二聚体单克隆抗结合抗原结合价的结合位点有多少

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lingliah2cgngkj.71.net优秀研究生学位论文题录展示SARS病毒S蛋白特异性单克隆抗体制备和抗原识别位点鉴定专　业: 免疫学关键词: 严重急性呼吸综合症 SARS病毒 刺突蛋白 单克隆抗体 酵母表面呈现 噬菌体随机肽库分类号: R563.8　
R392.11形　态: 共 108 页　约 70,740 个字　约 3.384 M内容阅　读: 内容摘要严重急性呼吸综合症Severeacuterespiratorysyndrome，SARS是一种新型传染性疾病，其病原体为SARS病毒SARS-associatedcoronavirus，SARS-CoV。SARS于2002年年底首先出现在中国广东省，之后沿着国际航线迅速向全球传播，在遍及五大洲的33个国家和地区引起了8,450病例和810人死亡。这次SARS全球爆发严重威胁了世界公共健康和社会经济的稳定。尽管这次爆发在2003年最终得到了控制，后来在台湾、新加坡和中国大陆的实验室由于意外事故释放病毒引起了在这些地区的独立的小规模爆发。2003年年底至2004年年初，中国广东报道了新的感染病例，病人与被SARS病毒感染的动物有过接触，而这次的病毒毒株与期间流行的毒株有明显不同1.这些事件说明SARS在将来随时可能会发生，或者由实验室保存的样品引起，或者由动物宿主体内的SARS样病毒进化而来的毒株引起。因此，研制SARS检测诊断制剂、制备有效和安全的疫苗以预防SARS的流行和为生物防御做准备是一项目前十分紧迫的任务。临床研究表明，康复期SARS患者的血清抗体对治疗危重的SARS患者有一定的疗效。因此，研制抗SARS-CoV的抗体对于探索SARS的特异性治疗具有重要意义。虽然在SARS肆虐之际，鼠源性单克隆抗体并不能解燃眉之急，但是从SARS其他相关研究和建立免疫学诊断方法角度来看，单克隆抗体的研制却是必不可缺的。实验室早期诊断是控制疾病的重要手段。以RT-PCR为基础的病毒核酸检测法存在敏感性和特异性的问题，测定病毒特异抗体的血清学方法不能在SARS发病的早期提供诊断结果。建立基于SARS病毒特异单克隆抗体的SARS病毒抗原检测方法，对SARS的早期诊断可能会有重要作用。灭活SARS病毒由于其容易制备的特点可能会成为可用于临床的第一代疫苗，但它的安全性是一个很大的问题。生产疫苗的工人在处理浓缩的活病毒时有被感染的危险，未被完全灭活的病毒可以在接种人群中引起SARS的爆发，而且有些病毒蛋白可能会引起有害的免疫反应或炎症反应，甚至导致SARS样疾病。在SARS病毒的结构蛋白中S蛋白是最大和最复杂的结构蛋白，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，负责病毒与靶细胞的结合、膜融合和进入靶细胞，是诱导中和性抗体的主要抗原。研究表明基于S蛋白的疫苗能够诱导中和抗体和保护性免疫反应，但是也不能排除全长S蛋白产生的抗体可能会增强不同SARS-CoV分离株的感染或介导有害的免疫反应的危险。研究发现，表达FIPV的S蛋白的重组牛痘病毒疫苗会使接种动物在被野生型病毒感染后出现抗体依赖性的疾病增强现象，对HIV-1的研究结果也表明针对HIV-1包膜糖蛋白免疫优势表位的抗体可以增强其它HIV-1分离株的感染。因此，对SARS病毒S蛋白的抗原表位进行全面的分析和精确定位是研究该病的诊断以及疫苗分子设计等的重要基础，而SARS病毒S蛋白特异单抗的获得将为S蛋白免疫学特征研究提供有用工具。抗体识别的蛋白质抗原表位的确定可为免疫化学分析提供十分有用的信息。获得SARS病毒S蛋白的重叠小片段是抗体表位作图中很重要的一个环节。