盒储存条件及有效期裂解液应为红色液体,置4℃保存;RT-PCR酶应为白色圆形颗粒,在室温条件下置于干燥器内保存;使用前请注意观察是否发生潮解:颜色变为部分或全部透明,形状变小或变为不规则,或完全蒸发,一旦潮解应弃用;Taq酶和UNG均应为无色透明液体,置–20℃保存;其他试剂均应目测为无色透明液体,置–20℃保存,不宜反复冻融。使用前应在室温下完全融化,并充分振荡混匀后稍事离心;所有试剂避光保存;所有试剂有效期为一年(请于有效期内使用)。自备物品自备试剂(分析纯)自备仪器PCR前准备区:小型离心机移液器(1-20ul,20-200ul,100-1000ul)一次性耗材(吸头、离心管、手套、帽子等)专用工作服、工作鞋、办公用品样本处理区:高速冷冻离心机PCR扩增仪移液器(1-20ul,20-200ul,100-1000ul)一次性耗材(吸头、离心管、手套、帽子等)专用工作服、工作鞋、办公用品检测区:小型离心机移液器(1-20ul,20-200ul,100-1000ul)荧光PCR检测仪一次性耗材(吸头、离心管、手套、帽子等)专用工作服、工作鞋、办公用品建议使用离心管和吸头一览表样本采集、存放及运输本试剂盒仅适用于血浆样本。采集的全血用EDTA抗凝,?嗡兀℉eparin)对PCR抑制,不能使用。1.样本采集:用无菌注射针头采2ml静脉血于含有抗凝剂的无菌离心管中,室温放置不应超过4hr,室温1600g离心20min,分离血浆转入无菌Eppendorf管中备用。2.存放:分离后的血浆标本在2℃—8℃条件下保存应不超过5天;放置于-70℃条件下可长期保存,但应避免反复冻融(最多冻融3次)。3.运输:血浆标本应在2℃—8℃或冷冻条件下进行运输。适用仪器1.PE Gene Amp 7700荧光PCR检测仪2.Bio-Rad iCycler荧光PCR检测仪3.Roche LightCycler荧光PCR检测仪4.其他单通道荧光PCR检测仪可以不使用内标实现对HIV-1 RNA的检测。使用方法(使用前请仔细阅读本说明书)1.样本处理(样本处理区)所有试剂、样本使用前置室温解冻。1.1.使用裂解液的样本处理操作流程1.1.1.配制裂解液的工作液首先计算所需裂解液的份数n(n=样本数+1管强阳性对照+1管临界阳性对照+1管阴性对照),按(n+1)×150ul的量取出裂解液加入适当体积反应管中,在其中按(n+1)×2ul的量加入内标,颠倒混匀10-15次,即成裂解液的工作液。该工作液当天用完,否则应盖严管盖密封后丢弃。1.1.2.取n个0.5ml的灭菌离心管,作好标记。1.1.3.在上述每一个管中加入150ul裂解液的工作液,然后加入待测样本和阴性对照50ul,2个阳性对照品管中各先分别加入阳性对照25ul,然后加入阴性对照25ul(切不可将二者混合后加入),用吸头反复吸打混匀(一份样本换用一个吸头);再加入50ul氯仿,混匀器上振荡混匀5sec或颠倒混匀15次(不宜过于强烈,以免产生乳化层)。1.1.4.离心(13000rpm,15min)。1.1.5.取与步骤1.1.2.中相同数量的0.5ml灭菌离心管,各加入100ul异丙醇和2ul RNasin,作好标记。吸取步骤1.1.4.各管中的上层液相转移至相应的管中(注意不要吸出中间层,该层富含DNA和蛋白质),颠倒混匀。1.1.6.离心(13000rpm,15min,注意固定离心管方向)。轻轻吸出上清;加入300ul 75%乙醇,颠倒洗涤。1.1.7.离心(13000rpm,10min,注意固定离心管方向)。轻轻吸出上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体。1.1.8.离心(2000rpm,5sec,注意固定离心管方向),将管底部少量液体用微量加样器吸干(一份样本换用一个吸头,注意吸头不要碰到有沉淀一面),室温干燥5min(不宜过于干燥,以免RNA不溶)。1.1.9.于干燥后的沉淀中加入8ul DEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,离心5sec,冰上保存备用(注意:此时的RNA最易受RNase降解,?朐?小时内进行逆转录)。1.2.