得每通胰酶肠溶胶囊处理细胞时没用pbs洗，也没加裂解液能放多久

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-07-22 11:11 标签： 胰酶消化细胞的原理
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巨噬细胞RAW264.7细胞提取蛋白浓度低，该怎么办
最近在从巨噬细胞中提取蛋白，提出蛋白后用BCA测定蛋白浓度，但是只有0.8mg/ml左右，不知道该怎么办，求各位大神指点一下。
具体操作步骤如下：
先是铺板后给药，提蛋白前细胞已经特别密集的分布到六孔板中有些甚至叠起来。
1.细胞用培养基吹打下来，收集细胞悬液1000rpm离心5分钟（因为要提总蛋白包括膜蛋白没就没用胰酶消化）。
2.用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.每孔加入150μl RIPA裂解液（临用前加入PMSF，终浓度为1mM）混匀，转入96孔板中4℃震荡30分钟。
4.14000rpm离心10分钟。将上清快速吸入预冷的干净EP管中（注意不要吸到沉淀）。
5.BCA测定蛋白浓度。
我这样提取出来的浓度最大也就0.8mg/ml,后来每孔加100ul的 RIPA裂解液甚至两个孔加100ul的RIPA裂解液浓度也一直上不来。不知道是什么原因，都快要愁死了。。。RIPA裂解液我是用的碧云天的 P0013B，强的裂解液，含有20mM Tris (pH7.5)， 150mM NaCl， 1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate， β-
glycerophosphate， EDTA， Na3VO4， leupeptin等多种抑制剂。说是有蛋白酶抑制剂，磷酸酯酶抑制剂。
求各位大神指点一下。。。。。
1。收集细胞的时候离心速度大点10000rpm左右吧——转速这么高，细胞不会破裂么？
2.裂解液太多了30-50ｕl ——我们是放到离心管里离心，吸干PBS后用RIPA重悬，再转移到96孔板震荡，这样的话液体量少，转来转去不就没了么？每次上样20-30ul，这样提一次也就够一两次WB，太费体力，时间了吧。
3.请问一下你们是如何提高蛋白浓度的？:hand:
我的问题已经解决，但跟你说的有些差别，还是很感谢你
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扫描下载送金币细胞刮刮不好，胰酶消化怎么样 - 实验交流 - 生物秀
标题: 细胞刮刮不好，胰酶消化怎么样
摘要: [细胞刮刮不好，胰酶消化怎么样] 我刮细胞时由于细胞很少，刮下的细胞往往成团，离心离下来，好几次什么都看不到，费了很多事。而胰酶比较彻底，但是western时蛋白是否受到影响。谁有这方面的参考资料？空口无凭的。 关键词:[酶消化 样细胞]……
我刮细胞时由于细胞很少，刮下的细胞往往成团，离心离下来，好几次什么都看不到，费了很多事。而胰酶比较彻底，但是western时蛋白是否受到影响。谁有这方面的参考资料？空口无凭的。
胰蛋白酶是从动物胰脏分离的一种水解酶，其功能主要使细胞间的蛋白质水解、细胞分散。而通常我们消化常用的EDTA是一种化学螯合剂，主要作用在于能螯合钙、镁离子，使细胞分离，对细胞毒性小。至于western时，所用的消化液是否影响所检测的蛋白，这个通常来讲对膜蛋白可能影响较大，但具体到某种蛋白，需要有确切的文献依据。我们做western收获细胞通常是这样：处理后的细胞用冷PBS漂洗两遍，尽量吸干多余的PBS，直接向细胞表面加上裂解液（我们通常用含蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的RIPA裂解液），冰上放置20 min，其间晃动几次，使裂解均匀。然后将已裂解的细胞吹下，4度离心除去细胞碎片即可。后续该测浓度测浓度，或直接加loading buffer煮样品就行了。多多交流！