由于S蛋白是由病毒感染的真核细胞表达，原核系统表达的重组蛋白不能解决翻译后修饰加工的问题，用哺乳动物细胞表达重组蛋白可以解决修饰的问题，但表达和纯化过程比较耗时费力。酵母是真核细胞，含有与哺乳动物相似的蛋白折叠机制，比原核细胞更有可能正确的表达和呈现人源蛋白。将S蛋白及其片段融合表达于酵母表面，不仅更接近S蛋白在病毒表面的真实构象，而且可以很方便的用流式细胞仪检测表达和与抗体结合的情况。本研究选择SARS病毒S蛋白为靶抗原，拟用灭活SARS病毒、重组表达S蛋白片段和化学合成肽为免疫原制备S蛋白特异性单克隆抗体。利用生物信息学相关软件预测分析S蛋白后选择了S424-471和S754-801两个48肽化学合成。三种不同形式抗原免疫小鼠后，灭活SARS病毒和S蛋白片段免疫组都产生了很强的抗体反应，但灭活SARS病毒免疫血清与合成肽和S1蛋白片段的ELISA反应为阴性或很弱；合成肽免疫组没有产生有效的抗体反应。基于以上结果，我们选用重组S1蛋白片段免疫小鼠的脾细胞进行融合，筛选到3株S1蛋白特异单克隆抗体，分别命名为mAb1、mAb2和mAb3.为了分析单抗的抗原结合位点，我们采用酵母表面呈现系统重组表达了针对S1蛋白的各种截断片段，用流式细胞仪分析抗体与片段的结合情况，非常快捷地将3株抗体的结合位点分别定位在S337-360mAb1和S390-399区段mAb2/mA3.在确定抗体识别线性表位的基础上，我们用单抗筛选噬菌体随机12肽库，比较分析阳性克隆呈现的12肽氨基酸序列和S蛋白氨基酸序列，结果显示抗体mAb1筛选阳性序列与S蛋白335～346氨基酸序列有关联，抗体mAb3/mAb2筛选阳性序列S蛋白381～399氨基酸序列特征相似。噬菌体肽库分析结果不仅进一步证实了用酵母表面呈现技术对抗体的抗原结合位点的定位，而且提供了与抗体特异性结合有关的重要信息：S蛋白的340W和341E是抗体mAb1特异结合所必需的氨基酸，而390K、391G、392D和395R是抗体mAb2/mAb3特异结合所必需。总之，我们通过杂交瘤技术获得了3株SARS病毒S蛋白特异性单克隆抗体，并且采用酵母表面呈现和噬菌体随机肽库筛选等方法鉴定了抗体的抗原结合位点和特异结合必需氨基酸，为这些抗体在SARS基础研究和检测诊断以及疫苗设计等方面的应用奠定了基础..……全文目录英文缩写一览表英文摘要摘要前言第一部分 SARS-CoV S蛋白特异性单克隆抗体的制备第二部分 SARS-CoV S蛋白特异性单克隆抗体抗原识别位点分析全文结论文献综述一严重急性呼吸综合症发病机理研究文献综述二SARS疫苗研究进展相似论文,67页,R563.8 R392.3,56页,R563.8 R392.3,66页,R563.8 R392.3,66页,R563.8 R392.3,82页,R563.8 R392.3,64页,R563.8 R392.3,70页,R563.8 R392.3,62页,R563.8 R392.3,63页,R563.8 R392.3,51页,R563.8 R392.3,48页,R563.8 R373.1 R392.11,78页,R563.8 R392.3,63页,R563.8 R392.3,57页,R563.8 R392.3,83页,R563.8 R392.3,110页,R563.8 R392.3,60页,R563.8 R392.3,74页,R563.8 R392.3,46页,R563.8 R392.3,68页,R563.8 R392.3中图分类:
> <font color=@3.8 > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 肺疾病其他分类:
> <font color=@2.11 > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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