使用Roche公司的样本处理试剂(High Pure Viral RNA Kit)操作流程:1.2.1.提取试剂准备:将40ml无水乙醇加入到Wash buffer中;将20ml无水乙醇加入到Inhibitor removal buffer中制成Inhibitor removal buffer工作液;用400 ul Elution buffer溶解Poly(A) carrier RNA后,分别向2瓶Binding buffer中各加入200ul,配制成Binding buffer工作液(此溶液在15—25℃条件下可保存3个月)。1.2.2.取n个1.5ml体积的灭菌离心管(n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照),作好标记。1.2.3.按照(n+1)×400ul的量取出Binding buffer工作液加入适当体积反应管中,在其中按(n+1)×2ul的量加入内标,颠倒混匀10-15次,即成含内标工作液。该工作液当天用完,否则应盖严管盖密封后丢弃。1.2.4.在上述各管中加入400ul Binding buffer,然后分别加入待检样本、对照品各200ul,振荡混匀,室温放置10min后转入套有集液管的提取柱,于8,000g离心15sec。1.2.5.将装有滤出液的集液管丢弃,换上新管,向提取柱中各加入500 Inhibitor removal buffer工作液,于8,000g离心1min。1.2.6.将装有滤出液的集液管丢弃,换上新管,向提取柱中加入450ul Wash buffer工作液,于8,000g离心1min。1.2.7.将装有滤出液的集液管丢弃,换上新管,再向提取柱中加入450ul Wash buffer工作液,先于8,000g离心1min后再于13,000rpm离心10sec。1.2.8.将装有滤出液的集液管丢弃,换上1.5ml离心管,室温放置3分钟,向提取柱中加入50ul Elution buffer,于8,000g离心1min收集滤出液备用。1.2.9.上述提取的病毒核酸应在2小时内用于PCR扩增,或在-70℃下可以保存一个月。2.RT-PCR反应2.1.RT-PCR反应液配制(PCR前准备区)从试剂盒中取出RT-PCR酶和RT-PCR反应液,RT-PCR反应液室温下融化并混匀后稍事离心。设所需要反应管数为n(n=样本数+1管强阳性对照+1管临界阳性对照+1管阴性对照),取出n/2管RT-PCR酶(剩余的RT-PCR酶仍要放回干燥器内室温密封保存,防止潮解),向每个RT-PCR酶管中加入34ul RT-PCR反应液,混合均匀后转移至样本区。2.2.加样(样本处理区)向样本处理步骤1.9.制备的RNA溶液中各加入17ul步骤2.1.配制的RT-PCR反应液,盖紧管盖,转移至检测区,置于PCR仪上。2.3.RT-PCR扩增(检测区)此步骤不需收集荧光信号,用普通的PCR扩增仪即可,如PE-9600或其他相当的扩增仪。扩增条件设置如下:42℃:30min??4℃:5min95℃:5sec,60℃:30sec,8个循环。扩增后的样品管室温下冷却。3.PCR扩增3.1.准备试剂(PCR前准备区)从试剂盒中取出各管试剂,在室温下融化后稍事离心。设所需要反应管数为n,(n=样本数+1管强阳性对照+1管临界阳性对照+1管阴性对照+4管校准品),每个测试反应体系配制如下表:计算好各试剂的使用量,加入一适当体积试管中,充分混合均匀,向设定的n个PCR反应管中分别加入46ul(25ul体系加入23ul),转移至检测区。3.2.加样(检测区)在所设定的反应管中分别加入步骤2.3.中的RT-PCR反应产物4ul(25ul体系加入2ul),校准品各4ul(25ul体系加入2ul),盖紧PCR反应管管盖(使用Roche毛细管时,应将毛细管连同Roche专用金属管套放在离心机中,于4000rpm离心5sec),置于荧光PCR仪上,记录样本摆放顺序。3.3.PCR扩增(检测区)3.3.1.循环条件设置使用PE Gene Amp 7700荧光PCR检测仪时循环程序设置如下:37℃:3min;94℃:1min;95℃:5sec,60℃:30sec,40个循环。反应体系为50ul。校准品的拷贝数可在扩增之前设定也可在结果分析时设定。