问题是细胞比较少，我也尝试了这个方法，每60mm皿（细胞没有满，30%-50%吧）加20ul裂解液，刮时根本盖不住细胞，但是随着刮子的移动，可以刮下来。最好移动到1.5ml ep管，离心后却能获得50ul左右的上清，PBS已经很净了，不知你们如何？就是担心蛋白浓度太低了，以前的样品都浪费了，好像降解也比较严重，以前很容易出结果，现在也不出了。我加了reche的cocktail和PMSF。所以样品室温放置时间不能太长。
我们一般每60mm皿加200 ul裂解液，吹下细胞并离心后会损失一些，但剩下的也够做几次，而且也测过总蛋白浓度，通常能达到 ug/ml。不明白细胞为什么只让长至30%-50%，是不是有什么特殊需要。也做过没加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的，按此操作，感觉蛋白降解并不明显。可能各目的蛋白差异吧。多多交流！
楼上是什么裂解液自己配置的还是买的啊？裂解后细胞沉淀多吗？我自己配的裂解液裂解后很多沉淀，买的没有沉淀，你的怎么样啊，我的看似好多呢。
我们用的是普利来的RIPA裂解液，配方为：50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS。裂解后应该算是有些沉淀吧，其实是细胞碎片，需要在4度，12000g离心除去。多多交流！
还有一个问题是，胰酶消化细胞可能导致细胞中信号通路(Signaling Pathway)发生改变，导致蛋白状态的改变，譬如磷酸化，最好还是细胞刮吧
只用EDTA，我的做法是用EDTA（具体浓度参考胰酶配方），1.5~2ml/10cm dish，作用几分钟后就可以吹下来转移到EP管中，如果细胞少，剩下一些还可以用细胞刮收集一下。
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电话：021-细胞消化成团怎么回事?细胞还没用胰酶消化，用PBS洗时，就有大量的细胞脱落下来，是怎么回事？_百度知道
细胞消化成团怎么回事?细胞还没用胰酶消化，用PBS洗时，就有大量的细胞脱落下来，是怎么回事？
提问者采纳
导致培养基的成分，染色鉴定死活)仍旧是某F的浅见- -，因为在培养过程中，PH值发生变化：营养成分不足+代谢产物堆积导致贴壁细胞脱落死亡，已经有部分死亡的细胞脱落下来了（LZ君应该是有定时做显微观察细胞消化成团个人认为是和消化酶有关，消化酶是否保存不当（主要为温度）并且时间过长失去了消化活性（可以做酶活测定），在允许范围（防止消化过度损伤细胞）内适当加大酶液量，因此即便你好没有进行传代前的消化作用，培养基积累了大量的细胞代谢产物。以上是某f发表的一些浅见解，细胞汇合80%（理想）就应该进行传代，继续培养下去是有害的。关于第二个有大量细胞脱落，我想是没有做好及时的细胞传代，或者酶的浓度配的不合适
提问者评价
非常感谢解答！谢谢
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求交流：细胞裂解液 或胰蛋白酶液中加EDTA的作用？
查的资料 说细胞裂解液中加入EDTA 螯合金属离子，可使金属蛋白酶失活，抑制蛋白的降解。
但消化细胞时，常在胰蛋白酶中加EDTA,&&可加速细胞消化。但胰蛋白酶也是钙离子金属蛋白酶，加入EDTA为什么不会影响？
另外百度对胰蛋白酶的介绍中，提到“。。。Ca2+对酶活性有稳定作用；...& 但下文又提到“因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性。。。，”。这不前后矛盾吗？
网上说Ca2+、Mg2+抑制胰蛋白酶。但是胰蛋白酶也是钙离子蛋白酶，钙离子在酶分子内部，是其活性中心。 为什么游离的钙离子会抑制它的活性呢？& &EDTA可以螯合金属离子，不会对胰蛋白分子内的钙离子产生作用吗？&&或者可能，EDTA无法螯合酶分子内部的钙离子。 但是也有介绍说其他的金属蛋白酶，其分子内的钙离子也可以被EDTA结合的。
还不是很清楚其中的机制..............
那做co-IP或其他实验时 细胞裂解液中加EDTA是什么作用呢？
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