使用Bio-Rad iCycler荧光PCR检测仪时循环程序设置如下:37℃:3min??4℃:1min;95℃:5sec,60℃:30sec,42个循环。反应体系为50ul。在扩增开始前样本设定时,将校准品设为“STND”并输入拷贝数,待检样本和对照品设定为“UNKN”。使用Roche LightCycler荧光PCR检测仪时循环程序设置如下:37℃:3min93℃:2sec,55℃:20sec,72℃:20sec,40个循环。在扩增开始前样本设定时,将校准品设为“STND”并输入拷贝数,待检样本和对照品设定为“UNKN”。3.3.2.仪器检测通道选择使用PE Gene Amp 7700/Bio-Rad iCycler荧光PCR检测仪时:外标选择Fam;内标选择Hex。荧光信号收集设在60℃。使用Roche LightCycler荧光PCR检测仪时:外标选择F1通道;内标选择F2通道。在55℃时荧光信号收集方式设为“SINGLE”。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。结果分析条件设定1.使用PE Gene Amp 7700荧光PCR检测仪进行结果分析时,基线(baseline)取3—10或3—15个循环的荧光信号,阈值(threshold)可根据仪器噪音情况调整。外标阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,且拷贝数为0.0 copies/ml为准;内标阈值设定原则以正常阴性对照品内标Ct值≤32.0为准。2.使用Bio-Rad iCycler进行结果分析时,基线取为2—10或2—15个循环的荧光信号,阈值可根据仪器噪音情况调整。外标阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,且拷贝数为0.0 copies/ml为准;内标阈值设定原则以正常阴性对照品内标Ct值≤32.0为准。3.使用Roche LightCycler进行结果分析时,用荧光记数值F1读取外标结果,外标阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,且拷贝数为0.0 copies/ml为准,通常在0.001—0.1内调整,或可根据仪器噪音情况进行调整;用荧光记数值F2读取内标结果,阈值设定原则以正常阴性对照品内标Ct值≤32.0为准。质控标准1.将校准品1—4的外标拷贝浓度输入,仪器将自动以校准品拷贝浓度的对数值为横坐标,以其实际测得的外标Ct值为纵坐标给出标准曲线,标准曲线的拟和度应小于等于-0.980,否则视为定量结果无效。2.阴性对照HIV RNA应为0.0 copies/ml;强阳性对照HIV RNA应为1.0×104—9.9×105copies/ml;临界阳性对照HIV RNA为5.0×102—1.0×104copies/ml,以上样本的内标Ct值均应≤32.0,否则实验视为无效。所有实验从样本处理开始重作。结果判断1.检测样本中HIV RNA≥5.0×102copies/ml,?夷诒闏t值≤32.0时,报告相应的拷贝数。2.检测样本中内标Ct值>32.0的样本,应用正常人血浆按10倍梯度稀释后重新测定,直到内标Ct值≤32.0为止,测定结果应以稀释倍数进行校正;3.检测样本中HIV RNA≥1.0×106copies/ml,且内标Ct值≤32.0时,可按实际测得值报告相应的拷贝数,亦可将该样本用正常人血浆按稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定。4.检测样本中HIV RNA<5.0×102copies/ml,且内标Ct值≤32.0时,表明病毒载量较低,该拷贝数仅供参考,应一律报告为小于5.0×102copies/ml,并应对此份标本谨慎跟踪;5.检测样本中HIV RNA为0.0 copies/ml,且内标Ct值≤32.0时,报告为小于最低检出极限。试剂盒性能检测限度经采用CLB(荷兰血液传输中心实验室)HIV RNA monitor(Cat.No. S2039,标定HIV RNA载量为25,000 copies/ml)测试,灵敏度达到5.0×102 copies/ml。特异性该试剂盒对HAV、HBV、HCV、HDV、TTV、CT、NG、HSV、HCMV、HPV、UU、TB标本以及献血员血浆标本均无非特异性扩增。定量检测线性范围本品的定量检测线性范围为5.0×102—1.0×106copies/ml在102—106copies/ml范围内,本品与COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test(Roche公司产品)检测的相关系数r=0.80,相关方程为log(PGcopies/ml)=1.01×log(ROCHEcopies/ml)-0.39;与Nucli Sens HIV-1 QT assay(Organon公司产品,简称为NASBA方法)检测的相关系数r=0.92,相关方程为log(PGcopies/ml)=1.19×log(NASBAcopies/ml)-1.32。使用注意事项1.有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。2.实验室应按试剂配制区、样本处理区、扩增检测区分隔使用。工作流程:各区物品均为专用,不得交叉使用,避免污染。操作过程应工作服、帽、鞋、手套等穿戴齐全,避免各种试剂或样品与皮肤接触。一旦发生液体的泄漏,应立即用大量的水进行冲洗,如果与皮肤伤口发生接触,应及时通知当地卫生防疫部门。3.本试剂盒不适用于肝素抗凝的血浆,因为肝素是公认的对PCR反应有抑制作用的物质。4.反应液分装时应尽量避免产生气泡,并注意防止泄漏,以免荧光物质污染仪器。5.实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内,并与其他废弃物品一同在指定的地点以指定的方式进行焚烧或毁弃。6.实验?崾?笥α⒓辞褰喙ぷ魈ǎ?ぷ魈?案髦质笛橛闷酚Χㄆ谟?%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。7.所有的待检测样本均应视为传染性物质并严格按实验室生物安全要求进行操作和处理。8.试剂盒的阴性对照是采用合格试剂确认抗HIV-1/2,抗HCV,HBsAg均为阴性结果的人源血浆制备而成,强阳性对照和临界阳性对照以及内标等均为非感染性体外转录RNA,但使用过程中均应视为潜在的传染源并严格按实验室生物安全要求进行操作。9.由于HIV为RNA病毒,操作过程中应特别注意防止RNase对RNA的降解作用,所有使用的器皿、加样器等均为专用,离心管、吸头一次性耗材等在实验前应全部高压灭菌。10.样本中血脂、胆红素、血红蛋白对本品无显著干扰。深圳市匹基生物工程股份有限公司地址:深圳市深南大道市高新技术工业村R3-B,6F邮编:518057电话:(8免费电话:传真:(6网址:
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免疫缺陷百科知识
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Oct 23, 2012个回答
你好,你这三项检查是查的艾滋和梅毒,可以肯定的是你没有梅毒。如果你HIV的结果是在正常范围的话(我不知道你查的那个医院的正常范围),说明你没有艾滋。性病,传统观念是指通过性交行为传染的疾病,主要病变发生在生殖器部位。我国目前重点防.........
Dec 16, 2014个回答
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Dec 12, 2014个回答
就是说没有感染。
Mar 1, 2014个回答
这个应该是有影响的
点好评, 祝你天天开心、事事顺利。
Dec 16, 2014个回答
你好,表示没有感染,是正常的。
Dec 22, 2014个回答
病情分析:
你好,你现在检查的结果RPR1:2这个可能是假阳性的
指导意见:
只有TPPT.RPR的都是阳性才能确定是梅毒感染,你可以3周复检。
Mar 5, 2015个回答
人体免疫缺陷病毒抗体阴性相关经验
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